專利名稱：一種在中藥、保健食品或化妝品中同時檢測七種非法添加減肥類化學成分的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品藥品檢測技術領域，具體涉及一種在中藥、保健食品或化妝品中同時檢測七種非法添加減 肥類化學成分的方法。
背景技術：
隨著人們對健康體重的日益關注，減肥已成為愛美人士的最大話題，各類減肥產(chǎn)品相應而生。一些商家為了使自己的產(chǎn)品具有快速、明顯的減肥效果，在健康產(chǎn)品中非法添加具有減肥效果的化學成分(如西布曲明等)，這樣雖然使產(chǎn)品有了顯著的降低體重的效果，但同時對使用者的身體健康會產(chǎn)生危害甚至可能危及生命。因此亟需建立一種快速、準確的分析方法來檢測中藥、保健食品或化妝品中非法添加的減肥類化學成分。目前，這些成分的測定方法主要為1、薄層色譜法(TLC)，該方法簡便直觀，分離時間短，耐“污染”，但分離效率較低，常常有假“陽性”干擾，主要用于初篩；2、高效液相色譜法(HPLC)，該方法的優(yōu)點是分離性能高，通過比較色譜峰與對照品色譜峰的保留時間及紫外光譜圖，可以基本確證是否含有與對照品一致的化學成分，但對于有些同分異構體來說，鑒別仍較困難，而且高效液相色譜法利用光譜圖定性易受雜質(zhì)干擾；3、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，該方法準確，可靠，但檢測成分必須能氣化，大大限制了采用一種方法檢測多個成分的可能，氣相色譜-質(zhì)譜法只局限于揮發(fā)性成分的檢測；4、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在液相部分經(jīng)色譜柱分離，質(zhì)譜部分與流動相分離并被離子化后，在質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。但是，國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件2006004采用液相色譜-質(zhì)譜法僅對麻黃堿、西布曲明、芬氟拉明三種成分三種成分進行檢測；食藥監(jiān)辦許[2010]114號文件附件2 :減肥類保健食品違法添加藥物的檢測方法中僅對咖啡因、呋塞米、酚酞、西布曲明、芬氟拉明共5種成分進行檢測。也就是說，普通的高效液相-質(zhì)譜檢測目前檢測西布曲明、麻黃堿、咖啡因、芬氟拉明、酚酞、呋塞米六種(兩標準中有兩成分重復，故總的檢驗成分為6個)減肥類化學成分需要使用兩種檢測方法，使得樣品分析時間成倍增加，耗時較長，兩種檢驗方法所需的檢驗時間分別長達50分鐘。另外，2010年I月21日，歐洲藥品管理局(EMA)建議在歐盟范圍內(nèi)暫停西布曲明上市許可，我國國家食品藥品監(jiān)督管理局于2010年10月30日發(fā)布通知停止生產(chǎn)銷售使用西布曲明。西布曲明的使用安全越來越受到關注，而它的雙去甲基衍生物的使用安全性未見相關研究。若患者在不知情的情況下長期、大量服用添加了西布曲明及其衍生物的減肥類保健食品，極易引起嚴重的后果。目前，相關部分查處在減肥類保健食品中違禁添加西布曲明化學成分的情況較多，為逃避監(jiān)管部門的檢測，有的不法廠家添加具有更好活性的N，N-雙去甲基西布曲明。N，N-雙去甲基西布曲明為白色結晶體，是西布曲明的主要活性代謝物品，用量是西布曲明的一半，減肥效果相比西布曲明明顯，目前有山東維宜精細化工有限公司等生產(chǎn)。由于沒進行安全性評價及臨床試驗，國內(nèi)外還未有藥品上市。目前對西布曲明去甲基衍生物檢測的報道較少，楊春華等采用甲基化西布曲明代謝物的方法測定了西布曲明及其代謝物的總量，陳稚等采用HPLC/ESI-MS單級質(zhì)譜法測定減肥保健食品中的N, N-雙去甲基西布曲明。因此，開發(fā)一種能同時檢測西布曲明、麻黃堿、咖啡因、芬氟拉明、酚酞、呋塞米和N, N-雙去甲基西布曲明七種減肥類化學成分的方法顯得意義深遠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有檢測方法的不足，提供一種在中藥、保健食品或化妝品中同時檢測七種非法添加減肥類化學成分的方法，可以準確、快速的檢測出西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N, N-雙去甲基西布曲明，呋塞米7種減肥類化學成分。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術方案為所述檢測中藥、保健食品或化妝品中七種非法添加減肥類化學成分的方法是將樣·品經(jīng)有機溶劑萃取，超高效液相梯度洗脫分離，三重四級桿質(zhì)譜檢測；通過比較樣品峰與對照品峰的保留時間、相對分子質(zhì)量和二級質(zhì)譜碎片信息，確定樣品中是否非違法添加了減肥類化學成分。具體包括如下步驟(I)將樣品用有機溶劑萃取，該步驟為常規(guī)的甲醇萃取步驟；(2)將萃取后的樣品溶液注入液質(zhì)聯(lián)用儀進行超高效液相梯度洗脫分離和質(zhì)譜檢測；該步驟中，所述液質(zhì)聯(lián)用儀為Quattro Premier XE三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；其中，所述七種非法添加減肥類化學成分為西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N，N-雙去甲基西布曲明和呋塞米；步驟(2)中的色譜條件為色譜柱為Agilent EC-C18 ;柱溫為30±5°C ;進樣量為I 10 μ L ;流速為O. 2 O. 4mL · min—1 ;流動相A為甲醇，流動相B為O. 1%的乙酸銨溶液(即質(zhì)量體積濃度為O. lg/100ml的乙酸銨溶液)，以體積百分比計，A+B=100% ;梯度洗脫程序為0 2min，80 90%B ；6 8min，10 20%B ；10 12min，80 90%B ；12min 為一個循環(huán)，12min后開始下一針進樣；步驟(2)中的質(zhì)譜條件為離子源為ESI源；正離子方式(正離子方式是質(zhì)譜儀上的一種模式，指準離子峰質(zhì)荷比是在分子量的基礎上加一個電荷，如芬氟拉明的分子量為231. 3，則其準離子峰質(zhì)荷比為232. 3)檢測西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N, N-雙去甲基西布曲明；負離子方式(負離子方式是質(zhì)譜儀上的一種模式，指準離子峰質(zhì)荷比是在分子量的基礎上減一個電荷，如呋塞米的分子量為330. 1，則其準離子峰質(zhì)荷比為329. I)檢測呋塞米；毛細管電壓為3. 5±0. 5KV ;錐孔電壓為20 35V ;萃取錐孔電壓為3±0· 5V ;聚焦電壓為O. 1±0· OlV ;脫溶劑溫度為300±50°C;鞘氣流速為500 600L .h—1 ；碰撞能量為10 35V。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明的檢測方法同時結合了 HPLC技術的高分離能力與質(zhì)譜較高的靈敏度與較強的定性能力等優(yōu)點，高效液相色譜-質(zhì)譜法技術能夠?qū)z測目標進行準確地定性、定量，可以在一次運行中同時完成篩選和確證。本發(fā)明的核心價值在于液相分離時選用了合適的流動相和合理的洗脫梯度，使需要檢測的減肥類成分在12min內(nèi)得到有效分離，使樣品儀器分析時間縮短了 88%，極大地提高了工作效率。本實驗室近幾年的研究數(shù)據(jù)表明，某些減肥類保健食品中存在添加N，N-雙去甲基西布曲明的現(xiàn)象，添加率達5. 0%，而現(xiàn)行的國家標準中沒有檢驗該種成分，這可能給不法商人帶來可趁之機，給人民群眾的生命安全帶來隱患，本發(fā)明將其列入非法添加檢測成分中，有利于加大對非法添加不法行為的打擊力度。本發(fā)明的測定方法在同一色譜條件下可檢驗7種非法添加化學成分，不僅克服目前檢測西布曲明、麻黃堿、咖啡因、芬氟拉明、酚酞、呋塞米六種減肥類化學成分需要使用兩種檢測方法的缺點，而且增加了 N，N-雙去甲基西布曲明的檢驗，能對檢驗成分準確定性和定量，縮短了檢驗時間，提高了檢驗效率，為打擊健康產(chǎn)品中非法添加減肥類化學成分提供科學依據(jù)。總之，本發(fā)明建立了一種在中藥、保健食品或化妝品中同時檢測七種非法添加減肥類化學成分的方法，既能使7種化學成分達到有效的分離，又能縮短檢驗時間，準確有效地甄別中藥、保健食品或化妝品中的非法添加減肥類化學成分。


·圖I為實施例中對照總離子流圖；圖2為實施例中對照特征離子流圖；圖3為實施例中對照多反應監(jiān)測離子流圖；圖4為實施例中對照碎片離子流圖掃描圖；圖5為實施例中樣品總離子流圖；圖6為實施例中樣品特征離子流圖；圖7為實施例中樣品多反應監(jiān)測離子流圖；圖8為實施例中樣品碎片離子流圖掃描圖。圖中1.麻黃堿；2.咖啡因；3.芬氟拉明；4. N，N-雙去甲基西布曲明；5.西布曲明；6.酚酞；7.呋塞米。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I :I儀器與試藥美國Waters公司的Quattro Premier XE三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀,ESI電離源；美國Waters公司的超高效液相色譜儀，四元泵、脫氣機、自動進樣器、柱溫箱及二極管陣列檢測器。 鹽酸西布曲明、鹽酸芬氟拉明、鹽酸麻黃堿、酚酞對照品(均來源中國食品藥品檢定研究院，批號分別為:100624-200401 ； 100073-200002 ；171241-200506 ;0091_9601);咖啡因?qū)φ掌?來源USP REFEREN CESTANDAR，批號J1D241 );N，N-雙去甲基西布曲明對照品(來源LGC,批號991. 03. 09. 01);呋塞米對照品(來源DR.，批號:00820)。水為超純水，其它試劑均為色譜純。樣品從市場上購買獲得。2方法與結果2. I色譜條件
色譜柱AgilentEC-C18 (150mmX 2. ImmX 2· 7 μ m);柱溫30°C。進樣量5yL;流速0. 3mL · min-1 ;流動相A為甲醇，流動相B為O. 1%的乙酸銨溶液(即質(zhì)量體積濃度為O. lg/100ml的乙酸銨溶液)，以體積百分比計，A+B=100% ;梯度洗脫程序為0min，10%A,90%B ；6min,90%A, 10%B ；10min, 10%A,90%B ；12min, 10%A,90%B ；12min 后開始下一針進樣。2. 2質(zhì)譜條件離子源為ESI源；正離子方式檢測西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N，N-雙去甲基西布曲明；負離子方式檢測呋塞米；毛細管電壓3. 5KV ;錐孔電壓21 35V ;萃取錐孔電壓3V ;聚焦電壓0. IV ;脫溶劑溫度300°C ;鞘氣流速500L ·1ι_1 ;碰撞能量13 35V。2. 3對照品溶液的配制2. 3. I對照品儲備溶液的配制分別取鹽酸西布曲明、鹽酸芬氟拉明、鹽酸麻黃堿、酚酞、咖啡因、N, N-雙去甲基西布曲明對照品約IOmg置50mL容量瓶中，精密稱定，以甲醇 溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。2. 3. 2混合對照品溶液的配制取上述對照品儲備溶液各ImL置于IOOmL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。2. 4樣品處理2.4. I固體試樣取研細，混勻后樣品適量(相當于一次服用量)，于具塞三角瓶中，精密稱定，精密加入50mL甲醇，稱重，超聲處理30分鐘(功率250W，頻率33kHz)，取出，放冷至室溫，用甲醇補重，過濾，作為供試品溶液。2. 4. 2液體試樣取50mL以上液體試樣，混勻，精密吸取10 20mL (相當于一次服用量)，減壓濃縮至近干，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液。2. 5樣品測定取供試品溶液和混合對照品溶液各5 μ L注入液質(zhì)聯(lián)用儀，按照上述測定條件進行測定分析。2. 6質(zhì)譜條件的優(yōu)化分別精密量取7種對照品儲備溶液lmL，置IOOmL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為優(yōu)化質(zhì)譜條件的對照品溶液。選用ESI離子化模式，通過馬達直接進樣，進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。首先，采用一級質(zhì)譜的掃描方式可得到準分子離子峰，在確定準分子離子的基礎上，進行錐孔電壓的優(yōu)化，得到各化學成分的最佳錐孔電壓，再用MS/MS碰撞的方式，選擇兩個以上最佳豐度的子離子作為檢測離子并分別確定其相應的最佳碰撞能量。多反應監(jiān)測(MRM)掃描方式即采用多通道對各化學成分的檢測離子在其最佳錐孔電壓和碰撞能量的條件下分別進行掃描。7種減肥化學藥物的質(zhì)譜條件優(yōu)化結果見表I。表I :
權利要求
1.一種在中藥、保健食品或化妝品中同時檢測七種非法添加減肥類化學成分的方法，包括如下步驟 (1)將樣品用有機溶劑萃??； (2)將萃取后的樣品溶液注入液質(zhì)聯(lián)用儀進行超高效液相梯度洗脫分離和質(zhì)譜檢測； 其中，所述七種非法添加減肥類化學成分為西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N, N-雙去甲基西布曲明和咲塞米； 步驟(2)中的色譜條件為色譜柱為Agilent EC-C18 ;柱溫為30±5°C ;進樣量為I 10 μ L ;流速為O. 2 O. 4mL · mirT1 ;流動相A為甲醇，流動相B為質(zhì)量體積濃度為O.lg/100ml的乙酸銨溶液，以體積百分比計，A+B=100% ;梯度洗脫程序為0 2min，80 90%B ；6 8min, 10 20%B ；10 12min,80 90%B ； 步驟(2)中的質(zhì)譜條件為離子源為ESI源；正離子方式檢測西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N, N-雙去甲基西布曲明；負離子方式檢測呋塞米；毛細管電壓為3.5±0. 5KV ;錐孔電壓為20 35V ;萃取錐孔電壓為3±0. 5V ;聚焦電壓為O. 1±0. OlV ;脫溶劑溫度為300±50°C ;鞘氣流速為500 600L · h—1 ;碰撞能量為10 35V。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述有機溶劑是甲醇。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述液質(zhì)聯(lián)用儀為QuattroPremierXE三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在中藥、保健食品或化妝品中同時檢測七種非法添加減肥類化學成分的方法。該方法在液相分離時選用了合適的流動相和合理的洗脫梯度，使需要檢測的減肥類成分在12min內(nèi)得到有效分離，使樣品儀器分析時間縮短了88%，極大地提高了工作效率。同時結合了HPLC技術的高分離能力與質(zhì)譜較高的靈敏度與較強的定性能力等優(yōu)點，可以在一次運行中同時完成篩選和確證。本發(fā)明的方法既能使西布曲明，芬氟拉明，酚酞，麻黃堿，咖啡因，N,N-雙去甲基西布曲明和呋塞米7種化學成分達到有效的分離，又能縮短檢驗時間，準確有效地甄別中藥、保健食品或化妝品中的非法添加減肥類化學成分。
文檔編號G01N30/02GK102901780SQ20121039403
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權日2012年10月17日
發(fā)明者黎銀波, 孟慶玉, 蔣秋桃, 殷帥, 李文莉, 鐘慶元 申請人:湖南省食品藥品檢驗研究院