一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒。該試劑盒包括同時檢測HLA-DQA1基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、用于熒光定量PCR檢測的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時檢測與紅斑狼瘡密切相關(guān)的HLA-DQA1、IRF5、STAT4的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體罹患紅斑狼瘡的風(fēng)險性。
【專利說明】一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒，通過同時檢測與紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)的基因HLA-DQAl、IRF5和STAT4的單核苷酸多態(tài)性位點基因型來評估個體罹患紅斑狼瘡的風(fēng)險性。
【背景技術(shù)】
[0002]紅斑狼瘡(LE)是一種臨床上有多種表現(xiàn)、可累及全身多個組織器官的自身免疫性疾病。根據(jù)其臨床表現(xiàn)特點，組織病理，免疫學(xué)指標(biāo)等將其定性為一種病譜性疾病,分為三個亞型:(1)盤狀紅斑狼瘡(DLE)，(2)亞急性皮膚性紅斑狼瘡(SCLE)，(3)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE).部分SCLE可以發(fā)展成SLE，而DLE —般不發(fā)展為SLEfJJ。系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床表現(xiàn)最重，累計多個臟器，對生活質(zhì)量的影響最重。
[0003]自1882年Biett最早描述系統(tǒng)性紅斑狼瘡至今，其病因發(fā)病機制尚未完全明確，但有大量證據(jù)表明機體的遺傳因素在該病的易感性及其表達(dá)方面有著重大的作用。如同卵雙生子患者中，共同患病達(dá)65%，明顯高于異卵雙生子的共同患病率9 %，所有患者中，4%具有家族性。在美國，黑人SLE的發(fā)病率是白人的3倍，但非洲黑人的發(fā)病率并不高。在我國，SLE的發(fā)病率也明顯高于其他東方國家與西方人，由此可見，SLE具有家族遺傳性和種族遺傳性。
[0004]目前，涉及紅斑狼瘡的一些基因，已經(jīng)很好的進行研究。其作用機制、生化功能、信號通路、調(diào)控、轉(zhuǎn)錄等等方面有明確可靠的研究結(jié)果；研究手段、方法、儀器設(shè)備和試劑都已經(jīng)發(fā)展到了一個相當(dāng)高的程度。目前，經(jīng)證實并且機理研究清楚的與紅斑狼瘡密切相關(guān)的基因有HLA-DQAl基因、IRF5基因和STAT4基因。
[0005]自1995年潘星華等首次報告中國漢人SLE易感性與HLA_DQA1*0101、HLA-DQAI*0401相關(guān)，HLA_DQA1*0501和HLA_DQA1*0601有遺傳抵抗作用以來，中國大陸已有7項獨立研究探討了 SLE與HLA-DQAl基因的關(guān)聯(lián)性。后又有研究人員通過Meta分析增大了樣本量，納入447例SLE患者和503例正常劉照，定量綜合中國大陸人群多個研究結(jié)果，得出量化的平均效果和聯(lián)系，增加了結(jié)論的把握度，解決了研究結(jié)果的不一致性。
[0006]據(jù)研究顯示，HLA-DQA1*0301是中國大陸人群SLE保護基因。HLA-1I類分子在抗原處理和遞呈中具有重要作用，人們推測不同HLA-DR基因可能因其基因型別不同，與抗原肽結(jié)合的結(jié)合槽或與CD4T細(xì)胞結(jié)合部位的氨基酸殘基不同，這種氨基酸的理化性質(zhì)變化可導(dǎo)致其結(jié)合能力的變化，從而影響免疫反應(yīng)，決定了對SLE的易感性差異。
[0007]HLA II類基因是人類基因組最具多態(tài)性的區(qū)域，同一基因位點具有多個等位基因，并且隨著研究的深入，越來越多的基因亞型被發(fā)現(xiàn)和鑒定。HLA*DQA1與疾病的關(guān)聯(lián)研究，也越來越深入和細(xì)致。
[0008]在HLA-1I類基因位點中，以研究DR、DQ與SLE相關(guān)性為多，也已表明SLE與HLA-D區(qū)多態(tài)性基因相關(guān)，而且不同種族和地區(qū)的SLE與HLA的關(guān)聯(lián)不同。20世紀(jì)90年代，Skarsvag 等發(fā)現(xiàn)北歐白人 SLE 與 HLA_DRB1*03、_DRB1*0101、DQA1*0501、DQB1*0201 關(guān)聯(lián)。Coward 等的研究表明丹麥人 SLE 與 HLA_DRBl*03/06、_DR3*01/03、DQA1*0501、DQB1*0201相關(guān)。Dong 等人發(fā)現(xiàn)日本人 SLE 與 HLA-DRB1*1501、-DRB5*0101、DQA1* 0102、DQB1*0602單倍型相關(guān)。Doherty等1992年應(yīng)用PCR-SSO技術(shù)對源于中國南方的馬來西亞華裔SLE患者的研究揭示了與HLA-DR15 (DR2)、DQ1相關(guān)，但未見與任何DQA1、DQBl等位基因關(guān)聯(lián)，認(rèn)為SLE易感基因可能在DR位點近端。
[0009]由IRF5介導(dǎo)誘導(dǎo)IFN- a、IFN- ^及一些細(xì)胞因子(IL_6、TNF等)表達(dá)，激活I(lǐng)FN下游靶基因。IRF5表達(dá)增高后，從而激活特異性的獲得性免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體，引起病理損傷。
[0010]IRF5還參與了細(xì)胞凋亡過程。IRF5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游蛋白質(zhì)包括Bax、胱天蛋白酶_8、胱天蛋白酶-3和Fas結(jié)合 死亡域蛋白質(zhì)/胱天蛋白酶-8,活化的IRF5激活胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，使線粒體釋放細(xì)胞色素C，改變線粒體膜電位，改變細(xì)胞膜的對稱結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA斷裂和細(xì)胞凋亡。
[0011]信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子4 (STAT4)基因位于人類染色體2q32.2^32.3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子家族成員之一，其表達(dá)主要分布于淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中。3丁八14可以被白細(xì)胞介素(10-12、IL-23以及I型干擾素等一些重要細(xì)胞因子所誘導(dǎo)。STAT4存于胞質(zhì)中，經(jīng)細(xì)胞因子激活而磷酸化的STAT4轉(zhuǎn)入并積累于細(xì)胞核中，進而刺激其他特異基因的轉(zhuǎn)錄，例如作為T細(xì)胞分化為Thl細(xì)胞的重要指標(biāo)物的干擾素(IFN)-Y。由此可見，IL-12介導(dǎo)的STAT4依賴性信號通路在Thl型T淋巴細(xì)胞生成過程中起了關(guān)鍵的作用。此外，也發(fā)現(xiàn)STAT4與Thl7這一新定義的⑶4*T淋巴細(xì)胞譜系成員的分化有關(guān)。促炎癥反應(yīng)的Thl7細(xì)胞部分依賴于與IL-12相關(guān)的細(xì)胞因子IL-23的活性，進而在一定程度上引起慢性炎癥紊亂。與此同時，IFN-Y的生產(chǎn)有抑制Thl7分化通路的趨勢?？偠灾?，STAT4在自身免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]基于HLA-DQAl基因、IRF5基因、STAT4基因上的3個SNPs位點多態(tài)性可用來評估個體罹患紅斑狼瘡風(fēng)險性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒。
[0013]試劑盒包括:
檢測HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；
檢測IRF5基因上rs2004640號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測STAT4基因上rs7574865號SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對；
熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水
[0014]本試劑盒中所述的特異性引物對是指針對HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含這三個SNPs位點的DNA片段的引物對。設(shè)計這類引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID N0:1和2、3和4、5和6所示序列的引物對。特異性引物對可用常規(guī)的合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這三對引物。
[0015]本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是指針對HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出這三個SNPs位點基因型的Taqman探針對。設(shè)計這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID N0:7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探針對。特異性熒光探針對可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進行合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的特異性熒光Taqman探針對不限于這三對探針，所有可用于熒光定量PCR法檢測本發(fā)明中所述用來評估個體罹患紅斑狼瘡風(fēng)險性的三個SNPs位點的探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0016]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
5W 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液，
0.5m 25mM dNTP 混合液，
3m 25mM MgCl2 溶液，
0.125m (5unitsM) Taq DNA 聚合酶，
20剛特異性引物對每條引物各0.225^1,
10剛特異性熒光探針對每條探針各0.25^1,
去尚子水26.625M-1 o
[0017]本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
`[0018]
【具體實施方式】:
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
[0019]
實施例1.檢測試劑盒的使用 步驟1:DNA模板的提取
用真空采血管采集人體外周血，提取血液中的基因組DNA。
[0020]步驟2:熒光定量PCR反應(yīng)
使用可檢測紅斑狼瘡易感基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中，包含下列引物對和熒光探針對:
有義引物 1:5，- CACGTAATATAAATG - 3，(SEQ ID NO:1)
反義引物 1:5’ - CCTAATTCCAAAGCC - 3’ (SEQ ID NO:2)
有義引物 2:5’- GCTGCGCCTGGAAAG - 3，(SEQ ID NO:3)
反義引物 2:5’- CGGGCGCACCCTGCT - 3，(SEQ ID NO:4)
有義引物 3:5’- TATGAAAAGTTGGTG - 3，(SEQ ID NO:5)
反義引物 3:5’- CCACTGAAATAAGAT - 3’ (SEQ ID NO:6)
帶 VIC 熒光基團探針 1:5，- CAAAAGaAGGGT -3，(SEQ ID NO:7)
帶 FAM 熒光基團探針 1:5’ - CAAAAGgAGGGT -3’ (SEQ ID NO:8)
帶 VIC 熒光基團探針 2:5’ - CTCGGGgGGGTG -3，(SEQ ID NO:9)
帶 FAM 熒光基團探針 2:5’ - CTCGGGtGGGTG -3’ (SEQ ID NO:10)帶 VIC 熒光基團探針 2:5’ - AAATGTgAATAG -3，(SEQ ID NO:11)
帶 FAM 熒光基團探針 2:5，- AAATGTtAATAG-3’ (SEQ ID NO:12)
有義引物1，反義引物1、帶VIC熒光基團探針1、帶FAM熒光基團探針I(yè)特異地針對檢測HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點多態(tài)性；
有義引物2，反義引物2、帶VIC熒光基團探針2、帶FAM熒光基團探針2特異地針對檢測IRF5基因上rs2004640號SNP位點多態(tài)性；
有義引物3，反義引物3、帶VIC熒光基團探針3、帶FAM熒光基團探針3特異地針對檢測STAT4基因上rs7574865號SNP位點多態(tài)性；
3個SNPs位點分別進行3次獨立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)的體系為總體積IOW，包含濃度為20ng/W的DNA模板2W、1W 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0.1W 25mMdNTP 混合液、0.6W 25mM MgCl2 溶液、0.025W (5unitsM) Taq DNA 聚合酶、20剛的有義引物和反義引物各0.225W、10剛的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0.25W，去離子水
5.325)^1 o
[0021]在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進行60個循環(huán)的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900型熒光定量PCR儀上讀取
樣品突光量。
[0022]步驟3 =SNP基因型分析
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的
基因型。
[0023]實施例2.對患者進行紅斑狼瘡易感基因檢測的服務(wù) 步驟1:DNA提取
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師對被檢者進行外周血的采集，采用真空采血管采集外周血，并提取出其中的基因組DNA。
[0024]步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢者基因組DNA的HLA-DQAl基因上rs9271366號SNP位點、IRF5基因上rs2004640號SNP位點、STAT4基因上rs7574865號SNP位點分別進行熒光定量PCR檢測，確定這兩個SNPs位點的基因型。
[0025]步驟3:個體罹患紅斑狼瘡風(fēng)險性的分析
通過對被檢測者SNPs基因型的分析， 出具罹患紅斑狼瘡風(fēng)險性的分析報告單。報告中詳細(xì)說明了被檢測者罹患紅斑狼瘡風(fēng)險性的高低，并由醫(yī)師向被檢測者詳細(xì)說明和解讀罹患紅斑狼瘡風(fēng)險性的分析報告單。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測紅斑狼瘡易感基因的試劑盒，其特征在于:包括同時檢測HLA-DQAl基因上rs9271366 號 SNP 位點、IRF5 基因上 rs2004640 號 SNP 位點、STAT4 基因上 rs7574865 號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對HLA-DQAl 基因上 rs9271366 號 SNP 位點、IRF5 基因上 rs2004640 號 SNP 位點、STAT4 基因上rs7574865號SNP位點而設(shè)計，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性熒光探針對是指針對HLA-DQAl 基因上 rs9271366 號 SNP 位點、IRF5 基因上 rs2004640 號 SNP 位點、STAT4 基因上rs7574865號SNP位點而設(shè)計，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測出這3個SNPs位點基因型的Taqman探針對。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO:1和2、3和4、5和6所示序列的引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所含的特異性熒光探針選自具有SEQID NO:7和8、9和10、11和12所示序列的Taqman探針對。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:試劑盒的組分和含量包括10X熒光定量 PCR 反應(yīng)緩沖液、0.5Pl 25mM dNTP 混合液、3Pl 25mM MgCl2 溶液、0.125W (5unitsM)Taq DNA聚合酶、20剛特異性引物對每條引物各0.225W、10剛特異性熒光探針對每條探針各0.25沿、去離子水26.625W，`本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【文檔編號】G01N21/64GK103667434SQ201210360001
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月25日
【發(fā)明者】任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司