專利名稱：基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及無機(jī)納米材料制備及光譜應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移的生物傳感器的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器是指接近分子尺寸、在與被分析物相互作用時(shí)能夠給出實(shí)時(shí)信號的一種生物化學(xué)分析器件。生物傳感器具有體積小、成本低、不需要預(yù)處理以及不受外界電磁場影響等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、材料科學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域，科技進(jìn)步要求生物傳感器的發(fā)展趨勢為更高的靈敏度和更低的檢測限、更好的選擇性和更少的物質(zhì)干擾、更高的準(zhǔn)確度和更好的精密度、更完善可信的形態(tài)分析、更高的分析速度和自動(dòng)化程度、更小的樣品量實(shí)施微損或無損分析、實(shí)施原位(in situ)、活體(in vivo)、實(shí)時(shí)(real time)
和在線(on line)分析、分析器件小型化、微型化和智能化等?；跓晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)的生物傳感器已被廣泛研究，熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指當(dāng)一對合適的物質(zhì)構(gòu)成一個(gè)能量供體(donor)和能量受體(acceptor)對時(shí),兩者相隔距離在I. 0-10. O納米內(nèi)，并且供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜能有效地重疊，以供體的激發(fā)光激發(fā)，供體分子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)之后，由于偶極-偶極相互作用，供體分子激發(fā)態(tài)能量h V就有可能以非輻射的形式有效地被傳遞至受體分子，而后受體分子通過發(fā)射出光子而弛豫，即發(fā)生熒光共振能量。熒光共振能量轉(zhuǎn)移作為I. 0-10. O納米距離范圍內(nèi)的光學(xué)“分子尺”，具有高分辨率、高靈敏度，簡單方便等優(yōu)點(diǎn)，被越來越廣泛地應(yīng)用于核酸檢測、免疫分析以及生物大分子相互作用的研究中。貴金屬納米團(tuán)簇是指在一定的分子層保護(hù)下，由幾個(gè)到幾百個(gè)貴金屬(金或銀)原子組成的相對穩(wěn)定的聚集體。目前，利用模板法、單分子層保護(hù)法或配體蝕刻法，采用硫醇、樹枝狀聚合物、DNA、蛋白質(zhì)等保護(hù)劑或模板劑可合成水溶性好、發(fā)光顏色可調(diào)的貴金屬納米團(tuán)簇。貴金屬納米團(tuán)簇直徑通常小于2納米，介于單原子和納米粒子或者大體積的貴金屬之間。該尺度接近電子的費(fèi)米波長，此時(shí)，連續(xù)的能態(tài)性質(zhì)分裂為離散的能態(tài)，并出現(xiàn)類似分子的尺寸依賴效應(yīng)。當(dāng)電子從價(jià)帶(5cT)激發(fā)到導(dǎo)帶(esp1)時(shí)，貴金屬納米團(tuán)簇可在可見區(qū)到近紅外區(qū)范圍內(nèi)顯示出尺寸依賴的熒光性質(zhì)。與小分子熒光染料和熒光蛋白相t匕，熒光貴金屬納米團(tuán)簇材料用作熒光探針具有光物理性質(zhì)好、比表面積大、抗光漂白、生物相容性好、表面易于修飾以及熒光性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，在化合物檢測、生物傳感與成像、光電子學(xué)和納米醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用前景。盡管基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的生物傳感器的應(yīng)用較為成熟，但是由于其特有的能量轉(zhuǎn)移有效距離(I. 0-10.0納米)使得在設(shè)計(jì)能量轉(zhuǎn)移體系時(shí)需要復(fù)雜的表面功能化和供體受體之間化學(xué)鍵和步驟，導(dǎo)致開發(fā)新型、高效的生物傳感器受到了較大限制。本方法旨在提供一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移(SPEET)的生物傳感器構(gòu)建方法，這種新穎的能量轉(zhuǎn)移模式是借助貴金屬的表面等離子體性質(zhì)顯著增強(qiáng)體系內(nèi)供體和受體之間的能量轉(zhuǎn)移效率并且擴(kuò)大了能量轉(zhuǎn)移的有效距離(22納米)，使得基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移設(shè)計(jì)的生物傳感器更加靈活實(shí)用。同時(shí)引入熒光金納米團(tuán)簇和金納米粒子分別作為供體和受體，使得生物傳感器的定量方法更加靈敏和準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)合成的蛋白質(zhì)包覆的金納米團(tuán)簇的最大激發(fā)波長在520納米，最大發(fā)射波長在690納米，巰基乙胺修飾的金納米粒子最大吸收波長在520納米，金納米團(tuán)簇的最大激發(fā)波長和金納米粒子的最大吸收波長發(fā)生重疊，并且在緩沖介質(zhì)中由于表面正負(fù)電荷發(fā)生靜電吸附作用使得兩者距離拉近，這兩點(diǎn)即作為表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移的必要條件。將蛋白質(zhì)包覆的金納米團(tuán)簇和巰基乙胺修飾的金納米粒子混合，兩者發(fā)生表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移使得體系熒光猝滅，當(dāng)有肝素鈉存在時(shí)，由于肝素鈉較大的負(fù)電荷密度使得帶正電的巰基乙胺修飾的金納米粒子發(fā)生聚集而使其最大吸收波長紅移，同時(shí)肝素鈉聚合長鏈的分子構(gòu)型拉遠(yuǎn)了巰基乙胺修飾的金納米粒子和蛋白包覆的金納米團(tuán)簇之間的距離，從而打破表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移使得體系熒光恢復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述存在問題，提供一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法同時(shí)引入熒光金納米團(tuán)簇和金納米粒子分別作為供體和受體，使得生物傳感器的定量方法更加靈敏和準(zhǔn)確。 本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，步驟如下I)蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的制備在反應(yīng)各器中依次加入氣金Ife溶液和蛋白質(zhì)溶液，在37° C水浴中避光磁力攬祥下反應(yīng)10分鐘后,逐滴加入濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液,調(diào)節(jié)體系的pH為12. O,然后繼續(xù)反應(yīng)36小時(shí)，得到蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物用超濾膜在6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下超濾離心30分鐘，棄掉下清液，將分離后的蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇重新分散在10倍體積的超純水中，在4° C下避光保存；2)巰基乙胺修飾的金納米粒子的制備在反應(yīng)容器中依次加入高純水、巰基乙胺溶液和氯金酸溶液，磁力攪拌下室溫避光反應(yīng)20分鐘，然后迅速加入新配置的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌避光反應(yīng)30分鐘，即得到酒紅色的巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液，在4° C下避光保存；3)基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建在一組離心管中分別加入巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液、超純水和pH為5. O的磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液作為測試容器，然后在各測試容器中分別加入濃度為O. I -4. O μ g/mL的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液,混合均勻后室溫反應(yīng)20分鐘,最后向反應(yīng)體系中加入蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇溶液，反應(yīng)20秒后測定體系熒光強(qiáng)度。所述蛋白質(zhì)為胰蛋白酶、人血清白蛋白、溶菌酶、胰島素或胃蛋白酶。所述氯金酸溶液的濃度為25. 4mmol/L,蛋白質(zhì)溶液濃度為30mg/mL,巰基乙胺溶液濃度為213mmol/L，硼氫化鈉溶液濃度為lOmmol/L，氯金酸溶液與蛋白質(zhì)溶液的體積比為1:1，高純水、巰基乙胺溶液、氯金酸溶液和硼氫化鈉溶液的體積比為37. 5 :0. 4 :2. 23 O. 01。所述磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液濃度為40mmol/L，磷酸、醋酸和硼酸的重量比為98 60 62o所述巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液、超純水、磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液與蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的體積比為300 :1200 :500 :50。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果該方法所涉及的納米材料的合成，步驟簡單，不需要苛刻的設(shè)備、條件，操作安全簡便，毒性小、成本低，所用合成和檢測儀器設(shè)備均為普通設(shè)備，反應(yīng)條件簡單，室溫或者37° C水浴反應(yīng)即可，沒有苛刻的條件要求。該方法引入蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇和巰基乙胺修飾的金納米粒子分別作為能量轉(zhuǎn)移的供體和受體，利用表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移的理念實(shí)現(xiàn)對于目標(biāo)物肝素鈉的快速、準(zhǔn)確和高靈敏度高選擇性定量。本方法首次將表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移的理念應(yīng)用于生物傳感器的構(gòu)建，并充分發(fā)揮了貴金屬納米材料的合成簡單、發(fā)光效率高、熒光性質(zhì)穩(wěn)定和生物相容性好等優(yōu)勢，建立了一種簡便快速和高靈敏度高選擇性的定量方法，克服了傳統(tǒng)能量轉(zhuǎn)移方法中納米材 料合成復(fù)雜、供體受體選擇條件苛刻以及能量轉(zhuǎn)移效率低等缺點(diǎn)，可以拓展能量轉(zhuǎn)移理念作為生物傳感器構(gòu)建中的應(yīng)用，在生物化學(xué)分析和臨床診斷等領(lǐng)域具有重大的實(shí)踐意義。


圖I為該生物傳感器的熒光光譜圖。圖2為該生物傳感器的線性檢測圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，步驟如下I)蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的制備在50mL圓底燒瓶中依次加入IOmL濃度為25. 4mmol/L的氯金酸溶液和IOmL濃度為30mg/mL的胰蛋白酶溶液，在37° C水浴中避光磁力攪拌反應(yīng)10分鐘后，逐滴加入ImL濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)體系的pH為12. 0，然后繼續(xù)反應(yīng)36小時(shí)，得到胰蛋白酶包覆的熒光金納米團(tuán)簇的粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物用超濾膜在6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下超濾離心30分鐘，棄掉下清液，將分離后的胰蛋白酶包覆的熒光金納米團(tuán)簇重新分散在超純水中，在4° C下避光保存；2)巰基乙胺修飾的金納米粒子的制備在50mL圓底燒瓶中依次加入37. 5mL高純水、400 μ L濃度為213mmol/L的巰基乙胺溶液和2. 23mL濃度為25. 4mmol/L的氯金酸溶液，磁力攪拌下室溫避光反應(yīng)20分鐘，然后迅速加入10 μ L新配置的濃度為lOmmol/L的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌避光反應(yīng)30分鐘，即得到酒紅色的巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液，在4° C下避光保存；3)基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建在一組5mL離心管中分別加入300 μ L巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液、1200 μ L超純水和500 μ L pH為5. O濃度為40mmol/L的磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液作為測試容器，該緩沖溶液中磷酸、醋酸和硼酸的重量比為98 60 :62，然后在各測試容器中分別加入濃度為O. I - 4. O μ g/mL的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液,混合均勻后室溫反應(yīng)20分鐘,最后向反應(yīng)體系中加入50 μ L胰蛋白酶包覆的金納米團(tuán)簇溶液，反應(yīng)20秒后測定體系熒光強(qiáng)度。實(shí)施例2 一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，步驟和方法與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白，相應(yīng)制得牛血清白蛋白包覆的熒光金納米團(tuán)簇。實(shí)施例3 一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，步驟和方法與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于蛋白質(zhì)為溶菌酶，相應(yīng)制得溶菌酶包覆的熒光金納米團(tuán)簇。實(shí)施例4
例I基本相同，不同之處在于蛋白質(zhì)為胰島素，相應(yīng)制得胰島素包覆的熒光金納米團(tuán)簇。實(shí)施例5一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，步驟和方法與實(shí)施例I基本相同，不同之處在于蛋白質(zhì)為胃蛋白酶，相應(yīng)制得胃蛋白酶包覆的熒光金納米團(tuán)簇。圖I為該生物傳感器熒光光譜圖，圖中表明隨著肝素鈉濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度增加，這是由于肝素鈉濃度越高，巰基乙胺修飾的金納米粒子的最大吸收波長紅移程度越大，同時(shí)金納米粒子和金納米團(tuán)簇之間的距離越遠(yuǎn)，因此表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移效率被削弱，使得體系熒光恢復(fù)。圖2為該生物傳感器的線性檢測圖，圖中表明本方法基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移建立的生物傳感器對于肝素鈉的檢出限為O. 05μ g/mL，線性檢測范圍為O. I -4. O μ g/mL作為標(biāo)準(zhǔn)對比曲線。
權(quán)利要求
1.一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下 1)蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的制備 在反應(yīng)容器中依次加入氯金酸溶液和蛋白質(zhì)溶液，在37° C水浴中避光磁力攪拌下反應(yīng)10分鐘后,逐滴加入濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液,調(diào)節(jié)體系的pH為12. O,然后繼續(xù)反應(yīng)36小時(shí)，得到蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的粗產(chǎn)物，將粗產(chǎn)物用超濾膜在6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下超濾離心30分鐘，棄掉下清液，將分離后的蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇重新分散在10倍體積的超純水中，在4° C下避光保存； 2)巰基乙胺修飾的金納米粒子的制備 在反應(yīng)容器中依次加入高純水、巰基乙胺溶液和氯金酸溶液，磁力攪拌下室溫避光反應(yīng)20分鐘，然后迅速加入新配置的硼氫化鈉溶液，劇烈攪拌避光反應(yīng)30分鐘，即得到酒紅色的巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液，在4° C下避光保存； 3)基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建 在一組離心管中分別加入巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液、超純水和pH為5. O的磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液作為測試容器，然后在各測試容器中分別加入濃度為O. 1-4. O yg/niL的肝素納標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測溶液，混合均勾后室溫反應(yīng)20分鐘，最后向反應(yīng)體系中加入蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇溶液，反應(yīng)20秒后測定體系熒光強(qiáng)度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于所述蛋白質(zhì)為胰蛋白酶、人血清白蛋白、溶菌酶、胰島素或胃蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于所述氯金酸溶液的濃度為25. 4mmol/L，蛋白質(zhì)溶液濃度為30mg/mL，巰基乙胺溶液濃度為213mmol/L，硼氫化鈉溶液濃度為lOmmol/L，氯金酸溶液與蛋白質(zhì)溶液的體積比為1:1，高純水、巰基乙胺溶液、氯金酸溶液和硼氫化鈉溶液的體積比為37. 5 :0. 4 :2. 23 O. 01。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于所述磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液濃度為40mmol/L，磷酸、醋酸和硼酸的重量比為98 60 62o
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于所述巰基乙胺修飾的金納米粒子溶液、超純水、磷酸-醋酸-硼酸緩沖溶液與蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇的體積比為300 :1200 :500 :50。
全文摘要
一種基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的構(gòu)建方法，步驟如下1)制備蛋白質(zhì)包覆的熒光金納米團(tuán)簇；2)制備巰基乙胺修飾的金納米粒子；3)構(gòu)建基于表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移生物傳感器的實(shí)驗(yàn)體系。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是該構(gòu)建方法引入蛋白質(zhì)包覆的金納米團(tuán)簇和巰基乙胺修飾的金納米粒子分別作為能量轉(zhuǎn)移的供體和受體，利用表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移的理念實(shí)現(xiàn)了對于目標(biāo)物肝素鈉的快速、準(zhǔn)確和高靈敏度高選擇性定量；該方法所涉及的納米材料的合成，步驟簡單，不需要苛刻的設(shè)備、條件，操作安全簡便，毒性小、成本低，所用合成和檢測儀器設(shè)備均為普通設(shè)備，反應(yīng)條件簡單，室溫或者37oC水浴反應(yīng)即可。
文檔編號G01N21/64GK102866139SQ201210353558
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者嚴(yán)秀平, 劉敬民 申請人:南開大學(xué)