專利名稱：一種用于檢測抑郁癥的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體是ー種用于檢測抑郁癥的試劑盒。
背景技術：
抑郁癥是ー種常見的心境障礙，其核心癥狀為情緒低落、思維遲緩、意志活動減退，還能出現睡眠障礙、反復自殺念頭等。據WHO統計，目前全球約有I. 21億抑郁癥患者，每年有850. 000人的死亡與抑郁相關。抑郁癥的遺傳率約為30% 40%，其中可能涉及到了多個遺傳因素。同時，多種非遺傳因素(應激、神經發(fā)育異常等)増大了抑郁癥發(fā)病的復雜性，至今抑郁癥發(fā)病機制仍未明確。臨床上通過藥物治療、心理治療或者物理治療可使抑郁癥狀緩解。目前，臨床上對抑郁癥只能通過臨床癥狀結合抑郁量表來診斷，這種診斷方法難以在疾病潛伏期及其早期階段明確檢測抑郁癥，其導致的不良后果是難以在疾病潛伏期及·其早期階段明確檢測抑郁癥。因此，現在急需發(fā)現ー種新的、具有診斷意義的、能精確定量的抑郁癥診斷材料及其使用方法，來對抑郁癥進行潛伏期和早期階段進行診斷，并為患者提供更好的治療方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是為檢測抑郁癥提供ー種試劑盒，能精確定量地實現對抑郁癥患者的診斷。為實現上述目的本發(fā)明采用的技術方案是一種用于檢測抑郁癥的試劑盒，包括一般診斷試劑盒中所使用的成分(即封閉液、酶標抗體、酶底物溶液、終止液、酶標板)和PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白質片段和與PEDF蛋白特異性結合的抗體(以下簡稱抗PEDF抗體)，其中PEDF蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NOl0上述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。優(yōu)選單克隆抗體。權利要I所述PEDF蛋白或包含PEDF蛋白的蛋白質片段或與PEDF蛋白特異性結合的抗體在制備檢測抑郁癥的試劑盒中的應用，其中，正常、精神分裂癥、抑郁癥及雙向情感障礙血清中 PEDF 蛋白的平均值分別為 2918. 9ug/mL、3037. 8ug/mL、1624. 8ug/mL、2838ug/mL0本發(fā)明使用蛋白質組學方法分析了在抑郁癥中顯示特異變化的蛋白質群。通過分析抑郁癥患者血漿、精神分裂癥、雙向情感障礙與正常血漿中的蛋白質數量變化和蛋白質類型發(fā)現了下列結果。第一，選擇正常血漿作為對照組，通過ニ維凝膠分離和圖像分析，在由抑郁癥患者的血漿中分離顯示性質和數量差異的蛋白質群，使用MALDI-T0F分析儀鑒定蛋白質群，證明了其中觀察并鑒定變化的蛋白質是PEDF。第二，在以正常的血液作為正常對照組、以精神分裂癥、雙向情感障礙的血液作為疾病對照組時，觀察到在抑郁血漿中PEDF的表達是降低的，在精神分裂癥血漿中表達是增高的。第三，在檢查了血液中的靶蛋白變化之后，使用適當的免疫學方法制備了診斷抑郁癥的試劑盒，選擇了用于測量蛋白質存在值的簡單、靈敏、且精確的方法。其中，當患者血漿PEDF濃度低于2485ug/ml時可診斷為抑郁癥，可以對抑郁癥患者進行診斷。
圖I表示將要應用于蛋白質組學分析的血漿的預處理過程；
圖2表示血漿在ニ維電泳后銀染；A :正常組血漿雙向電泳圖，B :重性抑郁組血漿雙向電泳圖，正常血漿的標記區(qū)域中顯示存在過量的蛋白質，而抑郁癥血漿的標記區(qū)域中顯示蛋白質的數量減少；
圖3表示使用MALDI-T0F分析儀得到的圖2標記區(qū)域中蛋白質經胰蛋白酶處理的肽的質譜，以及肽片段中肽的氨基酸序列，ー級質譜 圖4表示圖3相應的ニ級質譜圖；·· 圖5表示圖3相應的ニ級質譜 圖6表示圖3相應的ニ級質譜 圖7表示PEDF在正常對照組、精神分裂癥組、雙向情感障礙組及抑郁癥組中PEDF的表達變化；
圖8表示PEDF標準溶液和ELISA反應后的光密度測量值。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發(fā)明，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1，蛋白質組學分析的血漿的預處理。如圖I所示，將要應用于蛋白質組學分析的血漿樣品與正常血漿對照，然后去除7種高豐度蛋白(Agilent)，Speed Vac對血漿樣品進行濃縮，再采用TCA法對濃縮后樣品進行除鹽、純化，最后沉淀為干粉備用(在后面的實施例中溶解后再進行的實驗)。實施例2，由正常人與抑郁癥患者獲得的血漿中發(fā)生變化的蛋白質群的研究。首先，通過逐步法使用蛋白質的兩個不同特征將蛋白質在ニ維上分開。在第一歩中，通過對蛋白質施加點刺激使蛋白質根據蛋白質的靜電荷移動(IEF，pH3-10);在第二步中，蛋白質在丙烯酰胺凝膠上根據每種蛋白質的分子量移動。對蛋白進行移位電泳(蛋白質根據PH移動)。然后，在聚丙烯酰胺上對蛋白質進行ニ維電泳(蛋白質根據分子量移動)。用考馬斯亮藍R250染料和銀染法將這些移動蛋白質染色用于顯影。在電腦中使用圖像分析軟件TOQuest (Bio-Rad,美國)分析正常血漿與抑郁癥血漿之案件的蛋白質差異，本發(fā)明人確認了存在現實差異的蛋白質群，參見見圖2中方框框出部分。實施例3，正常人與抑郁癥患者之間顯示差異的血漿蛋白質的鑒定。通過MALDI-T0F分析儀搜索并鑒定具有數量和性質差異的蛋白質(即圖2中方框框出部分)以獲知蛋白質的種類，見圖3-圖6，鑒定顯示抑郁癥患者的PEDF表達低于正常人的血液。實施例4，通過WesternBlotting免疫印跡法檢測PEDF表達。如圖4，首先制備12名正常、12名精神分裂、12名雙向情感障礙及12名抑郁癥患者血漿變性樣本。在聚丙烯酰胺膠上對蛋白質進行電泳(蛋白質根據分子量移動)，每塊凝膠100V。后采用免疫印跡法將SDS-PAGE膠中蛋白轉印至PVDF膜上，用抗PEDF抗體對PVDF膜進行免疫反應，4°C過夜。之后取出，TBST洗膜3次，每次10分鐘。然后用HRP標記的ニ抗(酶標抗體)與PVDF進行反應，室溫下孵育2個小吋。然后采用ECL法對PVDF進行X-膠片曝光，并用Quantity-One軟件分析灰度值。比較分析提示，同正常對照組比較，在精神分裂癥和雙向情感障礙兩個疾病對照組中PEDF灰度值大，提示蛋白數量多；而在抑郁癥組中PEDF灰度值呈I. 5倍的降低改變，提示蛋白數量少。實施例5，抗體制備。單克隆抗體的方法1)PEDF基因或蛋白免疫動物，2)免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；3)雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)，篩選和克??；4)分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立；5)單克隆抗體的大量制備。多克隆抗體的方法1) PEDF基因或蛋白免疫動物，2)收集免疫動物血清，純化針對PEDF的多克隆抗體?！嵤├?，通過酶聯免疫吸收測定法(ELISA)診斷抑郁癥。進行本研究是為了查明能否通過酶聯免疫吸收測定法(ELISA)使用抗PEDF抗體在正常、精神分裂癥及雙向情感障礙中鑒別抑郁癥患者的血清。在醫(yī)院中，由50名正常健康人、12名精神分裂癥患者、12名雙向情感障礙患者和70名抑郁癥患者獲得血漿。首先準備已包被好的檢測PEDF的96孔ELISA試劑盒(Merck Millipore, Billerica,Massachusetts, USA)。由于PEDF在血液中多以結合態(tài)存在，預先用8mM尿素處理血衆(zhòng)，室溫裂解30min。然后每個孔中加入緩沖液稀釋(I: 100)的患者血漿lOOul，37°C反應I小時，然后用Wash buffer清洗6次。向姆個孔中加入IOOul稀釋的抗PEDF抗體(MerckMillipore, Billerica, Massachusetts, USA),然后 37°C 反應 I 小時。反應后，將姆個孔用Wash buffer清洗6次。然后，向其中加入IOOul稀釋后的過氧化物酶偶聯的鏈霉親和素，37°C反應I小時。Wash buffer清洗6次。加入IOOul TMB/E底物顯影，5_10分鐘后加入IOOul終止液終止。酶標儀450nm波長下讀數。用PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白質片段制作標準液，進行標準滴定曲線的繪制實驗。通過將標準滴定曲線和稀釋度轉換成光密度來確定每個單位體積(ml)血液中的PEDF數量(見圖5)。ELISA測量的結果是，正常對照組血漿中的范圍是1897. 6-5409. 4ug/mL，雙向情感障礙組血漿中的范圍是1676. 1-6160. 5ug/mL，精神分裂癥組血漿中的范圍是2267. 6-7836. 6ug/mL，抑郁癥組血漿中的范圍702. 5-2461. 5ug/mL。這些結果在表I中以平均值顯示。作為PEDF的測量平均值，正常人是2918. 9ug/mL，雙向情感障礙患者是2838ug/mL，精神分裂癥患者是3037. 8ug/mL，而抑郁癥患者是1624. 8ug/mL。在這里顯著顯示了抑郁癥患者的血漿中存在PEDF減少。依據ROC曲線分析顯示了 95. 5%的診斷靈敏性。在精神疾病患者的情況中，PEDF顯示了91. 7%診斷特異性(見表I)。其中，當患者血漿PEDF濃度低于2485ug/ml時可診斷為抑郁癥。表I:通過ELISA測量健康人和患者血漿中PEDF的平均值
I平均PEDF濃度(ug/ml)
健康人2918. 9±816. 7
雙向情感障礙 2838±1219.4 精神分裂癥 3730 ±1493.0 重性抑郁 ll624. 8±459. 7本發(fā)明涉及用于容易診斷抑郁癥的技術。目前尚無用于抑郁癥的有效商品，抑郁癥完全依靠醫(yī)院的精神科醫(yī)生來診斷，對于抑郁癥患者而言，不可能在不進行定期心理咨詢且沒有顯著軀體癥狀的情況下在其早期診斷抑郁癥。本發(fā)明可通過簡單的血液測試，而且能夠非常有效的在疾病進展前診斷疾病。具體而言，本發(fā)明的有試劑盒花費低廉且處理簡單，尤其是對于接受醫(yī)學測試或咨詢醫(yī)生的抑郁癥患者而言，只需調整使用96孔板的ELISA法就能夠大量測試。同樣，通過使用免疫化學方法，本發(fā)明的準確性和精確性好?？傊?，本發(fā)明 有效的在其篩選和早期診斷中診斷抑郁癥，而且有助于潛伏期患者來確定藥物治療時間，從而延緩疾病發(fā)展。
權利要求
1.一種用于檢測抑郁癥的試劑盒，包括封閉液、酶標抗體、酶底物溶液、終止液和酶標板，其特征在于還包括PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白質片段，和與PEDF蛋白特異性結合的抗體，其中PEDF蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NOl。
2.根據權利要求I所述ー種用于檢測抑郁癥的試劑盒，其特征在于所述抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
3.權利要I所述PEDF蛋白或包含PEDF蛋白的蛋白質片段或與PEDF蛋白特異性結合的抗體在制備檢測抑郁癥的試劑盒中的應用，其中，正常、精神分裂癥、抑郁癥及雙向情感障礙血清中 PEDF 蛋白的平均值分別為 2918. 9ug/mL、3037. 8ug/mL、1624. 8ug/mL、2838ug/mL0
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體是一種用于檢測抑郁癥的試劑盒，包括封閉液、酶標抗體、酶底物溶液、終止液和酶標板、還包括PEDF蛋白或者包含PEDF蛋白的蛋白質片段，和與PEDF蛋白特異性結合的抗體，其中PEDF蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO1。本發(fā)明試劑盒可用于早期的抑郁癥患者，有助于潛伏期患者來確定藥物治療時間，從而延緩疾病發(fā)展，本發(fā)明試劑盒的準確性和精確性好。
文檔編號G01N33/68GK102788883SQ20121031362
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月30日 優(yōu)先權日2012年8月30日
發(fā)明者周嬋娟, 房亮, 楊涌濤, 詹遠, 謝鵬 申請人:重慶醫(yī)科大學