專利名稱：高通量篩選高效表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及高通量篩選高效表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法。
背景技術：
絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是纖維素酶、半纖維素酶的主要工業(yè)生產(chǎn)菌株，該菌是美國FDA認證的食品安全級的工業(yè)生產(chǎn)菌株，具有強大的蛋白分泌能力，某些突變株的外分泌蛋白量可達100g/L，并且具有與高等哺乳動物相似的糖基化系統(tǒng)，因此里氏木霉是一種非常理想的重組蛋白表達宿主，得到國際著名酶制劑公司(如Genencor、Novozymes等)高度重視,并成功應用于多種藥物、化學試劑以及酶試劑的表達和生產(chǎn)。同時，里氏木霉的發(fā)酵工藝成熟，發(fā)酵成本較低，為其投入工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎。近年來，隨著里氏木霉基因組學的快速發(fā)展以及其遺傳操作系統(tǒng)的不斷完善，利用里氏木霉表達異源蛋白也越來越受到重視。值得指出的是外源DNA片段多以非同源末端連接的途徑NHEJ (nonhomologousend-joining)整合入宿主基因組，呈隨機插入的形式。異源蛋白的表達框在基因組中的不同位置會直接影響到其表達水平。例如，若外源基因插入了沉默子的調(diào)控區(qū)可能直接導致其不能轉(zhuǎn)錄而表達失敗，如果外源基因插入增強子的可調(diào)控區(qū)域也可能使其表達量有大幅度的提高。另一個方面，外源基因進入基因組后，其在基因組中的拷貝數(shù)也是隨機的，而拷貝數(shù)本身也是影響表達量的一個重要因素。由于里氏木霉基因組信息的不完善以及其同源重組率的局限性，很難確定基因組中具體哪一個位置更有利于基因的表達，同時，對所有轉(zhuǎn)化子進行拷貝數(shù)鑒定本身也是十分繁瑣的工作。隨著里氏木霉遺傳操作體系的不斷優(yōu)化，其轉(zhuǎn)化效率已經(jīng)可以基本滿足人們的需要，但當?shù)玫酱罅康霓D(zhuǎn)化子，如何篩選目的蛋白高效表達的轉(zhuǎn)化子成了問題的關鍵。對于重組蛋白的異源表達，傳統(tǒng)的篩選手段只能是挑取大量的轉(zhuǎn)化子進行發(fā)酵后，對目的蛋白進行活性測定等方法進行篩選，這樣的方法比較繁瑣，需耗費大量的人力物力，而且從得到轉(zhuǎn)化子到篩選到高效表達的菌株周期也比較長。更重要的是，隨著轉(zhuǎn)化效率的不斷提高，用傳統(tǒng)的方法很難對所有的轉(zhuǎn)化子進行鑒定，這樣很容易把一些真正的高表達菌株遺漏掉。這就需要建立一種高通量的篩選方法。流式細胞儀技術(flow cytometry)是一種對處在液流中的單個細胞或其它生物顆粒等進行快速定量分析和分選的技術。流式細胞儀將流體噴射技術、激光技術、空氣技術、Y射線能譜術及電子計算機等技術與顯微熒光光度計密切結(jié)合的一種非常先進的檢測儀器，通過測量細胞及其他生物顆粒的散射光和標記熒光強度，來快速分析顆粒的物理或化學性質(zhì)，并可以對細胞進行分類收集，可以高速分析上萬個細胞，同時從一個細胞中測得多個細胞特征參數(shù)，進行定性或定量分析，具有速度快、精度高、準確性好等特點。2003年BD公司推出了世界上首款臺式高速多熒光檢測和分選的流式細胞儀FACS Aria，其主要用途是從細胞群中高速分選出被指定的細胞，其分選準確度高，速度快，可達到70000個/S。由于分選時間短，使分選到的細胞活性良好，并且它可以將細胞分選至流式細胞管、培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板(6孔板、24孔板及96孔板)，以便作進一步鑒定、功能研究或細胞培養(yǎng)。目前，流式細胞儀分選技術已廣泛應用于醫(yī)學研究，但其在絲狀真菌領域的應用較少。目前，國內(nèi)外尚沒有利用流式細胞儀分選技術高通量篩選高效表達重組蛋白的里氏木霉工程菌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個技術問題是提供一種鑒定或輔助鑒定高效表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法，包括如下步驟I)將紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5'端具有信號肽序列；所述連接肽2A序列編碼序列表中序列8的第290-306位所示的連接肽
2A ；2)制備融合基因表達盒和篩選標記基因表達盒以及含有所述融合基因表達盒和所述篩選標記基因表達盒的重組表達載體；3)用含有所述融合基因表達盒和所述篩選標記基因表達盒的重組表達載體轉(zhuǎn)化里氏木霉，得到轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子并將所有轉(zhuǎn)化子制備成原生質(zhì)體，收集所述轉(zhuǎn)化子的原生質(zhì)體細胞；4)用流式細胞儀對步驟3)的所述原生質(zhì)體進行分選，有紅色熒光的所述轉(zhuǎn)化子為表達外源蛋白的重組里氏木霉或候選表達外源蛋白的重組里氏木霉，無紅色熒光的所述轉(zhuǎn)化子為非表達外源蛋白的重組里氏木霉或候選非表達外源蛋白的重組里氏木霉。其中，表達盒是包含目的基因(所述融合基因或所述篩選標記基因)及其表達所必需的所有調(diào)控序列的單鏈或雙鏈核酸分子。所述調(diào)控序列在其相容條件下能指導編碼序列在合適的宿主細胞中表達目的基因。所述調(diào)控序列包括，但不限于，前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。為了導入載體的特定限制性酶位點以便將調(diào)控序列與目的基因的編碼區(qū)進行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，即可被表達核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導目的基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，可以得自編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細胞識別從而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。終止序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的3’末端。在所選宿主細胞中可發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。調(diào)控序列還可以是合適的前導序列，即對宿主細胞的翻譯十分重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列可操作連接于目的基因的5’末端。在所選宿主細胞中可發(fā)揮功能的任何前導序列均可用于本發(fā)明。在這些例子中，應將目的基因的核酸序列與調(diào)控序列可操作連接在一起。術語“可操作連接”在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于目的基因的適當位置，以使調(diào)控序列指導目的基因的表達。其中，2)中的含有所述融合基因表達盒和所述篩選標記基因表達盒的重組表達載體可以是一個重組表達載體也可以是兩個重組表達載體，即所述融合基因表達盒和所述篩選標記基因表達盒位于同一個重組表達載體中或所述融合基因表達盒位于一個重組表達載體中，所述篩選基因表達盒位于另一個重組表達載體中。上述所述篩選基因表達盒中的篩選標記基因是這樣一個基因，其產(chǎn)物賦予對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性，或賦予營養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等。細菌選擇標記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因,或者抗生素如氨節(jié)青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標記。在本發(fā)明的實施例中，所述篩選標記基因為pyr4，是營養(yǎng)選擇性標記基因乳清酸核苷-5'-單磷酸脫羧酶的基因。上述I)中的融合基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述融合基因具體可為由紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述連接肽2A序列的核苷酸序列為序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。該連接肽2A序
列是根據(jù)里氏木霉密碼子偏好性設計的。本申請的實驗證明，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游的融合基因比所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的下游的融合基因的外源蛋白表達量高。在本發(fā)明的一個實施例中，所述融合基因中所述外源蛋白基因具體為脂肪酶基因；所述脂肪酶基因編碼的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述紅色熒光蛋白基因編碼的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。所述融合基因的編碼序列具體可為B1-B3中的任一種BI、序列表中序列7的第1-1596位(SL2AR基因的編碼序列)；B2、序列表中序列7的第58位-1596位(L2AR基因的編碼序列)；B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位(R2AL的編碼序列)。本發(fā)明的實施例中，公開了兩個融合基因表達盒。一個融合基因表達盒從上游至下游依次由CBHl基因啟動子、CBHl基因信號肽序列、脂肪酶基因、連接肽序列、紅色熒光蛋白基因和CBHl基因終止子組成。其中，CBHl基因信號肽序列、脂肪酶基因、連接肽序列和紅色熒光蛋白基因組成融合基因SL2AR基因。SL2AR基因的編碼序列是序列表中的序列7的第1-1596位核苷酸，其中第1-51位為CBHl基因信號肽的編碼序列，52-57位為EcoRI識別序列，第58位-867位為脂肪酶的成熟蛋白編碼序列，第868-918位為連接肽2A的編碼序列，第919-1596位為紅色熒光蛋白的編碼序列。SL2AR基因編碼序列表中序列8的融合蛋白SL2AR。序列表中序列8的第1-17位為CBHl基因信號肽，第20-531位為融合蛋白SL2AR的成熟蛋白L2AR序列，第20-289位為脂肪酶的成熟蛋白序列，290-306位為連接肽2A，第307-531位為紅色熒光蛋白。CBHl基因啟動子的序列是序列I的第1-1912位，CBHl基因終止子(Tcbhl)的序列如序列表中序列3所不。另一個融合基因表達盒從上游至下游依次由CBHl基因啟動子、紅色熒光蛋白基因、連接肽序列、脂肪酶信號肽序列、脂肪酶基因和CBHl基因終止子組成。其中，紅色熒光蛋白基因、連接肽序列、脂肪酶信號肽序列和脂肪酶基因組成融合基因R2AL基因。R2AL基因的編碼序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位為紅色熒光蛋白基因，第685-735位為連接肽2A序列，第736-1629位為帶信號肽的脂肪酶基因，其中第736-816為脂肪酶自身信號肽序列，第817-1629位成熟的脂肪酶基因。R2AL編碼的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位為紅色熒光蛋白序列，第226-242位為連接肽2A序列，第243-269為脂肪酶自身信號肽序列，第270-539位為脂肪酶的成熟蛋白序列。CBHl基因啟動子的序列是序列表中的序列2，CBHl基因終止子(Tcbhl)的序列如序列表中序列3所示。上述鑒定或輔助鑒定表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法可用于篩選高表達外源蛋白的重組里氏木霉。本發(fā)明還提供了一種具體的篩選高表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法。本發(fā)明所提供的篩選高表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法，包括如下步驟t匕較經(jīng)上述任一種方法鑒定的表達外源蛋白的重組里氏木霉的紅色熒光強度，根據(jù)紅色熒光強度的高低鑒定外源蛋白的表達能力，紅色熒光強度越高的表達外源蛋白的重組里氏木霉的外源蛋白表達能力越聞。本發(fā)明的實驗證明，融合基因中的連接肽2A序列可使紅色熒光蛋白和目標外源蛋白這兩個蛋白等量(I: I)表達并獨立存在，具有信號肽的外源蛋白(脂肪酶)可以有效分泌到胞外，而缺乏信號肽的紅色熒光蛋白留在胞內(nèi)，紅色熒光強度越高的表達外源蛋白的重組里氏木霉的外源蛋白表達能力越高。本發(fā)明的實驗證明紅色熒光蛋白的熒光強度可以很好地表征外源蛋白的表達量，細胞內(nèi)紅色熒光蛋白的熒光強度和發(fā)酵液中外源蛋白的分泌量呈正相關。本發(fā)明還涉及下述任一種與上述融合基因相關的生物材料I)由上述融合基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子；2)含有上述融合基因的重組載體、重組細胞或重組微生物；3)含有I)所述RNA分子的重組載體、重組細胞或重組微生物；4)由上述融合基因編碼的蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為A1-A4中的任一種Al、序列表中的序列8 (帶脂肪酶信號肽的前體蛋白SL2AR序列)；A2、序列表中的序列8第20-531位(SL2AR的成熟蛋白L2AR序列)；A3、序列表中的序列6 (帶脂肪酶信號肽的前體蛋白R2AL序列)A4、將序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列(將R2AL中的脂肪酶信號肽去掉得到的成熟蛋白)。在本發(fā)明的一個實施例中，含有上述融合基因的重組微生物具體為里氏木霉(Trichoderma reesei)的菌株號為TRl 124,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6384。本發(fā)明可用于篩選高效表達外源蛋白的里氏木霉工程菌，本發(fā)明篩選到的一株表達脂肪酶的里氏木霉工程菌-里氏木霉(Trichoderma reesei)TR1124 CGMCC No. 6384其發(fā)酵上清液的脂肪酶酶活可達238IU/mL。菌種名稱里氏木霉拉丁名Trichodermareesei菌株編號TRl124保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號保藏日期2012年7月20日保藏中心登記入 冊編號CGMCC No. 638

圖I為質(zhì)粒pSKLR和pSKRL的結(jié)構(gòu)示意2為原生質(zhì)體的制備及紅色突光蛋白的誘導表達不意圖。圖3為紅色熒光蛋白和脂肪酶表達量的對應關系示意4為SDS-Page比較分析里氏木霉工程菌TRl 124、菌株TU6和NlO的發(fā)酵液上清。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。培養(yǎng)基、試劑I) 土豆培養(yǎng)基PDA (100ml) :20g去皮馬鈴薯，切碎，加入90mL水，煮沸30min，雙層紗布過濾，加入2g葡萄糖和I. 8g瓊脂粉，用水定容至lOOmL，115°C高壓蒸氣滅菌。2)基本培養(yǎng)基(Minimal medium, MM)組成溶劑為水,每升培養(yǎng)基中溶質(zhì)及其質(zhì)量為0. 05g (NH4)2SO4,0. 15g KH2PO4,0. 006g MgSO4,0. 006g CaCl2,0. 00005g FeSO4 ·7Η20，0. 000016g MnSO4 · H20,0. 000014g ZnSO4 · 7H20，0. 00002g CoCl203)發(fā)酵培養(yǎng)基在麗培養(yǎng)基中加入下列碳源(如1%纖維素、3%乳糖、1%木聚糖、2%葡萄糖、2%甘油，終濃度)之一，pH 5·2±0· I。Al、含I. OM山梨醇但不含尿苷的麗培養(yǎng)基平板(MM+山梨醇+2%葡萄糖):在ΜΜ+2%葡萄糖培養(yǎng)基中加入山梨醇至終濃度為I. 0Μ，再加入瓊脂制成固體培養(yǎng)基。Α2、ΜΜ+0. l%Triton XlOO的平板在含有2%葡萄糖的MM中加入Triton XlOO至體積終濃度為O. 1%，再加入瓊脂制成固體培養(yǎng)基。A3、含2%葡萄糖的麗液體培養(yǎng)基在麗中加入葡萄糖至終濃度為2% (質(zhì)量百分濃度)得到的液體培養(yǎng)基。A4、MM+1%微晶纖維素液體培養(yǎng)基在MM中加入微晶纖維素至終濃度為1% (質(zhì)量百分濃度)得到的液體培養(yǎng)基。4)LB培養(yǎng)基溶劑是水，每升培養(yǎng)基中溶質(zhì)及其質(zhì)量百分含量為1%蛋白胨，1%氯化鈉，O. 5%酵母提取物。5)里氏木霉染色體DNA提取緩沖液Tris. Cl pH 8. 5 200mMEDTA pH 8. O25mMNaCl250mMSDS2%
6)原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化相關試劑O. 2M 磷酸緩沖液 ρΗ7· 4 (每 IOOmL)O. 2Μ Na2HPO48 ImLO. 2Μ NaH2PO419mLI. 2mol/L 的 MgSO4 溶液MgSO4I. 2M磷酸緩沖液pH 7. 4 IOmMO. 6M的山梨醇溶液山梨醇O. 6MTris. Cl pH 7. OO. OlMI. OM的山梨醇溶液山梨醇I. OMCaCl2O. OlMTris. Cl pH 7. 5O. OlMPEG 溶液PEG400050%CaCl2O. 05MTris. Cl pH 7. 5O. OlM實施例I、高產(chǎn)異源脂肪酶的重組里氏木霉菌株的篩選本實施例篩選到了兩種轉(zhuǎn)化子，分別是pSKLR轉(zhuǎn)化子和pSKRL轉(zhuǎn)化子。I、紅色熒光蛋白與異源脂肪酶融合表達載體pSKLR和pSKRL的構(gòu)建I) PCR擴增纖維二糖水解酶I (CBHl)基因啟動子和信號肽片段PScbhl 以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株 QM9414 (ATCC 26921)基因組 DNA 為模板，Pcbhl-F，PScbhl-R為引物進行PCR擴增，擴增條件為95 °C預變性5min，94 °C變性30s，61. 1°C退火30s，72。。延伸2min,30個循環(huán)；最后72°C擴展延伸lOmin，擴增得到是含有cbhl基因信號肽的啟動子片段PScbhl。瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收目的條帶，連接至pEASY-Blunt simple載體,形成重組載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。挑取轉(zhuǎn)化子進行鑒定并抽提質(zhì)粒，進行測序，結(jié)果表明PScbhl的序列如序列表中序列I所示，序列I的第1-1912位為CBHl基因啟動子，第1913-1963位為CBHl基因信號肽序列。2) PCR擴增纖維二糖水解酶I (CBHl)基因啟動子Pcbhl 以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因組DNA為模板，Pcbhl-F，Pcbhl-R為引物進行PCR擴增，擴增條件為95°C預變性5min，94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最后72°C擴展延伸lOmin，擴增得到cbhl基因的啟動子片段Pcbhl。瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收目的條帶,連接至pEASY-Blunt simple載體,形成重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。挑取轉(zhuǎn)化子進行鑒定并抽提質(zhì)粒，進行測序，結(jié)果表明Pcbhl的序列如序列表中序列2所示。3) PCR擴增纖維二糖水解酶I (CBH1)基因終止子Tcbhl以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株QM9414(ATCC 26921)基因組DNA為模板，Tcbh I-F，Tcbhl-R為引物進行PCR擴增，擴增條件為95°C預變性5min，94°C變性30 s，60°C退火30s，72°C延伸2. 5min,30個循環(huán)；最后72°C擴展延伸lOmin，擴增得到cbhl基因的終止子片段Tcbhl。瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收目的條帶,連接至pEASY-Blunt simple載體，形成重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。挑取轉(zhuǎn)化子進行鑒定并抽提質(zhì)粒，進行測序，結(jié)果表明Tcbhl的序列如序列表中序列3所示。4)重疊延伸PCR擴增紅色熒光蛋白，2Α序列與脂肪酶基因的融合片段L2AR (月旨肪酶基因在上游，紅色熒光蛋白基因在下游)。第一輪PCR :以黑曲霉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，Iipase2a-F, Iipase2a-R為引物擴增含有連接肽2A序列和部分紅色熒光蛋白基因片段的脂肪酶基因片段。以質(zhì)粒pDsRed-Monomer-Nl (Clontech Catalog#6921_l)為模板，2ared-F，2ared-R為引物擴增含有2A序列和部分脂肪酶基因片段的紅色熒光蛋白基因。將這兩個片段進行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收試劑盒純化。第二輪PCR:將膠回收純化的兩個PCR產(chǎn)物等摩爾混合作為模板，Iipase2a-F，2ared_R為引物進行Overlap PCR擴增即可得到兩個基因融合的片段L2AR。將該片段克隆入pMDlSTsimple載體中進行測序。測序結(jié)果表明L2AR的核苷酸序列是序列表中序列4的第8-1547位，序列4的第8-818位為
脂肪酶基因，第819-869位為連接肽2A序列，第870-1547位為紅色熒光蛋白基因。5)重疊延伸PCR擴增紅色熒光蛋白，2A序列與脂肪酶基因的融合片段R2AL (紅色熒光蛋白基因在上游，脂肪酶基因在下游)。第一輪PCR :以質(zhì)粒pDsRed-Monomer-Nl為模板，2aRed-CF，2aRed-CR為引物擴增含有部分脂肪酶基因片段的紅色熒光蛋白(RFP)基因片段。以黑曲霉總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，2alp-cF，2alp-cR為引物擴增含有部分RFP基因片段的脂肪酶基因。將這兩個片段進行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收試劑盒純化。第二輪PCR:將膠回收純化的兩個PCR產(chǎn)物等摩爾混合作為模板，2aRed-CF，2alp-CR為引物進行PCR擴增即可得到兩個基因融合的片段R2AL。將該片段克隆入PMD18-T simple載體中進行測序。測序結(jié)果表明R2AL的核苷酸序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位為紅色熒光蛋白基因，第685-735位為連接肽2A序列，第736-1629位為脂肪酶基因，其中第736-816為脂肪酶自身信號肽序列。R2AL編碼的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位為紅色熒光蛋白序列，第226-242位為連接肽2A序列，第243-269為脂肪酶自身信號肽序列，第270-539位為脂肪酶的成熟蛋白序列。6)融合基因表達載體pSKRL和pSKLR的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶SalI和SpeI對質(zhì)粒pBluescript SK(+)(Stratagene, Catalog#212205)進行雙酶切，SalI，EcoRI 對 Pcbhl 片段和 PScbhl 進行雙酶切消化，EcoRI，SpeI對片段R2AL和L2AR進行雙酶切消化，分別將消化好的載體片段、Pcbhl片段、R2AL或載體片段、PScbhl片段、L2AR片段混合進行三片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，分別用引物2aRed-cF，2alp_cR和lipase2a_F，2ared_R引物對兩種轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR鑒定，挑取鑒定正確的克隆抽提質(zhì)粒命名為pPSKPRL和pPSKPLR。用限制性內(nèi)切酶SpeI和NotI酶切消化終止子片段Tcbhl以及質(zhì)粒載體pPSKPRL和pPSKPLR，并將酶切消化后的終止子片段分別與消化后的pPSKPRL和pPSKPLR進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，引物Tcbhl-F和Tcbhl-R對所得克隆進行菌落PCR鑒定，挑取鑒定正確的克隆抽提質(zhì)粒即為融合表達載體PSKRL和pSKLR(結(jié)構(gòu)見圖I)。所用到的引物見表I。pSKLR的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I中A所示，含有的融合基因表達盒由CBHl基因啟動子、CBHl基因信號肽序列、脂肪酶基因、連接肽基因、紅色熒光蛋白基因和CBHl基因終止子組成。CBHl基因啟動子、CBHl基因信號肽在圖中以PScbhl表示，脂肪酶基因以lipase表示，連接肽基因以2A表示，紅色熒光蛋白基因以DsRed表示，CBHl基因終止子以Tcbhl表示。pSKLR含有的將紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到融合基因是SL2AR基因(脂肪酶基因在上游，紅色熒光蛋白基因在下游)。SL2AR基因的編碼序列是序列表中的序列7的第1-1596位核苷酸，其中第1-51位為CBHl基因信號肽的編碼序列，52-57位為EcoRI識別序列，第58位-867位為脂肪酶的成熟蛋白編碼序列，第868-918位為連接肽2A的編碼序列，第919-1596位為紅色熒光蛋白的編碼序列。SL2AR基因編碼序列表中序列8的融合蛋白SL2AR。序列表中序列8的第1-17位為CBHl基因信號肽，第20-531位為融合蛋白SL2AR的成熟蛋白L2AR序列，第20-289位為脂肪酶的成熟蛋白序列，290-306位為連接肽2A，第307-531位為紅色熒光蛋白。pSKRL的結(jié)構(gòu)示意圖如圖I中B所示，含有的融合基因表達盒由CBHl基因啟動子、紅色熒光蛋白基因、連接肽基因、脂肪酶基因和CBHl基因終止子組成。CBHl基因啟動子在圖中以Pcbhl表不，脂肪酶基因以lipase表不，連接妝基因以2A表不，紅色突光蛋白基因
以DsRed表示，CBHl基因終止子以Tcbhl表示。pSKRL含有的將紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到融合基因是R2AL基因(脂肪酶基因在下游，紅色熒光蛋白基因在上游)。R2AL基因的編碼序列是序列表中序列5的第10-1629位，序列5的第10-684位為紅色熒光蛋白基因，第685-735位為連接肽2A序列，第736-1629位為帶信號肽的脂肪酶基因，其中第736-816為脂肪酶自身信號肽序列，第817-1629位成熟的脂肪酶基因。R2AL編碼的融合蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列6，序列6中，第1-225位為紅色熒光蛋白序列，第226-242位為連接肽2A序列，第243-269為脂肪酶自身信號肽序列，第270-539位為脂肪酶的成熟蛋白序列。表I :用于構(gòu)建重組載體的引物
權利要求
1.鑒定或輔助鑒定表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法，包括如下步驟 1)將紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到融合基因，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5'端具有信號肽序列；所述連接肽2A序列編碼序列表中序列8的第290-306位所示的連接肽2A ； 2)制備融合基因表達盒和篩選標記基因表達盒以及含有所述融合基因表達盒和所述篩選標記基因表達盒的重組表達載體； 3)用所述重組表達載體轉(zhuǎn)化里氏木霉，得到轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子并制備成原生質(zhì)體,收集所述轉(zhuǎn)化子的原生質(zhì)體細胞； 4)用流式細胞儀對步驟3)的所述原生質(zhì)體細胞進行分選，有紅色熒光的所述轉(zhuǎn)化子為表達外源蛋白的重組里氏木霉或候選表達外源蛋白的重組里氏木霉，無紅色熒光的所述轉(zhuǎn)化子為非表達外源蛋白的重組里氏木霉或候選非表達外源蛋白的重組里氏木霉。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述融合基因是權利要求6-8中任一所述的融合基因。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述融合基因表達盒由纖維二糖水解酶I基因的啟動子、纖維二糖水解酶I基因終止子和位于二者之間的所述融合基因組成，所述纖維二糖水解酶I基因的啟動子位于所述融合基因的上游。
4.權利要求1-3中任一所述的方法在篩選高表達外源蛋白的重組里氏木霉中的應用。
5.篩選高表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法，包括如下步驟比較經(jīng)權利要求1-3中任一所述方法鑒定的表達外源蛋白的重組里氏木霉的紅色熒光強度，根據(jù)紅色熒光強度的高低鑒定外源蛋白的表達能力，紅色熒光強度越高的表達外源蛋白的重組里氏木霉的外源蛋白表達能力越聞。
6.融合基因，是由紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到的DNA片段，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述連接肽2A序列的核苷酸序列為序列表中的序列7的第868-918位核苷酸。
7.根據(jù)權利要求6所述的融合基因，其特征在于所述外源蛋白基因為脂肪酶基因；所述脂肪酶基因編碼的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第20-289位，所述紅色熒光蛋白基因編碼的蛋白的氨基酸序列是序列表中序列8的第307-531位。
8.根據(jù)權利要求7所述的融合基因，其特征在于所述融合基因的編碼序列為B1-B3中的任一種 BI、序列表中序列7的第1-1596位； B2、序列表中序列7的第58位-1596位； B3、序列是序列表中序列5的第10-1629位。
9.下述任一種材料 O由權利要求6-8中任一所述的融合基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA分子； 2)含有權利要求6-8中任一所述的融合基因的重組載體、重組細胞或重組微生物； 3)含有I)所述RNA分子的重組載體、重組細胞或重組微生物； 4)由權利要求6-8中任一所述的融合基因編碼的蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為A1-A4中的任一種 Al、序列表中的序列8 ；A2、序列表中的序列8第20-531位； A3、序列表中的序列6 ； A4、將序列表中序列6的第243-269位缺失得到的序列。
10.里氏木霉(Trichoderma reesei),其特征在于所述里氏木霉(Trichodermareesei)的菌株號為TR1124，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No. 6384。
全文摘要
本發(fā)明公開了高通量篩選高效表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法。該高通量篩選高效表達外源蛋白的重組里氏木霉的方法包括如下步驟比較經(jīng)流式細胞儀鑒定的表達外源蛋白的重組里氏木霉的紅色熒光強度，根據(jù)紅色熒光強度的高低鑒定外源蛋白的表達能力，紅色熒光強度越高的表達外源蛋白的重組里氏木霉的外源蛋白表達能力越高。其中的外源蛋白基因以融合基因的形式導入里氏木霉，該融合基因是將紅色熒光蛋白基因通過連接肽2A序列與外源蛋白基因連接得到的融合基因，所述外源蛋白基因位于所述紅色熒光蛋白基因的上游或下游；所述外源蛋白基因的5′端具有信號肽序列；所述連接肽2A序列編碼序列表中序列8的第290-306位所示的連接肽2A。
文檔編號G01N15/14GK102876706SQ20121027182
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權日2012年8月1日
發(fā)明者董志揚, 秦麗娜 申請人:中國科學院微生物研究所