專利名稱：食品及加工品中蘿卜成分檢測試劑盒的制備和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物源性成分DNA檢測技術(shù)，具體地說是一種利用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)對食品加工品中植物源成分——蘿卜進(jìn)行快速篩選與檢測的試劑盒和方法，蘿
卜源成分快速檢測方法包括DNA的提取、實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和結(jié)果判定。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好。
背景技術(shù)：
蘿卜是一種具有辛辣氣味、質(zhì)脆味美的蔬菜。蘿卜和其他辛辣植物如蒜米、大蔥等形態(tài)差異大，分類上屬于不同植物科屬。根據(jù)形態(tài)很容易進(jìn)行鑒別，但食品在進(jìn)行加工處理后中，往往失去可鑒別的形態(tài)特征，為鑒別帶來不便。一些企業(yè)為了節(jié)約成本往往會(huì)以次 充好甚至摻雜相近成分，食品經(jīng)多次混合加工后消費(fèi)者難以目測辨別食品是否已摻加了蘿卜，降低消費(fèi)者的生活質(zhì)量?；ㄆ靺ⅰ⑷藚⒌戎兴幈＝∑泛退饷字破返仁称芳庸て分卸加幸?br> 似蘿卜摻假的報(bào)道，而且用蘿卜摻假后不易從感官判別，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益。食品中是否混有蘿卜源性成分，沒有一個(gè)公認(rèn)的判定方法或標(biāo)準(zhǔn)，消費(fèi)者的生活質(zhì)量難以保障。2010年，韓國駐華大使館向我國有關(guān)部門通報(bào)了我國輸韓蒜泥制品中存在摻雜蘿卜原料進(jìn)行加工的情況，出口韓國的蒜泥制品中有檢出蘿卜成分摻假，損害我國的國際聲譽(yù)。為保障消費(fèi)者權(quán)益維護(hù)我國的出口貿(mào)易聲譽(yù)，避免消費(fèi)市場繼續(xù)出現(xiàn)用蘿卜進(jìn)行摻假的情況，需要開發(fā)一種快速有效的檢測蘿卜的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對蘿卜orfB基因設(shè)計(jì)一組特異性引物，建立一種快速篩選和檢測蘿卜中基因成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，以克服基于外部形態(tài)或蛋白的檢測方法在食品加工產(chǎn)品檢測中的局限性，為食品中可能含蘿卜產(chǎn)品檢測提供有效工具。本發(fā)明的主要原理為設(shè)計(jì)一組可以特異地識別蘿卜序列的兩個(gè)引物和一個(gè)探針，完善檢測方法和實(shí)驗(yàn)體系通過實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)使靶DNA累積到IO9 101°拷貝，經(jīng)過熒光擴(kuò)增曲線Ct值判別擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明根據(jù)蘿卜的保守序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物和探針，成熟的實(shí)驗(yàn)體系可保證在蒜泥、食品保健品等食品加工制品中檢出蘿卜成分。使用該方法可靈敏、特異地檢出食品加工品中的蘿卜成分。該方法可以直接用熒光PCR觀察擴(kuò)增曲線進(jìn)行判讀，簡單而快速，特別適用于一些檢測一線的單位。本發(fā)明涉及的快速檢測蘿卜源性成分的試劑盒包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照DNA兩種特征性部分；反應(yīng)預(yù)混液Real time Mix 10 U L、10 U mol/L 上游引物 0. 5 U L、10 U mol/L 下游引物0.5111、10111]101/1探針1111和模板成分211 I,力口 ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25 y I ；實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測用的蘿卜引物和探針，其序列如下上游引物5，-TCACCTGGGCAirCITTC-3，；
下游引物5 ’ -CTGACTTCGTTCGTTAGAAG-3 ’ ；TaqMan 探針 5，-FAM-TCAATTACCGAGACCTGGACATACAA-TAMRA-3，。陽性對照DNA為含有蘿卜源性成分的DNA提取液。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測可能含有蘿卜成分的食品加工產(chǎn)品中蘿卜成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)(I)待檢樣品DNA的提取DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或等同采用相同提取方法的DNA提取試劑盒。(2) PCR 擴(kuò)增A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入 Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L 上游引物 0. 5 ii L、
10V- mol/L下游引物0. 5 ii L、10 ii mol/L探針I(yè) ii L、ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25 ii I,混勻；B.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA 2 ii L (約200ng)，混勻；C.在熒光PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)35-40個(gè)循環(huán)，程序?yàn)?40C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)結(jié)果檢測 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，得出Ct值和擴(kuò)增曲線。總體看曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)其明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線無上揚(yáng)現(xiàn)象，方由Ct值判斷結(jié)果。根據(jù)熒光信號的Ct值進(jìn)行判斷，當(dāng)待測樣品的基因檢測Ct值大于或等于45，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中未檢出蘿卜基因，樣品中不含有蘿卜源性成分。當(dāng)待測樣品的結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值小于或等于36，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中檢出蘿卜基因，樣品中含有蘿卜源性成分。當(dāng)待檢測樣品結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值大于36小于45，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，若重做后Ct值仍小于45，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中檢出蘿卜基因；若重做后Ct值大于45，且陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中未檢出蘿卜基因。


圖I用熒光定量PCR技術(shù)檢測某待測含蘿卜成分樣品DNA，樣品的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例I按照以下程序進(jìn)行檢測(I)待測可能含蘿卜成分樣品DNA的提取A.稱取0. Ig樣品，轉(zhuǎn)至I. 5mL離心管中。加入600 U L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ；B.在管中加入等體積酚/氯仿600 u L，上下顛倒充分混勻，抽提2min ；C. 12000g離心5min，吸取上清到一新的離心管中，加入與上清等體積的沉淀液，混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀；D.在沉淀中加入60 ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次；E.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ；F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加A 200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；G.在離心柱中加入200ii L70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次；H. 12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液；I.將離心柱放置在一個(gè)新的I. 5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。(2)待測含蘿卜成分食品加工混合樣品PCR擴(kuò)增A.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液Real time Mix 10 ii L、10 ii mol/L上游引物0. 5 u L、10 u mol/L下游引物0. 5 u L、10 u mol/L探針I(yè) u L、ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25iU，混勻；B.在擴(kuò)增反應(yīng)管中加入待檢樣品DNA 2 ii L (約200ng)，混勻；C.在熒光PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)35-40個(gè)循環(huán)程序?yàn)?40C 3min ； (94°C 15s ；58°C 30s ；) X35-40cycles ；(3)結(jié)果檢測實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，得出Ct值和擴(kuò)增曲線?？傮w看曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)其明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線無上揚(yáng)現(xiàn)象，由Ct值判斷結(jié)果。根據(jù)熒光信號的Ct值進(jìn)行判斷，待測樣品的結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值位于28，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判斷為樣品中檢出蘿卜基因。
權(quán)利要求
1.快速檢測蘿卜源性成分的試劑盒包括PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陽性對照DNA兩種特征性部分；反應(yīng)預(yù)混液Real time Mix 10 y L、10 y mol/L上游引物0. 5 y L、10 y mol/L下游引物0.L、10ii mol/L探針I(yè) U L和模板成分I,加ddH20(滅菌雙蒸水)補(bǔ)足至25 U I ； 上下游引物及探針序列 上游引物 5 ’ -TCACCTGGGCATTCTTTC-3，； 下游引物 5’ -CTGACTTCGITCGTTAGAAG-3’ ；TaqMan 探針 5’ -FAM-TCAATTACCGAGACCTGGACATACAA-TAMRA-3’。
陽性對照DNA為含有蘿卜源性成分的DNA提取液。
2.蘿卜成分快速檢測方法包括食品DNA的提取、實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增和結(jié)果判定。
其中食品DNA提取 A.稱取0.lg-0. 2g樣品，轉(zhuǎn)至I. 5mL離心管中。加入600 y L預(yù)熱的裂解緩沖液，輕輕混勻后，65°C水浴保溫IOmin ； B.在管中加入等體積酚/氯仿600yL，上下顛倒充分混勻，抽提2min ； C.12000g離心5min,吸取上清到一新的離心管中,加入與上清等體積的沉淀液,混勻，常溫放置IOmin后，12000g離心5min,去上清,保留沉淀； D.在沉淀中加入60ii L RNA酶，37°C放置2min后，用槍頭將其充分混勻，于37°C溶解沉淀，5min后加入300 u L緩沖液,上下顛倒混勻10次； E.取出離心柱，將離心柱放置在I個(gè)2mL的套管上，將溶液加入到離心柱中，放置2min ； F.將離心柱和2mL套管一起用8000g離心30sec，棄去套管中溶液，在離心柱中加入·200 u L洗液，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次； G.在離心柱中加入200ii L 70%乙醇，8000g離心30sec，棄去溶液；重復(fù)此步驟一次； H.12000g離心30sec，除去離心柱中痕量殘留溶液； I.將離心柱放置在一個(gè)新的I.5mL離心管中，在離心柱底部中央加入50 ii L洗脫緩沖液，37°C放置2min后，12000g離心30sec。離心管中的溶液即可用作PCR反應(yīng)的模板。
實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 在熒光PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)35-40個(gè)循環(huán)，程序?yàn)?40C 3min ； (94°C 30s ；58°C 30s) X35-40cycles ； 結(jié)果判定 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，得出Ct值和擴(kuò)增曲線?？傮w看曲線拐點(diǎn)清楚，指數(shù)其明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線無上揚(yáng)現(xiàn)象，方由Ct值判斷結(jié)果。
當(dāng)待測樣品的基因檢測Ct值大于或等于45，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中未檢出蘿卜基因，樣品中不含有蘿卜源性成分。
當(dāng)待測樣品的結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值小于或等于36，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中檢出蘿卜基因，樣品中含有蘿卜源性成分。
當(dāng)待檢測樣品結(jié)構(gòu)特異性基因檢測Ct值大于36小于45，應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，若重做后Ct值仍小于45，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中檢出蘿卜基因；若重做后Ct值大于45，且陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則可判斷為樣品中未檢出蘿卜基因。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品及其加工品的植物源成分——蘿卜源性成分的快速篩查與檢測的技術(shù)和試劑盒，具體是使用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測食品中蘿卜的物種特異性基因orfB的物種特異性片段。本發(fā)明針對orfB基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，快速、靈敏、特異地檢測orfB基因，從而篩選產(chǎn)品中是否含蘿卜源成分。該快速篩查試劑盒和檢測技術(shù)用于檢測混合樣品中可能混有的蘿卜成分，可以對可疑摻假或摻雜的含蘿卜的樣品進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該方法快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好。
文檔編號G01N21/64GK102758019SQ201210268330
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者劉彩霞, 孫敏, 徐彪, 梁成珠, 高宏偉, 龔方 申請人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心