專利名稱：高靈敏度的免疫色譜方法以及免疫色譜用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用了標記抗體的免疫色譜方法以及免疫色譜用試劑盒。
背景技術(shù)：
作為測定被檢液中的特定成分的方法，存在許多利用了抗原抗體反應(yīng)的免疫測定方法。在免疫測定方法中，抗體或抗原與待測定的特定成分的非特異性反應(yīng)常常是個問題。因此，通常采用使用封閉劑來抑制非特異性反應(yīng)的方法。作為使用了封閉劑的非特異反應(yīng)抑制法，例如在ELISA的情況下將反應(yīng)容器使用封閉劑進行處理，在膠乳凝聚法的情況下將膠乳粒子使用封閉劑進行處理(專利文獻I)。作為封閉劑，使用牛血清白蛋白(以下簡稱為BSA)、酪蛋白、明膠等。另外，在專利文獻2中記載了如下內(nèi)容通過使用在EIA體系中在pH為7. 2的條 件下在100°C下進行了 30分鐘熱處理而得到的酪蛋白，能制作抑制非特異反應(yīng)的載體。此夕卜，在專利文獻3中公開了如下內(nèi)容通過在要進行免疫測定的反應(yīng)液中添加用蛋白酶分解至分子量約為1000 26000而得到的酪蛋白來抑制非特異反應(yīng)。在免疫測定方法中，免疫色譜法由于操作簡便、能在短時間內(nèi)進行測定，因此很常用。作為免疫色譜法中使用的免疫反應(yīng)，廣泛使用競爭型反應(yīng)或三明治型反應(yīng)。其中，在免疫色譜法中三明治型反應(yīng)是主流，在其典型例子中，為了檢測試樣中的由抗原構(gòu)成的被檢物質(zhì)而進行如下操作。首先，通過將利用針對作為被檢物質(zhì)的抗原的抗體而致敏得到的微粒作為固相微粒固定于色譜載體，或者通過將該抗體本身直接固定于色譜載體，從而制備具有反應(yīng)部位的色譜載體。另一方面，使標記微粒被能與被檢物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體致敏來制備致敏標記微粒。使該致敏標記微粒與試樣一起在色譜載體上進行色譜移動。通過以上的操作，在形成于色譜載體的反應(yīng)部位上，被固定的抗體成為固定試劑，致敏標記微粒通過作為被檢物質(zhì)的抗原而與其特異性結(jié)合，其結(jié)果是，通過目視判斷因致敏標記微粒被反應(yīng)部位捕捉而產(chǎn)生的信號的有無或程度，即可測定試樣中的被檢物質(zhì)的存在的有無或量。另外，在免疫色譜法中，為了抑制非特異吸附，通常在檢體稀釋液中添加蛋白質(zhì)等封閉劑(專利文獻4)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻I :日本特開平6-313766號公報專利文獻2 日本特開平6-194366號公報專利文獻3 日本特開平2-36353號公報專利文獻4 :日本特表2004-503248號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的技術(shù)問題在免疫色譜法中，為了避免因靈敏度低而檢測不出作為被檢物質(zhì)的抗原(假陰性)的問題，有時采用使檢測信號放大的方法。作為信號放大的方法，有時使用堿性磷酸酶、過氧化酶等酶作為標記，還有時通過對選自金屬膠體標記以及金屬硫化物標記中的標記使用含銀化合物以及銀離子用還原劑進行敏化(銀放大)來進行檢測。但是當使用了這些放大法時，有時會產(chǎn)生下述問題如果非特異性吸附于檢測部位的標記被敏化，則雖然不存在作為被檢物質(zhì)的抗原但卻檢測出信號(假陽性)。特別是在進行信號放大的免疫色譜法中，即使是以往不會成為問題那樣少的量的非特異吸附也會引發(fā)假陽性的問題。另外，在免疫色譜法中，為了抑制非特異吸附，通常在檢體稀釋液中添加蛋白質(zhì)等封閉劑(專利文獻4)，但并沒有對于這種少量的非特異吸附有效的物質(zhì)。另外，特別是在使用了銀放大的免疫色譜法中，在使用了金屬膠體標記物質(zhì)和金屬硫化物標記物質(zhì)的免疫色譜用檢測條上滴加檢體并使其展開后，需要(I)使還原劑溶液展開、(2)滴加含銀溶液(銀放大液)?？紤]到銀離子的穩(wěn)定性以及放大活性，銀放大液通常以酸性為宜。但是，蛋白質(zhì)多數(shù)會在酸性條件下析出，因此如果在銀放大液中添加蛋白質(zhì)，則蛋白質(zhì)會析出。因此，當在檢體稀釋液中添加了蛋白質(zhì)時，在酸性條件下蛋白質(zhì)會在膜中凝聚而處處妨礙液體的流動，因此在放大后會形成斑。放大斑有時無法與檢測部位的 顯色區(qū)別開來，因此還會形成假陽性，是個嚴重的問題。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種免疫色譜方法，該免疫色譜方法通過在免疫色譜方法中將信號放大時抑制假陽性的產(chǎn)生而能進行高靈敏度且假陽性得以降低的檢測。用于解決技術(shù)問題的手段本發(fā)明人為了解決上述技術(shù)問題而進行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過在酪蛋白等蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下進行免疫反應(yīng)，能抑制標記的非特異吸附，從而抑制放大后的假陽性。根據(jù)本發(fā)明，可提供一種免疫色譜方法，其包含在形成了被檢物質(zhì)與用針對被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，將所述復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開；在不溶性載體上的檢測部位捕捉被檢物質(zhì)和標記物質(zhì)，所述不溶性載體含有針對所述被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或?qū)︶槍Ρ粰z物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)；將捕捉到的標記物質(zhì)放大來檢測該被檢物質(zhì)。優(yōu)選蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的分子量的范圍為O. IkD 15kD。優(yōu)選蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物是在酸性條件下不存在作為不溶成分的析出物的分解物。 優(yōu)選蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物是通過在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物中添加酸以使pH為4以下、并除去所析出的析出物而得到的蛋白質(zhì)分解物。優(yōu)選蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物是酪蛋白的蛋白酶分解物。優(yōu)選作為蛋白質(zhì)使用的酪蛋白是選自aSl酪蛋白、aS2酪蛋白、β酪蛋白、或K酪蛋白中的I種以上的酪蛋白。優(yōu)選酪蛋白的蛋白酶分解物中含有來自aSl酪蛋白的肽序列(YLGYLEQLLR、FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNNLLR)、來自a S2酪蛋白的肽序列(FALPQYLK)、來自β酪蛋白的肽序列(AVPYPQR、YPVEPFTER)、來自κ酪蛋白的肽序列(YIPIQYVLSR)中的至少I種以上。優(yōu)選不溶性載體是多孔性載體。
優(yōu)選含有金屬的標記物質(zhì)是金屬膠體。優(yōu)選金屬膠體是金膠體。優(yōu)選第一結(jié)合物質(zhì)和第二結(jié)合物質(zhì)中的至少任一方為抗體。優(yōu)選使用包含含銀化合物以及銀離子用還原劑的放大液來進行將捕捉到的標記物質(zhì)放大的工序。優(yōu)選在形成了被檢物質(zhì)與用針對被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，將所述復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開后，將洗滌液在不溶性載體上展開，然后將捕捉到的標記物質(zhì)放大。優(yōu)選對在檢測時具有平均粒子大小為I μ m以上且20 μ m以下的大小的標記物質(zhì)進行檢測?；蛘撸鶕?jù)本發(fā)明，可提供一種免疫色譜用試劑盒，其具備用針對被檢物質(zhì)的第 一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)；以及含有針對被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或?qū)︶槍Ρ粰z物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)的不溶性載體。優(yōu)選第一結(jié)合物質(zhì)和第二結(jié)合物質(zhì)中的至少任一方為抗體。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，能在免疫色譜方法的銀放大中抑制放大后的假陽性，能進行明確且高靈敏度的測定。


圖I是示意地表示第I不溶性載體(免疫色譜用檢測條)的一個方式的俯視圖。圖2是表示圖I中所示的第I不溶性載體(免疫色譜用檢測條)的一個方式的縱截面的示意圖。在圖I和圖2中，I表示背面粘著片，2表示標記物質(zhì)保持墊，3表示色譜載體(抗體固定膜)，3a表示捕捉部位，31表示檢測部位，32表示對照部位，4表示吸收墊，5表示試樣添加墊，10表示免疫色譜用檢測條。含有被檢物質(zhì)的被檢試樣在色譜載體上展開的方向用箭頭A表示。在本發(fā)明中，將箭頭A的根部方向定義為上游，將箭頭A的前端方向定義為下游。圖3示意地表示能在本發(fā)明中使用的免疫色譜試劑盒的一個方式。51表示圖I和圖2中所示的第I不溶性載體(免疫色譜用檢測條)，52表示液體儲藏器，53表示第2不溶性載體(洗滌液添加墊)，54表示第3不溶性載體，55表示第I設(shè)備零件，56表示第2設(shè)備零件，57表示滴加孔。
具體實施例方式下面，更詳細地說明本發(fā)明。本發(fā)明的免疫色譜方法中，在形成了被檢物質(zhì)與用針對該被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，將所述復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開。作為將上述復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開的方法，只要是在流過含有被檢物質(zhì)的被檢試樣時蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物與含有被檢物質(zhì)的被檢試樣一起流動的方法即可。作為使用方式，可舉出使包含含有被檢物質(zhì)的被檢試樣和蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的溶液在不溶性載體上展開的方法等。蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的分子量的范圍優(yōu)選為O. IkD 15kD，特別優(yōu)選為IkD 15kD。作為蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的分子量及其含有率的測定方法，可以通過如下方法等來測定利用本領(lǐng)域常用的凝膠電泳法將蛋白質(zhì)按分子量進行分離，用染色液進行染色，拍攝其被染色后的條帶，求出濃度的積分值。本發(fā)明中的蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的分子量的范圍是指使用上述那樣的方法求出分子量和含有率、包含總蛋白質(zhì)量中50%以上的分子量的范圍。當使用了蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物時，由于分子量變小，即使在酸性條件下也不易析出，但產(chǎn)生的析出物可能會成為放大后的斑的成因。在本發(fā)明中，優(yōu)選事先除去蛋白質(zhì)分解物中含有的酸性條件下的不溶成分。即，作為本發(fā)明中使用的蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物，優(yōu)選為在酸性條件下實質(zhì)上不會析出不溶成分的分解物，更優(yōu)選為在20°C的pH為4的水溶液中在lg/5ml的濃度下不會析出不溶成分的分解物。例如，可將通過在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物中添加酸以使PH為4以下并除去析出物而得到的、除去了酸不溶物的蛋白質(zhì)分解物用作蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物。關(guān)于析出物的除去，可選擇傾析、超離心、過濾器過濾等方法?！りP(guān)于蛋白質(zhì)的種類，為了實現(xiàn)本發(fā)明的效果，優(yōu)選使用酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白等，可更優(yōu)選使用酪蛋白。關(guān)于本發(fā)明中使用的酪蛋白的種類，優(yōu)選使用選自α SI酪蛋白、aS2酪蛋白、β酪蛋白、或K酪蛋白中的I種以上的酪蛋白。作為本發(fā)明中使用的酪蛋白的蛋白酶分解物，例如可使用含有來自a SI酪蛋白的肽序列(YLGYLEQLLR、FFVAPFPEVFGK、HQGLPQEVLNNLLR)、來自 a S2 酪蛋白的肽序列(FALPQYLK)、來自β酪蛋白的肽序列(AVPYPQR、YPVEPFTER)、來自κ酪蛋白的肽序列(YIPIQYVLSR)中的至少I種的蛋白酶分解物。I.色譜通常，色譜方法是用如下所述那樣的方法簡便、迅速且特異性地判斷和測定被檢物質(zhì)的方法。即將含有能與被檢物質(zhì)結(jié)合的第二結(jié)合物質(zhì)即固定試劑(抗體、抗原等)的具有至少I個反應(yīng)部位的色譜載體(不溶性載體)用作固定相。在該色譜載體上，將分散有被作為能與被檢物質(zhì)結(jié)合的第一結(jié)合物質(zhì)的試劑修飾過的標記物質(zhì)的分散液作為流動相，使其在色譜載體中進行色譜移動的同時，被檢物質(zhì)與標記物質(zhì)特異性地結(jié)合并到達反應(yīng)部位。該方法是在反應(yīng)部位通過被檢物質(zhì)和標記物質(zhì)的復合體與固定試劑特異性地結(jié)合，只有當被檢試樣中存在被檢物質(zhì)時、標記物質(zhì)才會在固定試劑部位濃縮，利用這點，通過目視或使用適當?shù)膬x器對被檢試樣中是否存在被檢物質(zhì)進行定性和定量的分析。進行本發(fā)明中的色譜方法的試劑盒或裝置優(yōu)選內(nèi)置含銀化合物和銀離子用還原齊U，通過以結(jié)合于固定試劑的被檢物質(zhì)與標記物質(zhì)的復合體為核進行放大反應(yīng)，可將信號放大，其結(jié)果是能實現(xiàn)高靈敏度。根據(jù)本發(fā)明，可進行迅速且高靈敏度的色譜。2.被檢試樣作為能用本發(fā)明的色譜方法進行分析的被檢試樣，只要是有可能含有被檢物質(zhì)的試樣即可，沒有特殊限制，例如可舉出生物學試樣、特別是動物(尤其是人)的體液(例如血液、血清、血漿、骨髓液、淚液、汗、尿、膿、鼻水或痰)或排泄物(例如糞便)、臟器、組織、粘膜和皮膚、認為含有它們的擦拭檢體(拭子swab)、漱口液、或者動植物本身或它們的干燥體。3.被檢試樣的前處理在本發(fā)明的色譜方法中，可直接使用上述被檢試樣，或者可以以使用適當?shù)奶崛∮萌軇┨崛”粰z試樣而得到的提取液的形式來使用、進而以使用適當?shù)南♂寗┫♂屘崛∫憾玫降南♂屢旱男问絹硎褂?、或以使用適當?shù)姆椒▽⑻崛∫簼饪s后的形式來使用。作為提取用溶劑，還可使用普通的免疫學分析法中使用的溶劑(例如水、生理鹽水或緩沖液等)、或者通過用溶劑進行稀釋即可直接實施抗原抗體反應(yīng)的水混合性有機溶劑。4.構(gòu)成作為能在本發(fā)明的色譜方法中使用的色譜用檢測條，例如可以如圖I、圖2所示那樣，沿被檢試樣展開的方向(圖I中A箭頭的方向)在背面粘著片上依次配置試樣添加墊、標記物質(zhì)保持墊(例如金膠體抗體保持墊)、色譜載體(不溶性載體、例如抗體固定膜)以 及吸收墊。色譜載體具有捕捉部位，具有固定了與分析對象物特異性結(jié)合的抗體或抗原的區(qū)域即檢測部位(有時也記為檢測區(qū)域)，可以根據(jù)需要進一步具有固定了對照用抗體或抗原的區(qū)域即對照部位(有時也記為對照區(qū)域)。標記物質(zhì)保持墊可如下來制備制備含有標記物質(zhì)的懸浮液，將該懸浮液涂布在適當?shù)奈諌|(例如玻璃纖維墊)后將其干燥。作為試樣添加墊，本發(fā)明中可優(yōu)選使用玻璃纖維墊。4-1.標記物質(zhì)關(guān)于本發(fā)明中使用的標記物質(zhì)，作為用于標記與被檢物質(zhì)(抗原)特異性結(jié)合的第一結(jié)合物質(zhì)的標記，可使用含有金屬的標記物質(zhì)。作為能在本發(fā)明中使用的金屬的種類，可優(yōu)選使用貴金屬金、銀、鉬或者鐵、鉛、銅、鎘、鉍、銻、錫或汞，可更優(yōu)選使用貴金屬金、銀、鉬。作為能在本發(fā)明中使用的含有金屬的標記物質(zhì)的優(yōu)選方式，可使用金屬膠體標記或金屬硫化物標記。在本發(fā)明中，作為金屬膠體標記，可優(yōu)選使用鉬膠體、金膠體、銀膠體、鐵膠體或氫氧化鋁膠體等，作為金屬硫化物標記，可優(yōu)選使用鐵、銀、鉛、銅、鎘、鉍、銻、錫或汞的各硫化物。在本發(fā)明中可更優(yōu)選使用鉬膠體、金膠體、銀膠體。在本發(fā)明的免疫色譜法中，可將這些金屬膠體標記和/或金屬硫化物標記中的I種或更多種用作標記。關(guān)于金屬膠體與特異結(jié)合物質(zhì)的結(jié)合，可按照以往公知的方法(例如The Journal of Histochemistryand Cytochemistry, Vol. 30, No. 7, pp691-696, (1982))來進行。4-2.結(jié)合物質(zhì)在本發(fā)明中，標記物質(zhì)使用針對檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)來修飾。關(guān)于第一結(jié)合物質(zhì)，例如可使用針對被檢物質(zhì)(抗原)的抗體、針對被檢物質(zhì)(抗體)的抗原、針對被檢物質(zhì)(蛋白質(zhì)、低分子化合物等)的適配體等對被檢物質(zhì)具有親和性的化合物等。在本發(fā)明中，不溶性載體具有(a)針對被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或(b)對第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)。關(guān)于針對該被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)，例如可使用針對該被檢物質(zhì)(抗原)的抗體、針對該被檢物質(zhì)(抗體)的抗原、針對該被檢物質(zhì)(蛋白質(zhì)、低分子化合物等)的適配體等對該被檢物質(zhì)具有親和性的化合物。另外，第二結(jié)合物質(zhì)和第一結(jié)合物質(zhì)可以使用不同的物質(zhì)，也可以使用相同的物質(zhì)。關(guān)于對針對被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)，可以是被檢物質(zhì)本身，也可以是具有識別第一結(jié)合物質(zhì)的部位的化合物，例如使被檢物質(zhì)的衍生物與蛋白質(zhì)(例如BSA等)結(jié)合而得到的化合物等即屬于此。
在本發(fā)明中，優(yōu)選第一結(jié)合物質(zhì)和第二結(jié)合物質(zhì)中的至少任一方為抗體。在本發(fā)明的免疫色譜方法中，作為對被檢物質(zhì)具有特異性的抗體，可優(yōu)選使用由被該被檢物質(zhì)免疫后的動物的血清制備的抗血清、由抗血清精制得到的免疫球蛋白級分、通過使用被其分析對象物免疫后的動物的脾臟細胞的細胞融合而得到的單克隆抗體、或者它們的片段[例如F(ab’)2、Fab、Fab’或Fv]。這些抗體的制備可通過常規(guī)方法來進行。4-3.色譜載體(抗體固定膜)作為色譜載體，可使用不溶性載體，其中優(yōu)選多孔性載體?？商貏e優(yōu)選使用硝化纖維素膜、纖維素膜、乙酸纖維素膜、聚砜膜、聚醚砜膜、尼龍膜、玻璃纖維、無紡布、布或紗等。通常使固定試劑固定在色譜載體的一部分來制作檢測部位。固定試劑可以通過物理或化學的結(jié)合來直接固定于色譜載體的一部分，也可以使固定試劑與膠乳粒子等微粒發(fā)生物理或化學的結(jié)合后使該微粒被色譜載體的一部分捕獲來進行固定。另外，色譜載體優(yōu)選在固定試劑固定后通過利用惰性蛋白的處理等進行防非特異性吸附處理后使用。
4-4.試樣添加墊試樣添加墊的材質(zhì)可舉出纖維素濾紙、玻璃纖維、聚氨酯、聚醋酯纖維、乙酸纖維素、尼龍以及棉布等具有均勻特性的材質(zhì)，但不限于這些。試樣添加部不僅收納被添加的含有被檢物質(zhì)的被檢試樣，還兼具將試樣中的不溶物粒子等過濾的功能。另外，為了防止在分析時試樣中的被檢物質(zhì)非特異性地吸附于被檢試樣添加部的材質(zhì)而使分析的精度降低，構(gòu)成試樣添加部的材質(zhì)有時事先進行防非特異性吸附處理后使用。4-5.標記物質(zhì)保持墊作為標記物質(zhì)保持墊的材料，例如可舉出纖維素濾紙、玻璃纖維以及無紡布等，通過浸潰一定量的如前所述那樣制備的標記物質(zhì)并使其干燥來制作。4-6.吸收墊 吸收墊是在通過色譜移動而物理性地吸收被添加的試樣的同時、將未能在色譜載體的檢測部不溶化的未反應(yīng)標記物質(zhì)等吸收除去的部位，可以使用纖維素濾紙、無紡布、布、乙酸纖維素等吸水性材料。被添加的試樣的色譜頂端部到達吸收部后的色譜的速度根據(jù)吸收材料的材質(zhì)、大小等而各異，因此通過選擇吸收材料，可設(shè)定適合于被檢物質(zhì)測定的速度。5.免疫檢查的方法下面，關(guān)于本發(fā)明的色譜方法，對作為其具體實施方式
的三明治法進行說明。三明治法沒有特殊限制，例如可按照以下的步驟來實施被檢物質(zhì)的分析。首先，通過先前4-2中所述的方法事先制備對被檢物質(zhì)(抗原)具有特異性的第I抗體和第2抗體。另外，使用4-1或4-2中所述的方法將第I抗體事先進行標記。將第2抗體固定在適當?shù)牡谝徊蝗苄暂d體(例如硝化纖維素膜、玻璃纖維膜、尼龍膜或纖維素膜等)上，使其與有可能含有被檢物質(zhì)(抗原)的被檢試樣(或其提取液)接觸，當在該被檢試樣中存在被檢物質(zhì)時，可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。該抗原抗體反應(yīng)可與普通的抗原抗體反應(yīng)同樣地來進行。如果在抗原抗體反應(yīng)的同時或反應(yīng)后，進一步與過量的標記第I抗體接觸，則當被檢試樣中存在被檢物質(zhì)時，會形成由固定第2抗體、被檢物質(zhì)(抗原)和標記第I抗體構(gòu)成的免疫復合體。在三明治法中，通過在固定第2抗體與被檢物質(zhì)(抗原)與第I抗體的反應(yīng)結(jié)束后除去未形成上述免疫復合體的標記第I抗體，接著對第I不溶性載體中固定了固定第2抗體的區(qū)域進行第一光學濃度測定來對標記物進行定量，即可測定被檢試樣中的被檢物質(zhì)的量。接著，通過提供金屬離子和還原劑，將來自形成了上述免疫復合體的標記第I抗體的標記的信號進行放大，然后通過進行第二光學濃度測定，對放大后的標記物質(zhì)進行定量，即可測定被檢試樣中的被檢物質(zhì)的量。6.洗滌在本發(fā)明中，還可以在形成了被檢物質(zhì)與用針對該被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開后，在不溶性載體上展開洗滌液，然后將捕捉到的標記物質(zhì)進行放大。(洗滌液)用于除去未形成上述免疫復合體的標記抗體的洗滌液只要具有洗滌的功能可以是任意的洗漆液。 關(guān)于洗滌液，只要是用于洗滌特異性結(jié)合反應(yīng)以外殘留在色譜載體內(nèi)的、S卩非特異性殘留的標記物質(zhì)的液體即可，沒有特殊限制，可以單獨僅是水或乙醇等溶劑，也可使用例如含I質(zhì)量％的BSA的PBS緩沖液或表面活性劑等的溶液等。另外，作為洗滌液，還可使用后述的含有銀離子的液體、含有銀離子的還原劑的液體。另外，洗滌液由于在展開途中一邊洗滌非特異性殘留的標記物質(zhì)一邊展開，因此在含有標記物質(zhì)的同時被展開，為了提高洗滌效果，展開前的洗滌液使用不含標記物質(zhì)的液體。另外，還可使用為了提高洗滌效果而調(diào)節(jié)了其PH或者添加了表面活性劑成分或BSA等蛋白質(zhì)、聚乙二醇等高分子化合物的洗滌液。(洗滌液的展開、其方向)洗滌液在檢體液展開后添加到色譜用檢測條中，將色譜用檢測條上殘留的除因抗原抗體反應(yīng)而結(jié)合的之外的標記物質(zhì)進行洗滌。作為洗滌液的送液方法，有如下方法在檢體液展開后直接添加到試樣滴加部的方法；事先在檢測條上附著用于洗滌液送液的洗滌液添加墊、吸水墊，添加于該洗滌液添加墊并向吸水墊方向送液的方法；事先使檢測條具備洗滌液的添加部位，在檢體液展開后在該洗滌液的添加部位添加洗滌液的方法等，更優(yōu)選如下方法將檢體液在檢測條上展開后，將用于洗滌液送液的洗滌液添加墊、吸水墊附著于檢測條，向洗滌液添加墊提供洗滌液，使洗滌液展開。作為向洗滌液添加墊提供洗滌液的方法，可以在裝有洗滌液的壺內(nèi)插入洗滌液添加墊，也可以在洗滌液添加墊上滴加洗滌液。在本說明書中，該被檢物質(zhì)的液體的展開方向定義為連接試樣添加墊和吸收墊的方向，洗滌液的展開方向定義為連接用于洗滌液送液的洗滌液添加墊和吸水墊的方向。當被檢物質(zhì)的液體的展開方向與洗滌液的展開方向所成的角度為45度到170度時，洗滌效果變好。此外，該被檢物質(zhì)的液體的展開方向與洗滌液的展開方向所成的角度優(yōu)選為60度到170度、更優(yōu)選為60度到150度。在本發(fā)明中，洗滌液添加墊(也標記為第2不溶性載體)可使用玻璃纖維墊或纖維素膜、硝化纖維素膜等。在本發(fā)明中，吸水墊(也標記為第3不溶性載體)可使用纖維素、硝化纖維素、玻璃纖維、它們的混合體等。7.放大液
放大液是所含的藥劑在標記物質(zhì)或被檢物質(zhì)的作用下通過催化性地反應(yīng)而產(chǎn)生經(jīng)著色的化合物或發(fā)光等、從而能引起信號的放大的溶液。例如可舉出在金屬標記上通過物理顯影引起金屬銀的析出的銀離子溶液、利用過氧化酶標記和過氧化氫的作用而形成色素的苯二胺化合物與萘酚化合物的溶液等。關(guān)于詳細內(nèi)容，可使用在照相化學領(lǐng)域的普通書籍(例如“修訂照相工學的基礎(chǔ)-銀鹽照相篇_，，(日本照相學會編、Corona公司)、“照相的化學”(笹井明、照相工業(yè)出版社)、“最新配方手冊”(菊池真一他、7 ^ =出版社))中記載的所謂的顯影液，只要是液體中含有銀離子、液體中的銀離子主要被還原為成為顯影核的金屬膠體等的所謂的物理顯影液即可，沒有特殊限制，均可作為放大液使用。作為放大液的具體例子，可使用包含含銀化合物以及銀離子用還原劑的放大液。關(guān)于本發(fā)明中的放大液的制備，可以制成同時包含含銀化合物以及銀離子用還原劑的I個放大液來進行使用，但作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，優(yōu)選分別制成包含含銀化合物的放大液和包含銀離子用還原劑的放大液來進行使用。下面，對含銀化合物和銀離子用還原劑等進行說明?！?br> (含銀(離子)化合物)作為含銀離子化合物，可使用有機銀鹽、無機銀鹽或銀絡(luò)合物。優(yōu)選對水等溶劑的溶解度高的含銀離子化合物，可舉出硝酸銀、乙酸銀、乳酸銀、丁酸銀、硫代硫酸銀等。特別優(yōu)選硝酸銀。作為銀絡(luò)合物，優(yōu)選配位于具有羥基或磺酸基等水溶性基團的配位基而得到的銀絡(luò)合物，可舉出羥基硫醚銀等。有機銀鹽、無機銀鹽或銀絡(luò)合物以銀計通常含有O. OOlmol/m2 0. 2mol/m2，優(yōu)選含有 0. 01mol/m2 0. 05mol/m2。(銀離子用還原劑)銀離子用還原劑只要能將銀離子還原成銀即可，可使用無機或有機的任何材料、或者其混合物。作為無機還原劑，可優(yōu)選舉出Fe2+、V2+、Ti3+等金屬離子的化合價可變的還原性金屬鹽、還原性金屬絡(luò)合物鹽。當使用無機還原劑時，需要將被氧化的離子形成絡(luò)合物或還原后除去以無害化。例如，在將Fe2+用作還原劑的體系中，可使用檸檬酸或EDTA來形成氧化物即Fe3+的絡(luò)合物而進行無害化。在本體系中，優(yōu)選使用這種無機還原劑，更優(yōu)選Fe2+的金屬鹽。另外，還可使用在濕式的鹵化銀照相感光材料中所用的顯影主劑(例如甲基沒食子酸鹽、氫醌、取代氫醌、3-吡唑烷酮類、對氨基酚類、對苯二胺類、受阻酚類、氨肟類、吖嗪類、兒茶酚類、焦掊酚類、抗壞血酸類(或其衍生物)、及無色色素類)、以及對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言熟知的其它材料、例如美國專利第6020117號中記載的材料。作為還原劑，還優(yōu)選抗壞血酸還原劑。有用的抗壞血酸還原劑包含抗壞血酸和類似物、異構(gòu)體及其衍生物，例如可優(yōu)選舉出D-或L-抗壞血酸及其糖衍生物(例如Y -乳糖型抗壞血酸、葡糖型抗壞血酸、巖藻糖型抗壞血酸、葡庚糖型抗壞血酸、麥芽糖型抗壞血酸)、抗壞血酸的鈉鹽、抗壞血酸的鉀鹽、異抗壞血酸(或L-紅抗壞血酸)、其鹽(例如堿金屬鹽、銨鹽或本領(lǐng)域公知的鹽)、烯二醇型的抗壞血酸、Enaminol型的抗壞血酸、硫代烯醇型的抗壞血酸等，特別優(yōu)選D、L或D，L-抗壞血酸(或其堿金屬鹽)或者異抗壞血酸(或其堿金屬鹽)，鈉鹽是優(yōu)選的鹽?？梢愿鶕?jù)需要使用這些還原劑的混合物。8.其它助劑作為放大液的其它助劑，有時含有緩沖劑、防腐劑例如抗氧化劑或有機穩(wěn)定劑、速度調(diào)節(jié)劑。作為緩沖劑，例如可采用使用了乙酸、檸檬酸、氫氧化鈉或它們中任一者的鹽、或者三(羥甲基)氨基甲烷的緩沖劑、其它在普通化學實驗中使用的緩沖劑。適當使用這些緩沖劑，可將放大液調(diào)節(jié)至最佳的pH。另外，作為防霧劑，可使用烷基胺作為添加劑，特別優(yōu)選十二烷基胺。此外，為了提高這些添加劑的溶解性，可使用表面活性劑，特別優(yōu)選C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)50Ho9.檢測時的平均粒子大小的算出方法檢測時(放大后)，剪取檢測帶部，使用碳糊將試樣背面安裝于試樣臺后，將截面切割，進行碳蒸鍍，利用掃描型電子顯微鏡來觀察形狀和大小。例如可使用日立High-Technologies制FE-STEM S-5500，通過SEM在加速電壓為IOKV下利用反射電子來觀 察試樣表面。然后，從信號粒子中選擇100個粒子，測定粒子的投影面積的當量圓直徑，算出平均值，將其作為檢測時的平均粒子大小。通過以下的實施例來更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受實施例的限制。[實施例](I)檢測流感A型的免疫色譜試劑盒的制作(1-1)抗流感A型抗體修飾金膠體的制作(1-1-1) F (ab’)2片段抗流感A型病毒抗體的制作使用抗流感A型病毒抗體(產(chǎn)品編號為7307、Medix Biochemica公司)，使用ImmunoPureIgGl Fab and F(ab，)2 Preparation Kit (產(chǎn)品編號為 44880、Pierce 公司)來制作。(1-1-2)抗流感A型片段抗體修飾金膠體的制作向在直徑為50nm的金膠體溶液(EM. GC50、BBI公司)9mL中加入50mM的KH2PO4緩沖液(pH為7. 5) ImL進行了 pH調(diào)節(jié)而得到的金膠體溶液中，加入濃度為160 μ g/mL的(1-1-1)中制作的F(ab’)2片段抗流感A型病毒抗體溶液ImL并攪拌。靜置10分鐘后，力口入I質(zhì)量％的聚乙二醇(PEG Mw. 20000、產(chǎn)品編號為168-11285、和光純藥)水溶液550 μ L并攪拌，接著加入10質(zhì)量％的牛血清白蛋白(BSA FractionV、產(chǎn)品編號為A-7906、SIGMA)水溶液I. ImL并攪拌。將該溶液在8000X g、4°C的條件下離心(himacCF16RX、日立)30分鐘后，殘留ImL左右來去除上清，通過超聲波洗滌機將金膠體進行再分散。之后，分散于20mL的金膠體保存液(20mM的Tris-HCl緩沖液(pH為8. 2)、0. 05質(zhì)量％的PEG(Mw. 20000)、150mM的NaCl、I質(zhì)量％的BSA、0. I質(zhì)量％的NaN3)中，再次在8000Xg、4°C的條件下離心30分鐘后，殘留ImL左右來去除上清，通過超聲波洗滌機將金膠體進行再分散，得到抗體修飾金膠體(50nm)溶液。(1-2)金膠體抗體保持墊(標記物質(zhì)保持墊)的制作使用金膠體涂布液(20mM的Tris-HCl緩沖液(pH為8. 2)、O. 05質(zhì)量％的PEG(Mw. 20000)、5質(zhì)量％的蔗糖)以及水，將(1_1)中制作的流感A型抗體修飾金膠體進行稀釋，稀釋成520nm的光學濃度(OD)為3. O。將該溶液以每I張O. 8mL的方式均勻地涂布在剪成 8mmX 150mm 的玻璃纖維墊(Glass Fiber Conjugate PacUMillipore 公司)上，減壓干燥12小時，得到金膠體抗體保持墊。(1-3)抗體固定膜(色譜載體)的制作對于剪切成25mmX 200mm的硝化纖維素膜(有塑料襯里、HiFlow Plus HF120、Millipore公司)，通過以下的方法將抗體固定來制作抗體固定膜。將膜以橫向長的方式設(shè)置，在距離200mm的長邊為IOmm的位置上，使用噴墨方式的涂布機(BioDot公司)以寬度為O. 7mm左右的線狀來涂布制成I. 5mg/mL的抗流感A型病毒抗體(產(chǎn)品編號為7307、Medix Biochemica公司)溶液,作為檢測部位。進而同樣地在距離200mm的長邊為16mm的位置(距離檢測部位為6mm的位置)上，以線狀來涂布制成O. 5mg/mL的對照用抗小鼠IgG抗體(抗小鼠IgG(H+L)、兔F(ab’)2、產(chǎn)品編號為566-70621、和光純藥)溶液，作為對照部位。涂布后的膜在熱風式干燥機中于50°C下干燥30分鐘。在盤中裝入封閉液(含有O. 5質(zhì)量％的酪蛋白(來自奶、產(chǎn)品編號為030-01505、和光純藥)的50mM硼酸緩沖液(pH為8. 5))500mL，在將干燥結(jié)束后的硝化纖維素膜浸潰于其中的狀態(tài)下靜置30分鐘。然后，將膜轉(zhuǎn)移并浸潰于裝在同樣的盤中的洗滌和穩(wěn)定化液(含有O. 5質(zhì)量％的蔗糖和O. 05%質(zhì)量的膽酸鈉的50mM Tris-HCl (pH為7. 5)緩沖液)500mL中，在該狀態(tài)下靜置30分鐘。然后 將膜從液體中取出，在室溫下干燥12小時，制得抗體固定膜。(1-4)免疫色譜用檢測條的制作在背面粘著片(ARcare9020、NIPPN TechnoCluster公司)上粘貼(1-3)中制作的抗體固定膜，將25mmX200mm的膜以橫向長的方式設(shè)置。以與相對于設(shè)置的膜的對照部位相當于檢測部位側(cè)的膜的長邊的端部部分重疊約2_的方式，橫向長地粘貼1-2中制作的金膠體抗體保持墊(標記物質(zhì)保持墊)。然后，以與金膠體抗體保持墊重疊約4mm的方式，在與膜相反側(cè)的遠離的位置上橫向長地重疊并粘貼試樣添加墊(剪成18mmX250mm的玻璃纖維墊(GlassFiber Conjugate Pad、Millipore公司))。接著,在與金膠體抗體保持墊相反側(cè)的抗體固定膜的端部，以與膜重疊約5_的方式橫向長地重疊并粘貼吸收墊(剪成20mm X 250mm的纖維素玻璃膜(CF6、Whatman公司))。通過使用閘刀式剪切機(CM4000、NIPPN TechnoCluster公司)將這些重疊并粘貼而成的部件(免疫色譜主體部件)沿與檢測部位及對照部位垂直的方向以7_的寬度與短邊平行地剪切，從而如圖I和圖2所示意地那樣來制作多張7mmX60mm的免疫色譜用檢測條。將它們作為試驗用免疫色譜試劑盒。(1-5)洗滌液使用在以下(1-6)中所述的放大液A-I。(1-6)銀放大液的制作(1-6-1)放大液A-I (含有銀離子用還原劑成分的溶液)的制作在水325g中溶解通過在水中溶解硝酸鐵(III)九水合物(和光純藥、095-00995)而制得的lmol/L的硝酸鐵水溶液40mL、檸檬酸(和光純藥、038-06925) 10. 5g、十二烷基胺(和光純藥、123-00246)O. lg、表面活性劑 C9H19-C6H4-O-(CH2CH2O)5(IH O. 44g。全部溶解后，一邊用攪拌器攪拌一邊加入硝酸(10質(zhì)量％)40mL。量取該溶液80mL，加入硫酸銨鐵(II)六水合物(和光純藥、091-00855) 11. 76g，將其作為放大液A-I。(1-6-2)放大液A-2 (包含含銀(離子)化合物的溶液)的制作在硝酸銀溶液IOmL(含有IOg的硝酸銀)中加入水使總量為100g，制得放大液A-2 (10質(zhì)量％的硝酸銀水溶液)。(1-7)酪蛋白分解物(1-7-1)酪蛋白分解物的制作將5質(zhì)量％的酪蛋白溶液(含有α SI酪蛋白、a S2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白中的I種以上)IL事先用攪拌器進行攪拌，加入純水84. 2mL。在其中加入IOmL通過在溶解緩沖液(O. IM的磷酸鈉、2mM的EDTA · 2Na、pH為7. 8)中以O(shè). 05AU/mL的方式溶解賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(R)(和光純藥、生物化學用、125-02543)而得到的液體。將其在37°C的恒溫槽中靜置10天，作為酪蛋白分解物使用。在酪蛋白分解物30uL中加入NuPAGE LDS樣品緩沖液(4X) (LifeTechnologies公司)10uL。在70 °C下加熱處理10分鐘，將其注入NuPAGE Bis-Tris凝 膠(Life Technologies 公司)。使用純水將 NuPAGE MES SDS 電泳緩沖液(20X) (LifeTechnologies公司)稀釋至20倍,將得到的稀釋液作為電泳緩沖液,使用XCell SureLockMini-Cell (Life Technologies 公司)和電源(Life Technologies 公司)在 200V 下進行40分鐘電泳。作為凝膠染色液,使用InstantBlue (Former Novexin Ltd),在室溫下染色I小時，更換純水并反復洗滌直至背景的顏色脫色為止。然后，使用LAS-4000(富士膠片株式會社)進行拍攝，通過解析軟件Multi Gauge將其條帶濃度進行積分，對蛋白質(zhì)量的分子量及其含有率進行了定量。其結(jié)果是，總蛋白質(zhì)量中50%以上為IkD以上且15kD以下的分子量范圍，IkD以上且15kD以下是主要分子量范圍。(1-7-2)除去了酸不溶物的酪蛋白分解物的制作對(1-7-1)中制作的酶分解酪蛋白4mL使用2mol/L的鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3. 0，進行懸浮。在4°C下靜置5分鐘后，在9000Xg、4°C下離心10分鐘。以不破壞沉淀的方式收集上清，制得除去了酸不溶物的酪蛋白分解物。(2)評價(設(shè)備的設(shè)置)使用圖3所示的免疫色譜試劑盒進行了實驗。在圖3的第I設(shè)備零件(55)上安裝(1-4)中制作的免疫色譜用檢測條(51)，在第2設(shè)備零件(56)上分別安裝作為洗滌液添加墊的第2不溶性載體(53)(剪成15mmX 12mm的玻璃纖維墊(GF/F、GE Healthcare公司))以及作為吸水墊的第3不溶性載體(54)(剪成15mmX 12mm的玻璃纖維墊(GF/F、GEHealthcare 公司))。(抗原液的滴加和展開)作為被檢試樣(檢體液)，在含有I質(zhì)量％的BSA的PBS緩沖液中溶解BD FluExaman對照A+B-(Becton Dickinson公司)來制得抗原稀釋溶液。利用市售免疫色譜檢測試劑盒“Capilia FluA/B” (Alfresa Pharma)時的BD FluExaman對照A+B-的檢測限為1/40，這里使用含有I質(zhì)量％的BSA的PBS緩沖液將該陽性對照液稀釋至1/3200，將其用作模擬陽性檢體液1/3200。在(1_4)中制作的免疫色譜用檢測條的試樣添加墊上均勻地滴加檢體液65 μ 1，靜置2分鐘。(洗滌)如上所述那樣滴加檢體液并靜置2分鐘使其展開后，在圖3所示的第I設(shè)備零件
(55)的液體儲藏器(52)中加入(1-6-1)中制作的含有還原劑成分的放大液(A-I) 150 μ I。使第2設(shè)備零件(56)與第I設(shè)備零件(55)相向地閉合，將第2不溶性載體(53)(洗滌液添加墊)的端部浸入液體儲藏器(52)的含有還原劑成分的放大液(A-I)中，同時將第2不溶性載體(53)(洗滌液添加墊)和第3不溶性載體(54)(吸水墊)以長度方向為橫向的方式安裝于第I不溶性載體(51)即(1-4)中制作的免疫色譜用檢測條上。如此使含有還原劑成分的放大液(A-I)在免疫色譜用檢測條上展開并送液2分鐘。通過該工序，免疫色譜用檢測條浸入含有還原劑成分的放大液(A-I)中，并且未特異性吸附的材料被洗滌。(利用放大液的信號放大)從設(shè)于第2設(shè)備零件(56)的滴加孔(57)滴加(1_6_2)中制作的含有銀離子的放大液(A-2)，將吸附于檢測部位的金膠體標記放大I分鐘。放大后，取出作為第I不溶性載體(51)的免疫色譜用檢測條，水洗I分鐘。(線的濃度測定)
使用免疫色譜用濃度測定器ICA-1000 (Hamamatsu Photonics)來測定該免疫色譜用檢測條，求出背景與檢測部位的吸光度之差(A0D、單位為mABS)來進行評價。(檢體液)作為空白檢體溶液，制作含有I質(zhì)量％的BSA的PBS緩沖液，作為X 1/3200模擬陽性檢體，在含有I質(zhì)量％的BSA的PBS緩沖液中溶解BD FluExaman對照A+B-(BectonDickinson公司)來制作?！幢容^例1>無酪蛋白將上述空白檢體和模擬陽性檢體直接用作檢體液。<比較例2>添加酪蛋白在上述空白檢體和模擬陽性檢體中以最終濃度為I質(zhì)量％的方式添加了酪蛋白。<實施例1>添加酪蛋白分解物在上述空白檢體和模擬陽性檢體中以最終濃度為I質(zhì)量％的方式添加了酪蛋白分解物?！磳嵤├?>在上述空白檢體和模擬陽性檢體中以最終濃度為I質(zhì)量％的方式添加了已除去酸不溶物的酪蛋白分解物。關(guān)于空白檢體中的假陽性，將因斑而無法測定的情況作為對于假陽性將ImABS 50mABS的情況作為“A”、對于假陽性將51mABS IOOmABS的情況作為“B”來進行評價。另外，關(guān)于空白檢體的放大面上的斑，將沒有斑的情況作為“A”、將產(chǎn)生弱斑的情況作為“B”、將有斑的情況作為“C”來進行評價。此外，關(guān)于模擬陽性檢體的線的濃度，將ImABS 50mABS的情況作為“A”、將有假陽性而無法評價的情況或因斑而無法測定的情況作為來進行評價。結(jié)果如下述表I所示。在比較例I中，產(chǎn)生了強的假陽性。在比較例2中，產(chǎn)生了放大斑，無法測定線的濃度。在實施例I中，假陽性大大降低，且模擬陽性檢體1/3200中為相對于空白能顯著檢測出的線濃度。但產(chǎn)生了弱的放大斑。在實施例2中，假陽性大大降低，且模擬陽性檢體1/3200中為相對于空白能顯著檢測出的線濃度。另外，按照“9.檢測時的平均粒子大小的算出方法”來算出在上述實施例I進行檢測時的檢測時的平均粒子大小，結(jié)果為6 8 μ m。表I空白檢體中的假陽性
權(quán)利要求
1.一種免疫色譜方法，其包含 在形成了被檢物質(zhì)與用針對被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，將該復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開； 在不溶性載體上的檢測部位上捕捉被檢物質(zhì)和標記物質(zhì)，所述不溶性載體含有針對被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或?qū)︶槍Ρ粰z物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)； 將捕捉到的標記物質(zhì)放大來檢測被檢物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的免疫色譜方法，其中，蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的分子量的范圍為 O. IkD 15kD。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的免疫色譜方法，其中，蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物是在酸性條件下不存在作為不溶成分的析出物的分解物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫色譜方法，其中，蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物是通過在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物中添加酸以使PH為4以下、并除去所析出的析出物而得到的蛋白質(zhì)分解物。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的免疫色譜方法，其中，蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物是酪蛋白的蛋白酶分解物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫色譜方法，其中，酪蛋白是選自CiSl酪蛋白、CIS2酪蛋白、β酪蛋白或K酪蛋白中的I種以上的酪蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的免疫色譜方法，其中，第一結(jié)合物質(zhì)和第二結(jié)合物質(zhì)中的至少任一方為抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的免疫色譜方法，其中，使用包含含銀化合物以及銀離子用還原劑的放大液來進行將捕捉到的標記物質(zhì)放大的工序。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的免疫色譜方法，其中，在形成了被檢物質(zhì)與用針對該被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，將該復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開后，將洗滌液在不溶性載體上展開，然后將捕捉到的標記物質(zhì)放大。
10.一種免疫色譜用試劑盒，其特征在于，具備 用針對被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)；和 含有針對被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或?qū)︶槍Ρ粰z物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)的不溶性載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫色譜用試劑盒，其中，所述第一結(jié)合物質(zhì)和第二結(jié)合物質(zhì)中的至少任一方為抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種免疫色譜方法，該免疫色譜方法通過在將信號放大時抑制假陽性的產(chǎn)生而能進行高靈敏度且假陽性得以降低的檢測。該免疫色譜方法包含在形成了被檢物質(zhì)與用針對被檢物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)修飾過的含有金屬的標記物質(zhì)的復合體的狀態(tài)下，將所述復合體在蛋白質(zhì)的蛋白酶分解物的存在下在不溶性載體上展開；在含有針對被檢物質(zhì)的第二結(jié)合物質(zhì)或?qū)︶槍Ρ粰z物質(zhì)的第一結(jié)合物質(zhì)具有結(jié)合性的物質(zhì)的不溶性載體上的檢測部位上捕捉被檢物質(zhì)和該標記物質(zhì)；將捕捉到的標記物質(zhì)放大來檢測被檢物質(zhì)。
文檔編號G01N33/543GK102830226SQ20121019451
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者片田順一, 知久浩之 申請人:富士膠片株式會社