專利名稱：液相色譜－串連質(zhì)譜法測(cè)定五加科植物中真菌毒素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及五加科植物中真菌毒素含量的測(cè)定方法，具體涉及采用液相色譜-串連質(zhì)譜法測(cè)定五加科植物中真菌毒素含量的方法。
背景技術(shù)：
真菌毒素(Mycotoxin)，也稱霉菌毒素，是真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，一般同時(shí)具有毒性強(qiáng)和污染頻率高的特點(diǎn)。由于真菌的寄生和真菌毒素的產(chǎn)生，嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，降低農(nóng)產(chǎn)品和飼料品質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。人或動(dòng)物攝入被真菌毒素污染的農(nóng)、畜產(chǎn)品，或通過(guò)吸入及皮膚接觸真菌毒素可引發(fā)多種中毒癥狀。如致幻，催吐，出血癥，皮炎，中樞神經(jīng)受損，甚至死亡。動(dòng)物試驗(yàn)和流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果還證實(shí)，許多真菌毒素還可在體內(nèi)積累后產(chǎn)生致癌、致畸、致突變、類激素中毒，白細(xì)胞缺乏癥等，對(duì)機(jī)體造成永久性損害(參見張藝兵等，農(nóng)產(chǎn)品中真菌毒素的檢測(cè)分析[M]北京化學(xué)工業(yè)出版社，2006)。目前研究關(guān)注的真菌毒素主要集中在黃曲霉毒素(aflatoxin)，赭曲霉毒素(0A),嘔吐毒素(DON),伏馬毒素(FUM),玉米赤霉烯酮(ZEN), T-2毒素及展青霉素(PAT)等。隨著對(duì)真菌毒素危害的深入研究，公眾逐漸認(rèn)識(shí)到其對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人類健康造成的嚴(yán)重威脅，各國(guó)政府對(duì)藥品食品中真菌毒素的分布及檢測(cè)也都予以了極大的關(guān)注，特別是歐盟及美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家更是對(duì)此設(shè)定了嚴(yán)格的限量規(guī)定。食品方面，我國(guó)已相繼出臺(tái)了很多有關(guān)真菌毒素的法定標(biāo)準(zhǔn)(參見GB2715-2005食品中真菌毒素限量[S]和GB2761-2005食品中真菌毒素限量[S])，但在藥品領(lǐng)域，除中國(guó)藥典收載了黃曲霉毒素的檢測(cè)方法(參見中國(guó)人民共和國(guó)藥典2010年版[S])外，尚無(wú)其他標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)。而已有的食品標(biāo)準(zhǔn)均為針對(duì)單一的真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)多成分殘留的標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)。因此，急需開發(fā)藥品特別是五加科植物中真菌毒素多成分殘留的高效測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供一種采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定五加科植物中真菌毒素含量的方法。該方法可用于五加科植物中真菌毒素殘留的篩查，為擬定藥品中真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)提供技術(shù)服務(wù)。本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)提供一種用于測(cè)定五加科植物中真菌毒素含量的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(I)用固相萃取柱對(duì)待測(cè)五加科植物樣品進(jìn)行預(yù)處理；(2)通過(guò)液相色譜-串連質(zhì)譜法測(cè)定經(jīng)預(yù)處理后的五加科植物樣品中一種或多種
真菌毒素的含量。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明方法用于測(cè)定五加科植物樣品中多種
真菌毒素的含量。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述五加科植物為人參、西洋參、、竹節(jié)參或田七參，特別優(yōu)選為人參。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述真菌毒素包括黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素或T-2毒素；其中所述黃曲霉毒素包括黃曲霉毒素&、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1或黃曲霉毒素G2。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述五加科植物樣品的預(yù)處理包括用固相萃取柱Mycos印226多功能柱純化五加科植物樣品的步驟。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述五加科植物樣品的預(yù)處理包括用乙腈提取五加科植物樣品并通過(guò)Mycos印226多功能柱的步驟。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，五加科植物樣品的預(yù)處理包括稱取五加科植物樣品粉末，加入乙腈，攪拌，離心，濾過(guò)，濾液通過(guò)多功能凈化柱(Mycosep 226)，取上清液，干燥，加入甲醇-甲酸銨溶液使溶解，離心，取上清液。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟(2)中液相色譜-串連質(zhì)譜法的色譜條件為采用十八烷基鍵合硅膠柱(C18柱)，流動(dòng)相由A相和B相組成，A相為100%甲醇，B相為甲酸，采用梯度洗脫。優(yōu)選地,所述C18柱的粒徑為I. 7 5 ii m,柱內(nèi)徑2. I 4. 6mm,柱長(zhǎng)為5 IOcm,更優(yōu)選為ACQUITY UPLC BEH C18柱；B相的濃度為0. 01 0. 05%，優(yōu)選0. 01% (體積);A B體積比為5 95%: 95 5%，優(yōu)選流速為0. 2 0. 4ml/min，優(yōu)選0. 3ml/min。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟(2)中液相色譜-串連質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件為采用電噴霧離子源，采用正負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，去簇電壓為-100 120伏、碰撞池能量為-39 50伏。本發(fā)明方法還包括用各種真菌霉素的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并由此計(jì)算五加科植物中真菌霉素的含量。本發(fā)明方法為首次應(yīng)用于五加科植物中真菌毒素多成分殘留的檢測(cè)與分析。本發(fā)明方法在藥品真菌毒素的多成分殘留的檢測(cè)中，可以有效排除干擾、保證待測(cè)物的穩(wěn)定。該測(cè)定分析方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好，可用于五加科植物中真菌毒素的多成分殘留測(cè)定。本發(fā)明方法通過(guò)液相色譜-串連質(zhì)譜對(duì)五加科植物樣品進(jìn)行進(jìn)樣分析，檢測(cè)五加科植物中多種真菌毒素的殘留量，分析成本低、同時(shí)又減少了假陽(yáng)性，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確性，有較強(qiáng)的實(shí)用性。該方法對(duì)五加科植物中真菌毒素多成分殘留的檢測(cè)具有重要指導(dǎo)意義，對(duì)新藥等關(guān)鍵技術(shù)有良好的指導(dǎo)意義，可應(yīng)用于新藥研發(fā)質(zhì)控等多個(gè)方面。該方法可有效應(yīng)用于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制訂、企業(yè)新藥的研發(fā)、企業(yè)現(xiàn)有產(chǎn)品質(zhì)控方法的提升。


圖I為負(fù)離子模式的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流圖；圖2為正離子模式的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的總離子流圖；圖3為負(fù)離子模式的供試品溶液的總離子流圖；圖4為正離子模式的供試品溶液的總離子流圖；圖5為負(fù)離子模式的加樣回收供試品溶液的總離子流圖6為正離子模式的加樣回收供試品溶液的總離子流圖。
具體實(shí)施例方式除非另有說(shuō)明，本發(fā)明中所有比例、百分含量和份數(shù)都以體積計(jì)。實(shí)施例II、 材料與方法I. I主要儀器與試劑API 4000串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，ACQUITY UltraPerformance LC液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，MIKRO 200R離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)，超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)SUPELC0公司)；乙腈、甲酸、甲酸銨均為色譜純。Mycos印226多功能凈化柱(Romer公司)。人參，購(gòu)于上海華宇藥材有限公司，產(chǎn)地吉林，批號(hào)20040404。I. 2實(shí)驗(yàn)方法I. 2. I色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18 (I. 7 y m，2. I X 100mm);以 100 % 甲醇為流動(dòng)相 A 相，以
0.01%甲酸為流動(dòng)相B相，流速0. 3ml/min ;按下表進(jìn)行梯度洗脫表I、流動(dòng)相梯度
權(quán)利要求
1.用于測(cè)定五加科植物中真菌毒素含量的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)用固相萃取柱對(duì)待測(cè)五加科植物樣品進(jìn)行預(yù)處理； (2)通過(guò)液相色譜-串連質(zhì)譜法測(cè)定經(jīng)預(yù)處理后的五加科植物樣品中一種或多種真菌毒素的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)用固相萃取柱對(duì)待測(cè)五加科植物樣品進(jìn)行預(yù)處理； (2)通過(guò)液相色譜-串連質(zhì)譜法測(cè)定經(jīng)預(yù)處理后的五加科植物樣品中多種真菌毒素的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述五加科植物為人參、西洋參、竹節(jié)參或田七參。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述五加科植物為人參。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述真菌毒素選自黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素或T-2毒素。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述黃曲霉毒素選自黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1或黃曲霉毒素G2。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中所述的固相萃取柱為Mycosep 226多功能柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或7所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中五加科植物樣品的預(yù)處理包括用乙腈提取五加科植物樣品并通過(guò)Mycos印226多功能柱的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中五加科植物樣品的預(yù)處理包括以下步驟稱取五加科植物樣品粉末，加入乙腈，攪拌，離心，濾過(guò)，濾液通過(guò)Mycosep226多功能柱，取上清液，干燥，加入甲醇-甲酸銨溶液使溶解，離心，取上清液。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中液相色譜-串連質(zhì)譜法的色譜條件為采用十八烷基鍵合硅膠柱，流動(dòng)相由A相和B相組成，A相為甲醇，B相為甲酸，采用梯度洗脫。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中液相色譜-串連質(zhì)譜法的質(zhì)譜條件為采用電噴霧離子源，采用正負(fù)離子模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，去簇電壓為-100 120伏、碰撞池能量為-39 50伏。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述十八烷基鍵合硅膠柱的粒徑為I.7 5 u m,柱內(nèi)徑2. I 4. 6mm,柱長(zhǎng)為5 10cm。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，其中B相的濃度為0.01 0. 05%。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，其中B相的濃度為0.01%。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，其中A B體積比為5 95% 95 5%。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，其中流動(dòng)相的流速為0.2 0. 4ml/min,優(yōu)選 0. 3ml/min。
全文摘要
本發(fā)明公開一種液相色譜-串連質(zhì)譜法測(cè)定五加科植物中真菌毒素含量的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)用固相萃取柱對(duì)待測(cè)五加科植物樣品進(jìn)行預(yù)處理；(2)通過(guò)液相色譜-串連質(zhì)譜法測(cè)定經(jīng)預(yù)處理后的五加科植物樣品中一種或多種真菌毒素的含量。該測(cè)定方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好，可用于五加科植物中真菌毒素的多成分殘留測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102654490SQ201210054250
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者夏晶, 季申, 張道廣, 李麗敏, 毛丹, 毛秀紅, 王少敏, 王柯, 簡(jiǎn)龍海, 胡青, 許勇, 鄭榮 申請(qǐng)人:上海市食品藥品檢驗(yàn)所