專利名稱：篩查結(jié)直腸癌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種篩查結(jié)直腸癌的試劑盒。
背景技術(shù)：
結(jié)直腸癌近年在全球發(fā)病率直線上升，近些年來每年超過百萬人死于結(jié)直腸癌。 由于結(jié)直腸癌的發(fā)生與生活習(xí)慣，特別是飲食習(xí)慣密切相關(guān)，因此近年隨著我國人民生活水平的逐漸提高，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和致死率在我國飛速增長。研究表明，結(jié)直腸癌的早期診斷尤為關(guān)鍵，早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者的五年存活率高達90%，而目前結(jié)直腸癌早期發(fā)現(xiàn)率不足40%，一旦轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌患者存活率不足10%。目前診斷結(jié)直腸癌的“金標(biāo)準(zhǔn)”是結(jié)腸鏡，目前公認(rèn)，年齡大于50歲的人均應(yīng)該接受腸鏡篩查。美國以及歐洲等權(quán)威部門指出，對于具有家族性高發(fā)病史或由于個人習(xí)慣患病風(fēng)險高的人來說腸鏡篩查尤為重要。但是，目前我國還不具備在體檢中廣泛進行腸鏡檢測的條件，受試者的痛苦也不言而喻。目前在我國體檢中廣泛推行結(jié)腸鏡檢測不現(xiàn)實。因此，篩選血漿中結(jié)直腸癌早期診斷分子標(biāo)記成為現(xiàn)今研究熱點之一。人們已經(jīng)確定了大量存在于結(jié)腸組織、糞便或血清中的生物標(biāo)記物，如癌胚抗原 (CEA)等，來用于結(jié)腸癌的早期診斷和預(yù)測，但是目前大多數(shù)推薦的篩查方法的靈敏度和特異性都在50%以下。最近，還相繼報道了一些組織中、糞便中和血清中的結(jié)直腸癌分子標(biāo)記，但其效果也遠(yuǎn)低于結(jié)腸鏡。例如，如果用糞便DNA特異的甲基化位點作為標(biāo)記，當(dāng)特異度達到90%時，靈敏度只有50%。而且這種檢測肯定不如血液標(biāo)記物的檢測方便，因此目前更多的醫(yī)務(wù)工作者希望開發(fā)血液中結(jié)直腸癌診斷的標(biāo)志物。有研究報道，血清結(jié)腸癌特異抗原CCSA-3和CCSA-4可能成為結(jié)直腸癌診斷的標(biāo)志物，其檢測效果還需證實。每年大約報道有上千種腫瘤分子標(biāo)記物，但是最后應(yīng)用于臨床的分子標(biāo)志物幾乎沒有，它們存在的缺陷集中在樣本量較少(< 30)，沒有在不同種族或獨立實驗中被確實等。更關(guān)鍵的是， 在樣本收集、預(yù)處理和目標(biāo)分子抽提過程中標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一讓這些分子標(biāo)志物很難被推廣。綜上，由于腸鏡費用較高、痛苦較大和操作要求高等原因降低了病人愿意做該項檢查的程度，致使很多病人拖到晚期成了不治之癥。因此急切需要開發(fā)出一種可應(yīng)用于結(jié)直腸癌早期篩查的簡單可靠、無創(chuàng)或微創(chuàng)的大通量檢查方法。具有生物活性的溶血磷脂分子在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用日益引起科學(xué)家的關(guān)注。這其中一些溶血磷脂分子，比如LPC、鞘氨醇磷酸膽堿 (sphingosylphosphorylcholine, SPC)、溶血磷月旨酸(lysophosphatidic acid, LPA)、鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-l-phosphate，SlP)和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)可以調(diào)節(jié)諸如細(xì)胞增殖、遷移、形態(tài)發(fā)生和吸附在內(nèi)的多種活動。因此這些溶血磷脂分子可以參與血管生成、傷口愈合、免疫、動脈粥樣硬化發(fā)生和成瘤等過程的調(diào)節(jié)。這些脂類分子的代謝與上述生理病理進程息息相關(guān)，其中SPC和SM均可以轉(zhuǎn)化為S1P，而LPC通過ATX催化可以生成 LPA, SlP和LPA作為功能活性脂類分子對腫瘤的調(diào)節(jié)功能十分顯著。隨著生物活性脂類分子與腫瘤相關(guān)性認(rèn)識的深入和脂類分子檢測手段的進步，一些生物活性脂類分子被認(rèn)為可能作為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)記物?；谥惙肿?，特別是生物活性脂類分子的重要生理和病理意義，國際上新近提出了脂類組學(xué)和功能脂類組學(xué)的概念。除現(xiàn)有的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)之外，脂類組學(xué)的研究和發(fā)展必將在腫瘤的早期診斷和治療中發(fā)揮重要的作用。此夕卜，腫瘤發(fā)生早期生物活性脂類分子代謝的異?？梢詮娜说捏w液(血清/血漿)中直接檢測到。與之相比，傳統(tǒng)的組織樣本檢測不僅創(chuàng)傷大，而且對腫瘤難以做到早期診斷。與基因和蛋白標(biāo)記物相比，作為代謝標(biāo)記物，生物活性脂類分子的檢測更方便、快捷，適于臨床推廣。因此，建立靈敏、準(zhǔn)確和高效的生物活性脂類分析方法，篩選針對不同腫瘤特異的生物活性脂類分子標(biāo)記物，對腫瘤早期診斷具有重要的意義。不同于蛋白質(zhì)和多肽，開發(fā)針對于簡單的溶血磷脂分子，如LPA和LPC的抗體非常困難。因此簡單的ELISA檢測方法對于這些溶血磷脂分子來說很難適用。一些傳統(tǒng)的脂類分析方法曾被成功的應(yīng)用于溶血磷脂的分析檢測，如thin-layer chromatography (TLC)， phosphorous determination，禾口 gas chromatography (GC)等。{B是，這些方^去中有白勺分析過程復(fù)雜，工作量大，有的則靈敏度差，不能高效地分析體液中含量低的溶血磷脂，而且沒有任何一種方法能夠簡單的用于分離和分析溶血磷脂的亞型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩查或輔助篩查結(jié)直腸癌的試劑盒。本發(fā)明提供的篩查或輔助篩查結(jié)直腸癌的試劑盒，包括用于檢測磷脂含量的裝置和由所述磷脂含量建立的比對卡；所述磷脂為SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、 20:0LPC、22:6LPC和 22:0LPC。所述由磷脂含量建立的比對卡為如下1)或2):1)為比對卡A和比對卡B中的任意一種；2)比對卡A和比對卡B;所述比對卡A由直線1、橫坐標(biāo)1和縱坐標(biāo)1組成；所述直線1 為 0.023X 飽和 LPC 總量+5.96X18:2LPC% +17. 06XSPC 總量= 9. 66 ；所述橫坐標(biāo)1 為 0. 023X 飽和 LPC 總量 +5. 96X18:2LPC% ；所述縱坐標(biāo)1為SPC總量(含量)；上述直線1為縱坐標(biāo)1關(guān)于橫坐標(biāo)1的一次函數(shù)；所述比對卡B由直線2、橫坐標(biāo)2和縱坐標(biāo)2組成；所述直線2 為 11. 41X18:2LPC% +7. 43X 18: ILPC% +0. 024X 飽和 LPC 總量= 14. 58 ；所述橫坐標(biāo)2 為 11.406X18:2LPC%+7.43X18:1LPC% ；
所述縱坐標(biāo)2為飽和LPC總量；上述直線2為縱坐標(biāo)2關(guān)于橫坐標(biāo)2的一次函數(shù)；所述18:2LPC%* 18:2LPC含量占不飽和LPC總量的百分比；所述18: ILPC含量占不飽和LPC總量的百分比。所述飽和LPC 總量為 14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC 禾口 22:0LPC 含量的總和；所述不飽和LPC總量為18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的總和；上述各磷脂含量的單位均為micro Μ。所述用于檢測磷脂含量的裝置為液質(zhì)聯(lián)用儀。所述液質(zhì)聯(lián)用儀為 Applied Bio systems S ciex 3200Qtrap mass spectrometer, Applied Biosystems Sciex, Ontario, Canada, ^^llllifffi^^ ] ^ 比為90 10 0. 1的甲醇、水、氨水混合物；所述檢測采用的流動相的流速為0. 2ml/min,檢測LPC、SPC、L-PAF和SM各亞類時不需要柱子，檢測LPA、SlP的柱子型號為 C18HPLC column (TARGA C18 5 μ Μ, 2. Imm IDXlOmm TR-0121-C185，Higgins Analytical, Southborough, ΜΑ)。所述磷脂含量為離體血液中磷脂含量。所述試劑盒由所述用于檢測磷脂含量的裝置和所述由所述磷脂含量建立的比對卡組成。所述的試劑盒在制備檢測待測樣本結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。所述待測樣本來源于人，具體來源于亞洲人，尤其優(yōu)選為中國人。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明在中國人群中(正常對照和腫瘤患者各120例)深入研究了一系列磷脂分子的含量(LPC，LPA, SPC, SIP, SM和溶血血小板因子L-PAF)，特別是含有膽堿基團的脂類分子(LPC、SMJP SPC)各種亞類在血漿中的含量，深入探究這些脂類在結(jié)直腸癌中的變化，進而開發(fā)有效的結(jié)直腸癌早期診斷分子標(biāo)記，建立了分子檢測模型，根據(jù)此模型檢測的靈敏度和特異度可達88 %和80 % (或者83 %和86 % )，利用這些脂類分子對結(jié)直腸癌和正常對照的區(qū)分效果優(yōu)于近些年來很多研究結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物。本發(fā)明的蹄選中，以 Electro-spray ionization mass spectrometry (ESI-MS，三重四級串聯(lián)質(zhì)譜儀)為基礎(chǔ)，開發(fā)了定量檢測人血漿中溶血磷脂分子的技術(shù)。質(zhì)譜檢測的優(yōu)點是(1)靈敏度高、重復(fù)性好；( 它不僅可以同時檢測大量不同種類的脂類分子，而且可以分辨同一種脂類分子的不同亞型；(3)檢測血漿樣本具有取樣方便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點，而且所需樣本量只有10-50μ1 ;(4)利用一臺自動取樣器，這種檢測技術(shù)就可以變得非常自動化。因此，這種檢測方法在臨床應(yīng)用上具有很大的潛力。應(yīng)用相關(guān)技術(shù)，2007年，美國印第安納大學(xué)徐燕教授實驗室首先報道LPC可以作為美國人群的結(jié)直腸癌早期診斷標(biāo)志物。 但是對于癌癥早期診斷分子標(biāo)記而言，跨種族和人群的獨立檢測至關(guān)重要，多數(shù)分子標(biāo)記在種群中存在極大差異。本發(fā)明的研究結(jié)果表明一系列含有膽堿基團的磷脂分子可以作為篩查結(jié)直腸癌的分子標(biāo)記。這些脂類分子的代謝對于結(jié)直腸癌的進程起到關(guān)鍵作用。每年有超過100，000 篇關(guān)于“cancer marker"的文章發(fā)表，但是這些分子標(biāo)志物最后被應(yīng)用于臨床檢驗的少之又少，不同實驗室對同一標(biāo)志物的檢測結(jié)果存在諸多差異，樣本收集方式差異、提取方式的差異以及復(fù)雜的檢測方法等都是這些標(biāo)志物難以被應(yīng)用的原因。而本發(fā)明的對這些含膽堿基團的脂類分子檢測過程，取樣、提取和檢測高度標(biāo)準(zhǔn)化，而且利用幾十微升血漿和簡單的有機試劑就可以準(zhǔn)確定量這些脂類分子在血漿中的含量，可以推行到例行體檢中，并將其作為結(jié)直腸癌早期診斷的篩查指標(biāo)，即指血化驗就有可能為結(jié)直腸癌診斷提供初步依據(jù)。


圖1為飽和LPC、不飽和LPC、總LPC以及(16 0+18 0) SM含量在正常對照和結(jié)直腸腫瘤患者體內(nèi)的含量變化趨勢圖2為利用LPC區(qū)分中國人群中正常對照與結(jié)直腸癌患者模型圖3為利用LPC和SPC區(qū)分中國人群中正常對照與結(jié)直腸癌患者模型
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、篩查結(jié)直腸癌的試劑盒的構(gòu)建一、分子模型的建立1、血液收集、脂類分子提取和檢測1)研究對象所有樣本收集于2007年5月-2010年5月，樣品來自全軍第二炮兵總醫(yī)院、北京醫(yī)院、北京大學(xué)第二附屬醫(yī)院。早晨取空腹病人血液進行預(yù)處理。此項目經(jīng)過hstitutional Review Board審批，所有受試者簽署知情同意書。表1概括了研究對象的基本情況受試健康樣本和腫瘤樣本中男性比例分別為 68%和59% ；健康對照和腫瘤患者的年齡分別為55. 2士7. 5和55. 7士 11. 8，取樣年齡沒有
顯著性差異。表2概括了所取120例腫瘤樣本的基本情況53% (64/120)為結(jié)腸腫瘤，其余樣本大多為直腸腫瘤。超過75%的腫瘤為T3/T4期(93/120)，大約一半的腫瘤為NO (58/120， 48% )。從分化程度上看，絕大多數(shù)腫瘤為中高度分化(82/120,69% )。表1研究對象的基本情況表2癌癥患
者的基本情況
權(quán)利要求
1.一種篩查或輔助篩查結(jié)直腸癌的試劑盒，包括用于檢測磷脂含量的裝置和由所述磷脂含量建立的比對卡；所述磷脂為 SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、 22:6LPC和 22:OLPC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于 所述由磷脂含量建立的比對卡為如下1)或2)；1)為對比卡A和比對卡B中的任意一種；2)對比卡A和比對卡B；所述比對卡A由直線1、橫坐標(biāo)1和縱坐標(biāo)1組成；所述直線 1 為 0. 023X 飽和 LPC 總量 +5. 96X18:2LPC% +17. 06X SPC 總量=9. 66 ； 所述橫坐標(biāo)1為0. 023X飽和LPC總量+5. 96X18:2LPC% ； 所述縱坐標(biāo)1為SPC總量； 所述比對卡B由直線2、橫坐標(biāo)2和縱坐標(biāo)2組成；所述直線 2 為 11. 41X18:2LPC% +7. 43X18:1LPC% +0. 024X 飽和 LPC 總量=14. 58 ； 所述橫坐標(biāo) 2 為 11. 406X18:2LPC% +7. 43X18:1LPC% ； 所述縱坐標(biāo)2為飽和LPC總量；所述18:2LPC%* 18:2LPC含量占不飽和LPC總量的百分比； 所述18: ILPC含量占不飽和LPC總量的百分比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述飽和 LPC 總量為 14:0LPC、16:0LPC、18:0LPC、20:0LPC 和 22: OLPC 含量的總和； 所述不飽和LPC總量為18:2LPC、18:1LPC、20:4LPC和22:6LPC含量的總和。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的試劑盒，其特征在于 所述用于檢測磷脂含量的裝置為液質(zhì)聯(lián)用儀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述檢測采用的流動相為體積比為90 10 0.1的甲醇、水、氨水混合物； 所述磷脂含量為離體血液中磷脂含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒由所述用于檢測磷脂含量的裝置和所述由所述磷脂含量建立的比對卡組成。
7.權(quán)利要求1-6中所述的試劑盒在制備檢測待測樣本結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測樣本來源于人，具體來源于亞洲人，尤其優(yōu)選為中國人。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查結(jié)直腸癌的試劑盒。本發(fā)明提供的篩查結(jié)直腸癌的試劑盒，包括用于檢測磷脂含量的裝置和由磷脂含量建立的比對卡；所述磷脂為SPC、14:0LPC、16:0LPC、18:2LPC、18:1LPC、18:0LPC、20:4LPC、20:0LPC、22:6LPC和22:0LPC。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)有效的結(jié)直腸癌早期診斷分子標(biāo)記，建立了分子檢測模型，根據(jù)此模型可以檢測靈敏度和特異度可達88％和80％，利用這些脂類分子對結(jié)直腸癌和正常對照的區(qū)分效果優(yōu)于近些年來很多研究結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物。
文檔編號G01N30/06GK102565267SQ20121000302
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者叢羽生, 宋建穩(wěn), 張俊杰, 徐燕, 李頌, 桑建利 申請人:北京師范大學(xué)