專利名稱：β-激動(dòng)劑類藥物檢測(cè)裝置及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及應(yīng)用免疫層析技術(shù)檢測(cè)β -激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)方法及其裝置。
背景技術(shù)：
β-激動(dòng)劑(β-agonists)，又稱為β -興奮劑，是一類人工合成藥物，主要用于防治人、獸支氣管哮喘和支氣管痙攣，在藥學(xué)上稱為β_腎上腺素興奮劑。此類藥物添加到畜禽的飼料、飲用水中可促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)、抑制肥肉生長(zhǎng)的藥物，俗稱瘦肉精。由于此類藥物會(huì)在肝、肺等內(nèi)臟積累，使食用者容易出現(xiàn)惡心、頭暈、肌肉顫抖、心悸等中毒癥狀，嚴(yán)重影響了消費(fèi)者的身體健康，甚至威脅到人的生命安全。歐美等國(guó)早已立法禁止在畜禽生產(chǎn)上使 用β_激動(dòng)劑類藥物，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也于1997年作出相同的規(guī)定。盡管如此，受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，違法濫用激動(dòng)劑類藥物現(xiàn)象仍然比較普遍。2002年，農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局再次公告，明令禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中添加鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺等7種瘦肉精，但是在實(shí)際的操作中只檢測(cè)鹽酸克侖特羅，萊克多巴胺、沙丁胺醇等六種沒有納入常規(guī)的檢測(cè)。于是導(dǎo)致市場(chǎng)上出現(xiàn)一種瘦肉精屢禁不止的現(xiàn)象，如我國(guó)嚴(yán)查鹽酸克倫特羅，便出現(xiàn)以萊克多巴胺及沙丁胺醇取而代之的瘦肉精出現(xiàn)，以逃脫檢測(cè)部門的檢測(cè)。所以實(shí)現(xiàn)一類β-激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)是徹底禁止瘦肉精事件的有力途徑。目前針對(duì)β -激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)方法主要有HPLC、HPLC/MS和GC/MS，但由于分析儀器昂貴，檢測(cè)費(fèi)用高，步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，所以并不適用于畜牧部門、監(jiān)督管理部門和養(yǎng)殖單位。免疫層析技術(shù)是上世紀(jì)80年代初期的一種簡(jiǎn)便快速檢測(cè)技術(shù)，由該技術(shù)制成的免疫層析試紙條通常由以下幾部分組成底板及粘貼在底板上的樣品墊、結(jié)合墊、纖維素膜、吸收墊等。檢測(cè)時(shí)，將樣品滴加到樣品墊上，樣品會(huì)通過毛細(xì)作用在層析條上遷移，在遷移的過程中，與結(jié)合墊上的標(biāo)記物發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物繼續(xù)遷移，與纖維素膜上檢測(cè)區(qū)域的相應(yīng)抗原/抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的檢測(cè)帶。該方法基于免疫層析及抗原抗體反應(yīng)原理，應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥殘的快速定量分析，非常適用于大批量樣品的篩查工作。但目前針對(duì)β_激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)試劑盒多為β_激動(dòng)劑類藥物的單項(xiàng)檢測(cè)，只有少量試劑盒可實(shí)現(xiàn)兩種(鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺)或三種β_激動(dòng)劑類藥物(鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇)的聯(lián)檢。其方法均為應(yīng)用一種β_激動(dòng)劑類藥物偶聯(lián)大分子蛋白制備單抗或多抗，以制備抗體檢測(cè)相應(yīng)β -激動(dòng)劑類藥物。如專利02129704.X，其以鹽酸克倫特羅-載體偶聯(lián)蛋白作為抗原，免疫小鼠，制備單抗，應(yīng)用免疫層析法制備檢測(cè)鹽酸克倫特羅膠體金試紙條，專利200510126415. 4，其應(yīng)用同樣方法實(shí)現(xiàn)樣品中對(duì)萊克多巴胺的檢測(cè)。即一種抗體檢測(cè)一種激動(dòng)劑類藥物，無法實(shí)現(xiàn)一類藥物的同時(shí)檢測(cè)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種可一次檢測(cè)一大類β_激動(dòng)劑類藥物的免疫層析試紙條的制備及使用方法。I)為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案是提供一種檢測(cè)裝置，包括試紙條和反應(yīng)杯兩部分。試紙條包括底板以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊、免疫層析復(fù)合膜、吸水紙，其中免疫層析復(fù)合膜上噴涂有質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)。反應(yīng)杯內(nèi)含有標(biāo)記物-激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物。如上所述的標(biāo)記物，其特征為可作為信號(hào)標(biāo)記物的一類物質(zhì)，如膠體金、膠體硒、乳膠顆粒、熒光顆粒、磁珠，以及其它任何可作為信號(hào)標(biāo)記的物質(zhì)。如上所述的試紙條，其特征是由1-3個(gè)子試紙條組成，即用1-3個(gè)子試紙條檢測(cè)一大類β-激動(dòng)劑類藥物。若由I個(gè)子試紙條組成，則試紙條的檢測(cè)區(qū)由1-3個(gè)子檢測(cè)區(qū)域組成，可對(duì)一大類β_激動(dòng)劑類藥物進(jìn)行檢測(cè)。
如上所述的反應(yīng)杯，其特征為其中含有標(biāo)記物-β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物和適合生物分子反應(yīng)的緩沖體系，該緩沖體系的pH在1-13之間。如上所述的反應(yīng)杯，其特征是內(nèi)容物是凍干的粉末，還可以是液體。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)方法，其特征是待檢樣品經(jīng)前處理后，首先在反應(yīng)池內(nèi)與標(biāo)記物-β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物發(fā)生充分反應(yīng)。如上所述檢測(cè)方法，其特征是加入樣品后，樣品中的目標(biāo)物質(zhì)與反應(yīng)池內(nèi)的β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體在15-60°C之間反應(yīng)Ο-lh，反應(yīng)結(jié)束后，將檢測(cè)試紙條插入反應(yīng)杯中，反應(yīng)O-Ih后判讀檢測(cè)結(jié)果。如上所述的檢測(cè)方法，其特征是可用肉眼直接進(jìn)行結(jié)果判讀，也可用相應(yīng)的儀器進(jìn)行判讀。2)本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種免疫層析檢測(cè)試紙條，該試紙條由底板以及底板上一次搭接粘貼的樣品墊、標(biāo)記物結(jié)合墊、免疫層析復(fù)合膜、吸水紙，其中免疫層析復(fù)合膜上有質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)。如上所述的試紙條，其特征是由1-3個(gè)子試紙條組成，即用1-3個(gè)子試紙條檢測(cè)一大類激動(dòng)劑類藥物。若由I個(gè)子試紙條組成，則試紙條的檢測(cè)區(qū)由1-3個(gè)子檢測(cè)區(qū)域組成，可對(duì)一大類β_激動(dòng)劑類藥物進(jìn)行檢測(cè)。如上所述的標(biāo)記物結(jié)合墊，其特征為噴涂有標(biāo)記物-β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物。如上所述的標(biāo)記物，其特征為可作為信號(hào)標(biāo)記物的一類物質(zhì)，如膠體金、膠體硒、乳膠顆粒、熒光顆粒、納米磁珠，以及其它任何可作為信號(hào)標(biāo)記的物質(zhì)。如上所述的檢測(cè)區(qū)，其特征為該區(qū)域由1-3個(gè)子區(qū)域組成，這些子區(qū)域內(nèi)噴涂有β -激動(dòng)劑類藥物-蛋白偶聯(lián)物，可對(duì)一大類β -激動(dòng)劑類藥物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)方法，其特征是將檢測(cè)試紙條插入待檢樣品中，在15_60°C之間反應(yīng)o-lh，判讀結(jié)果。如上所述的檢測(cè)方法，其特征是可用肉眼直接進(jìn)行結(jié)果判讀，還可以用相應(yīng)的儀器設(shè)備進(jìn)行判讀。本發(fā)明利用與一大類β -激動(dòng)劑類藥物反應(yīng)的抗體/受體制備免疫層析試紙條，實(shí)現(xiàn)對(duì)一大類激動(dòng)劑類藥物的同時(shí)檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，既節(jié)省了檢測(cè)成本，又縮短了檢測(cè)時(shí)間。
具體實(shí)施例方式盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明專利的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)列I免疫層析檢測(cè)裝置(試紙條、反應(yīng)杯模式)I)試紙條的制備樣品墊的制備將纖維素膜剪成I. 5 X 30cm規(guī)格的條帶，備用；硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜剪成2. 5 X 30cm規(guī)格的條帶，在NC膜的不同位置噴涂β-激動(dòng)劑類藥物抗體/受體的抗體或β-激動(dòng)劑類藥物抗體/受體的二抗 (質(zhì)控線)、β -激動(dòng)劑類藥物配體(檢測(cè)線)、室溫晾干；吸收墊的制備將吸水紙裁成3. 5 X 30cm的條帶，備用；試紙條的組裝將吸收墊、硝酸纖維素膜、樣品墊依次貼在底板上，并切成5_寬的試紙條，2-8 °C干燥保存。2)反應(yīng)杯的制備按照100 μ L/孔的量，往96孔微孔板中加入膠體金標(biāo)記的β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體；-8(TC 冷凍 24h ；冷凍干燥孔內(nèi)的膠體金標(biāo)記的β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體；將凍干后的膠體金標(biāo)記的β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體置于干燥環(huán)境中保存。3)檢測(cè)尿樣取IOOul尿樣加入反應(yīng)杯，40°C充分反應(yīng)3min后，將試紙條插入反應(yīng)杯內(nèi)，繼續(xù)反應(yīng)5min后讀取結(jié)果。4)檢測(cè)飼料樣品中β -激動(dòng)劑殘留用乳缽研碎飼料,稱Ig研碎的飼料樣品加入IOmlO. OlM的鹽酸,充分混合5分鐘；調(diào)節(jié)pH值至6. 5-8. O之間；3500rpm離心5min，轉(zhuǎn)移出上清液；直接取IOOul上清液加入反應(yīng)杯，40°C充分反應(yīng)3min后，將試紙條插入反應(yīng)杯內(nèi)，繼續(xù)反應(yīng)5min后讀取結(jié)果。 實(shí)例2免疫層析檢測(cè)裝置(試紙條模式)I)試紙條的制備樣品墊的制備將纖維素膜剪成I. 5 X 30cm規(guī)格的條帶，備用；結(jié)合墊的制備將膠體金標(biāo)記的β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體噴涂于玻璃纖維紙上，真空抽干，備用。硝酸纖維素膜的制備將硝酸纖維素膜剪成2. 5 X 30cm規(guī)格的條帶，在NC膜的不同位置噴涂β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體的抗體，β -激動(dòng)劑類藥物配體(檢測(cè)線)、室溫晾干；吸收墊的制備將吸水紙裁成3. 5 X 30cm的條帶，備用；試紙條的組裝將吸收墊、標(biāo)記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、樣品墊依次貼在底板上，并切成5_寬的試紙條，2-8 °C干燥保存。
2)檢測(cè)肉品中β -激動(dòng)劑(I)低脂肪含量的肝、肌肉、組織
5g粉碎的樣品與25ml 50mM鹽酸混合,均質(zhì)15min ;取6g均質(zhì)物，10_15°C離心15min,4000rpm或更高的轉(zhuǎn)速；轉(zhuǎn)移出上清液至另一個(gè)離心瓶中，加300 μ L IM NaOH,混合15min ;加入4ml 500mM磷酸二氫鉀緩沖液(pH3. O)，簡(jiǎn)單混合并在4°C保存至少I. 5小時(shí)或過夜。10-15°C，4000g離心15min。分離上清液，平衡至室溫，將試紙條插入上清液中，5min
后讀取結(jié)果。(2)高脂肪肉類組織取5g樣品到離心管中，加入 25ml 50mM Tris-HCl (pH 8· 5),振蕩 30min ;加入 15ml庚烷振蕩5min ；4000g離心15min ;用巴斯德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層；再用15ml庚烷重復(fù)步驟振蕩、離心及吸去脂肪層操作；向均質(zhì)的肉液中加入O. 5ml 6M的鹽酸，振蕩I小時(shí)(或是振蕩過夜)；4000g離心15min ;移取上清液到另一個(gè)離心管中，加入300 μ I IM NaOH，混合15min ;加入4ml 500mM KH2PO4-緩沖液(pH3)，簡(jiǎn)單混合并在4°C存放至少I. 5小時(shí)或過夜；4000g離心15min ;移取上清液，平衡至室溫；將試紙條直接插入上清液中，5min后讀取結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種β-激動(dòng)劑類藥物免疫層析檢測(cè)裝置，包括檢測(cè)試紙條和反應(yīng)杯兩部分，該試紙條包括底板，以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊、免疫層析復(fù)合膜、吸水紙。其中免疫層析復(fù)合膜上噴涂有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)。反應(yīng)杯內(nèi)含有標(biāo)記物-β-激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物及緩沖體系。
2.如權(quán)利I所述的免疫層析檢測(cè)裝置，還可以是測(cè)試紙條，該試紙條由底板以及底板上依次搭接粘貼的樣品墊、結(jié)合墊、免疫層析復(fù)合膜、吸水紙。其中免疫層析復(fù)合膜上噴涂有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，結(jié)合墊上噴涂有標(biāo)記物-β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求I和2中所述的標(biāo)記物，其特征為可以作為信號(hào)標(biāo)記的一類物質(zhì)，如膠體金、膠體硒、乳膠顆粒、熒光顆粒、磁性顆粒，以及其它任何可作為信號(hào)標(biāo)記的物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求I和2中所述的試紙條，其特征是由1-3個(gè)子試紙條組成，即用1-3個(gè)子試紙條檢測(cè)一大類激動(dòng)劑類藥物。若由I個(gè)子試紙條組成，則試紙條的檢測(cè)區(qū)由1-3個(gè)子檢測(cè)區(qū)域組成，可對(duì)一大類β -激動(dòng)劑類藥物進(jìn)行檢測(cè)。
5.如權(quán)利要求I所述的反應(yīng)杯部分和權(quán)利要求2所述的結(jié)合墊部分，其特征為其中含有標(biāo)記物-β -激動(dòng)劑類藥物抗體/受體復(fù)合物和適合生物分子反應(yīng)的緩沖體系,該緩沖體系的pH在1-13之間。
6.如權(quán)利要求I所述的反應(yīng)杯部分，其特征是內(nèi)容物是凍干的粉末，還可以是液體。
7.如權(quán)利要求I所述的免疫層析檢測(cè)裝置，其特征是其檢測(cè)β_激動(dòng)劑類藥物的方法是加入樣品后，樣品中的β_激動(dòng)劑類藥物與反應(yīng)池內(nèi)的β_激動(dòng)劑類藥物抗體/受體在15-60°C之間反應(yīng)O-lh，反應(yīng)結(jié)束后，將試紙條插入反應(yīng)杯中，在15-60°C之間反應(yīng)O-Ih后判讀檢測(cè)結(jié)果。
8.如權(quán)利要求2所述的免疫層析檢測(cè)裝置，其特征是其檢測(cè)β_激動(dòng)劑類藥物的方法是將試紙條直接插入待檢樣品，在15-60°C之間反應(yīng)O-Ih后判讀檢測(cè)結(jié)果。
9.如權(quán)利7和權(quán)利要求8所述的檢測(cè)β_激動(dòng)劑類藥物的方法，其特征是檢測(cè)結(jié)果可用肉眼直接判讀，也可用相應(yīng)的儀器進(jìn)行判讀。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，公開了一種應(yīng)用免疫層析技術(shù)檢測(cè)一大類β-激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法。本發(fā)明利用與一大類β-激動(dòng)劑類藥物反應(yīng)的抗體/受體制備免疫層析試紙條，實(shí)現(xiàn)一大類β-激動(dòng)劑類藥的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明與與現(xiàn)有技術(shù)相比，可實(shí)現(xiàn)一次對(duì)一大類β-激動(dòng)劑類藥物的檢測(cè)，檢測(cè)成本低，且方便快捷。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102645532SQ201210001509
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月4日
發(fā)明者付輝, 朱海, 李金峰, 李穎, 林季敏, 王西麗, 蔣原, 薛峰 申請(qǐng)人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心, 深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司