專(zhuān)利名稱(chēng)：用于臨床局限性前列腺癌患者的基于基因的psa復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的制作方法
用于臨床局限性前列腺癌患者的基于基因的PSA復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)
背景技術(shù)：
在進(jìn)行根治性前列腺切除術(shù)或用于前列腺癌的其他侵入性治療前，盡可能地準(zhǔn)確了解該程序是否可能是治愈性是有用的。一般地，通過(guò)拒絕作出特定預(yù)測(cè)，或提供總體平均值，或提供主觀評(píng)價(jià)或基于模型將患者指定至確定危險(xiǎn)組(例如高?；虻臀＝M)，醫(yī)生可以對(duì)患者關(guān)于預(yù)后信息的請(qǐng)求提供回應(yīng)。提供最準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)幾乎始終是適當(dāng)?shù)幕貞?yīng)。因?yàn)榘┌Y的病理學(xué)分期與手術(shù)或治療后的復(fù)發(fā)概率相關(guān)，所以為了提供最佳可能評(píng)價(jià)，已付出許多努力來(lái)預(yù)測(cè)前列腺癌患者中的最終病理學(xué)分期或結(jié)果。為此，已采用許多列線圖、算法和標(biāo)記，其中Kattan列線圖是最成功的。優(yōu)選地，一致性指數(shù)用于從考慮的模型/列線圖/算法等中選擇特定策略。Kattan列線圖在US5993388和US6409664中描述，所述兩個(gè)專(zhuān)利以引用方式并入本文。用于治療臨床局限性前列腺癌的侵入性療法是根治性前列腺切除術(shù)。不幸的是，用根治性前列腺切除術(shù)治療的許多男性后來(lái)經(jīng)歷其疾病的進(jìn)展。從指示復(fù)發(fā)的血清PSA中的增加開(kāi)始，該癌癥在許多男性中在手術(shù)后數(shù)月或數(shù)年重現(xiàn)。在可檢測(cè)的PSA前，可能最后經(jīng)歷復(fù)發(fā)的男性的早期鑒定在考慮另外治療同時(shí)保存生活質(zhì)量中將是有用的。進(jìn)一步地，復(fù)發(fā)可能性的準(zhǔn)確估計(jì)在臨床試驗(yàn)中也將是有用的，以鑒定用于對(duì)照組或用于目的研究治療的候選者。如果治療將更好地適合這個(gè)患者亞組，那么需要在新近診斷的臨床局限性前列腺癌的分類(lèi)中增加的準(zhǔn)確度。與在其他癌癥中一樣，近期已開(kāi)發(fā)了許多表型和預(yù)后分子標(biāo)記和基因標(biāo)志用于前列腺癌。這些已提供不同種類(lèi)的侵入性前列腺癌和許多潛在的候選基因標(biāo)記存在的某些重要了解。單獨(dú)或與其他工具例如Kattan術(shù)后列線圖結(jié)合的，摻入少量基因標(biāo)記的表達(dá)值的臨床可行測(cè)試是有用的，以評(píng)價(jià)PSA復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)是期望的。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)方面，基于基因表達(dá)的測(cè)定用于提供前列腺癌復(fù)發(fā)的預(yù)后?；诨虮磉_(dá)的測(cè)定優(yōu)選基于少量基因。三種基因概況是優(yōu)選的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，三種基因MYHlKSSBPl和DPT的表達(dá)水平提供有關(guān)前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性的預(yù)后信息。在一個(gè)備選實(shí)施方案中，可以使用基因例如細(xì)絲蛋白C，y, RAS樣家族12和細(xì)絲蛋白A的表達(dá)水平。其他可能的標(biāo)記組合包括(i)生長(zhǎng)停滯特異性l、Smoothelin、Leiomodin I和組蛋白lH3d,和(ii)含Sorbin和SH3結(jié)構(gòu)域I、PDZ和UM結(jié)構(gòu)域7、LIM和衰老細(xì)胞抗原樣結(jié)構(gòu)域2。基于表達(dá)水平的標(biāo)記的另外有用組合可以容易地選自表2。在另一個(gè)方面，基于基因表達(dá)水平的測(cè)定與臨床工具結(jié)合使用，所述臨床工具是例如基于前列腺癌預(yù)后的多重臨床指示物的列線圖。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)定三種基因和三種對(duì)照基因的表達(dá)的測(cè)量。優(yōu)選地，基因測(cè)量相對(duì)于三種對(duì)照基因的平均值進(jìn)行測(cè)量。將這些基因測(cè)量連同來(lái)自Kattan列線圖的預(yù)測(cè)概率一起摻入統(tǒng)計(jì)模型內(nèi)，以生成反映復(fù)發(fā)概率或復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的評(píng)分。這種信息還可以用于測(cè)定在根治性前列腺切除術(shù)后的PSA水平上升的可能性。這種復(fù)發(fā)概率可以幫助患者作出關(guān)于其在治療方面的選擇的個(gè)人化決定。更具體地講，本發(fā)明公開(kāi)了用于區(qū)分在前列腺癌的高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者和在前列腺癌的低復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者的分類(lèi)器。優(yōu)選的分類(lèi)器包括分類(lèi)程序，所述分類(lèi)程序包括測(cè)量選自表2的至少兩種診斷標(biāo)記的表達(dá)水平，其中每種表達(dá)水平相對(duì)于兩種或更多種對(duì)照標(biāo)記的表達(dá)水平的平均值進(jìn)行測(cè)量。隨后將至少兩種診斷標(biāo)記的表達(dá)水平與基于Kattan列線圖的預(yù)測(cè)概率組合，以生成同樣可以是列線圖形式的分類(lèi)器。此處，Kattan列線圖是例如在美國(guó)專(zhuān)利6，409, 664和5，993，388中描述的復(fù)合測(cè)量。Kattan列線圖一般基于下組中的兩個(gè)或更多個(gè)成員術(shù)前(和激素療法前，如果接受的話)PSA值、前列腺切除術(shù)時(shí)的PSA、手術(shù)時(shí)的主要格里森(primary Gleason)、手術(shù)時(shí)的次要格里森、前列腺切除術(shù)格里森總和、前列腺切除術(shù)年份、無(wú)疾病月數(shù)、手術(shù)切緣是否是陽(yáng)性的、癌癥是否在精囊中發(fā)現(xiàn)、是否存在囊外延伸、癌癥是否在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)(如果有的話，則切除)、放射治療前PSA、輻射劑量(如果適用)、手術(shù)切緣是陽(yáng)性還是陰性的(如 果適用)、是否存在精囊牽涉(如果適用)、是否存在淋巴結(jié)牽涉(如果適用)、是否存在囊外牽涉(如果適用)、是否開(kāi)出新輔助激素處方、是否開(kāi)出新輔助放射處方。Kattan列線圖還可以是基于下組中的兩個(gè)或更或多個(gè)成員的復(fù)合測(cè)量治療前PSA水平、組合的格里森級(jí)別、樣品格里森總和、臨床分期、手術(shù)切緣狀態(tài)、在活組織檢查核心中癌癥的核心總長(zhǎng)度中的前列腺囊侵襲最大限度癌癥長(zhǎng)度、核心陽(yáng)性水平百分比、前列腺外延伸、前列腺外延伸水平、細(xì)胞凋亡指數(shù)、一個(gè)或多個(gè)核心中的癌癥百分比、一個(gè)或多個(gè)核心中的高級(jí)別癌癥百分比、總腫瘤體積、癌癥的定位區(qū)、精囊侵襲的存在、精囊侵襲的類(lèi)型、p53、Ki-67、p27、DNA倍性狀態(tài)、淋巴結(jié)狀態(tài)和淋巴管侵襲。用于區(qū)分在前列腺癌的高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者和在前列腺癌的低復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者的優(yōu)選分類(lèi)器要求測(cè)量診斷標(biāo)記MYH11、SSBPl和DPT的表達(dá)水平。 優(yōu)選的對(duì)照標(biāo)記是TUBA、ALASl和ACTGl。備選的優(yōu)選對(duì)照標(biāo)記因如通過(guò)RT-PCR檢測(cè)的相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平而選擇。用于區(qū)分在前列腺癌的高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者和在前列腺癌的低復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者的另一優(yōu)選分類(lèi)器要求測(cè)量選自表2的至少一種診斷標(biāo)記加上MYH11、SSBPl和DPT的表達(dá)水平在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，兩種或更多種診斷標(biāo)記選自表2中呈現(xiàn)的標(biāo)記集合。診斷標(biāo)記的更多具體集合包括本發(fā)明還公開(kāi)了預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)的方法。該方法包括步驟(i)測(cè)定DPT相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)水平；(ii)測(cè)定來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平；和(iii)將DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)于前列腺癌的復(fù)發(fā)概率的評(píng)分。作為轉(zhuǎn)化DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平的步驟的替代，該方法可以具有將DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平與前列腺癌復(fù)發(fā)的至少一種另外指示物組合的步驟，以測(cè)定復(fù)合評(píng)分。此類(lèi)復(fù)合評(píng)分反映前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性。優(yōu)選地，在從前列腺切除術(shù)、激素療法、單試劑化學(xué)療法、雙試劑化學(xué)療法和用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的治療中選擇至少一種治療前，測(cè)定DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平。
非限制性地，本公開(kāi)內(nèi)容還涵蓋用于檢測(cè)至少DPT的表達(dá)水平的試劑盒，該試劑盒包括試劑以及包括特異性識(shí)別DPT的第一探針和特異性識(shí)別選自表2的第二種標(biāo)記的第二探針的第一探針組。該試劑盒可以包括用于將DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平轉(zhuǎn)換成前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性指示物的裝置。該裝置可以是列線圖的形式。更具體地講，優(yōu)選的試劑盒作為下組中的一個(gè)或多個(gè)成員實(shí)現(xiàn)機(jī)械裝置、圖解表示和軟件指令，以實(shí)現(xiàn)用于提供前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性指示物表示的用戶界面。在本發(fā)明的再進(jìn)一步方面，提供含有用于進(jìn)行來(lái)自前列腺腫瘤的三種基因和三種對(duì)照基因測(cè)量的試劑的試劑盒。提供使得基因測(cè)量能夠針對(duì)三種對(duì)照基因的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的指令(任選作為計(jì)算機(jī)代碼)。將這些測(cè)量連同來(lái)自列線圖的預(yù)測(cè)概率一起摻入生成復(fù)發(fā)概率的統(tǒng)計(jì)模型內(nèi)。


圖IA顯示了使用基于來(lái)自157個(gè)患者的獨(dú)立測(cè)試系列的結(jié)果的C-指數(shù)，本文公開(kāi)的分類(lèi)器與列線圖的比較。分類(lèi)器的C-指數(shù)明顯高于列線圖的C-指數(shù)(O. 77與O. 67比較)?！DIB顯示了在關(guān)于測(cè)試集的5年預(yù)測(cè)估計(jì)值和實(shí)際復(fù)發(fā)概率之間的對(duì)應(yīng)。與理想預(yù)測(cè)器相比較，該分類(lèi)器證實(shí)跨越關(guān)于測(cè)試集的預(yù)測(cè)譜的良好校準(zhǔn)，而5年列線圖顯示在檢測(cè)更侵入性病例中的較少準(zhǔn)確度。圖2A顯示了關(guān)于無(wú)PSA復(fù)發(fā)概率的Kaplan-Meier分析，以示出關(guān)于預(yù)測(cè)的低危和高危組中的時(shí)間與PSA復(fù)發(fā)中的差異(HR 6. 85,95% Cl = 3. 77至12. 43，P < . 001，)。在5年時(shí)，在兩個(gè)組之間的PSA復(fù)發(fā)中的絕對(duì)差是58% (75%與17%比較)。圖2B顯示了在圖2A中使用的分類(lèi)器應(yīng)用于具有格里森評(píng)分6或7的患者。圖2C顯示了在圖2A中使用的分類(lèi)器應(yīng)用于顯示病理學(xué)分期pT2或pT3a的患者。圖2D顯示了在圖2A中使用的分類(lèi)器應(yīng)用于具有術(shù)前PSA濃度彡10ng/mL或10< PSA彡20ng/mL的患者。圖2E顯示了在圖2A中使用的分類(lèi)器應(yīng)用于具有陽(yáng)性或陰性手術(shù)切緣的患者。圖3顯示了當(dāng)應(yīng)用這些測(cè)試集時(shí)，基于每個(gè)模型的最高準(zhǔn)確度的截止值應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式列線圖廣泛用于預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)。最廣泛使用的列線圖是在美國(guó)專(zhuān)利6，409, 664和5，993，388中描述的Kattan列線圖，所述兩個(gè)專(zhuān)利整體并入本說(shuō)明書(shū)。對(duì)于未接受用于其前列腺癌的手術(shù)治療的那些人，這些列線圖摻入下述信息最近的PSA(前列腺特異性抗原)值、主要和次要格里森級(jí)別、醫(yī)生的臨床分期評(píng)價(jià)(使用1992年或1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)系統(tǒng))、推薦的放射療法(如果適用)、在活組織檢查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性核心數(shù)目、在活組織檢查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的陰性核心數(shù)目、是否已開(kāi)出新輔助激素處方、和是否已開(kāi)出新輔助放射處方。對(duì)于執(zhí)行手術(shù)的那些人，因素包括術(shù)前(和激素療法前，如果接受的話)PSA值、前列腺切除術(shù)時(shí)的PSA、手術(shù)時(shí)的主要格里森、手術(shù)時(shí)的次要格里森、前列腺切除術(shù)格里森總和、前列腺切除術(shù)年份、無(wú)疾病月數(shù)、手術(shù)切緣是否是陽(yáng)性的、癌癥是否在精囊中發(fā)現(xiàn)、是否存在囊外延伸、癌癥是否在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)(如果有的話，則切除)、放射治療前PSA、輻射劑量(如果適用)、手術(shù)切緣是陽(yáng)性還是陰性的(如果適用)、是否存在精囊牽涉(如果適用)、是否存在淋巴結(jié)牽涉(如果適用)、是否存在囊外牽涉(如果適用)、是否開(kāi)出新輔助激素處方、是否開(kāi)出新輔助放射處方。這種信息在電子表格中組合，例如，并且簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)處理提供用于測(cè)定預(yù)后的分析。
本發(fā)明的方法和試劑盒最優(yōu)選與這些列線圖和它們提供的信息結(jié)合使用。本發(fā)明的方法和試劑盒還涉及一組基因的檢測(cè)。優(yōu)選地，這個(gè)組中的基因之一的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照標(biāo)記中的至少一種進(jìn)行測(cè)量。更優(yōu)選地，測(cè)量三種基因和三種對(duì)照的表達(dá)水平。最優(yōu)選的基因是MYHlI、SSBPl和DPT。最優(yōu)選的對(duì)照是ALASl、TUBA和ACTGl。如實(shí)施例中所述，基因MYHll或DPT的更高表達(dá)指示比此類(lèi)過(guò)表達(dá)不可見(jiàn)的情況更強(qiáng)的剩余無(wú)前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性。更高的SSBPl表達(dá)水平指示更強(qiáng)的復(fù)發(fā)可能性。對(duì)應(yīng)于測(cè)量其表達(dá)水平的基因的核酸序列以及用于測(cè)量此類(lèi)表達(dá)水平的序列在本說(shuō)明書(shū)中稱(chēng)為標(biāo)記。其他目的序列包括用作測(cè)定對(duì)照的基因，例如ALASUTUBA和ACTG1。標(biāo)記由用于檢測(cè)基因表達(dá)的任何方法進(jìn)行檢測(cè)；優(yōu)選地，這些是基于擴(kuò)增的方法例如PCR、其變化和替代方法。最優(yōu)選地，使用RTPCR。對(duì)于特定標(biāo)記特異性的核酸探針或報(bào)道分子優(yōu)選用于檢測(cè)腫瘤組織中的標(biāo)記基因的表達(dá)?？梢允褂闷渌飳W(xué)液體或組織，包括前列腺組織、尿、尿道洗滌物、血液和血液組分例如血清、射精和由其可以預(yù)期前列腺蛋白質(zhì)的其他樣品。可以使用含有可檢測(cè)量的有關(guān)多核苷酸的任何樣品。一種公開(kāi)的方法包括使含有標(biāo)記的靶細(xì)胞與結(jié)合核酸的試劑接觸。靶細(xì)胞組分是核酸例如RNA。該試劑優(yōu)選包括擴(kuò)增且檢測(cè)靶序列的此類(lèi)探針和引物。例如，該試劑可以包括與其自身報(bào)道區(qū)段組合或鍵合的引發(fā)序列，例如稱(chēng)為Scorpion試劑或Scorpion報(bào)道基因且在授予Whitcombe等人的美國(guó)專(zhuān)利6，326，145和6，270, 967 (以引用方式整體并入本文)中描述的那些。盡管它們并不相同，但術(shù)語(yǔ)“引物”和“引發(fā)序列”在本說(shuō)明書(shū)中可用于指引發(fā)核酸序列擴(kuò)增的分子或分子的部分。優(yōu)選引物能夠開(kāi)始引物延伸產(chǎn)物的合成，該引物延伸產(chǎn)物與多態(tài)性位點(diǎn)鏈基本上互補(bǔ)。引物和/或探針可以使用任何合適的方法包括自動(dòng)化方法進(jìn)行制備。有利于合成的環(huán)境條件包括存在三磷酸核苷和用于聚合反應(yīng)的試劑(例如DNA聚合酶)以及適當(dāng)?shù)臏囟扰cpH。引物或引發(fā)序列的引發(fā)區(qū)段優(yōu)選為單鏈，以使擴(kuò)增效率最大化，但也可以為雙鏈。如果為雙鏈，則在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先應(yīng)處理引物，以分離兩條鏈。引物必須足夠長(zhǎng)，以在存在聚合反應(yīng)誘發(fā)劑的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。優(yōu)選的引物最優(yōu)選是八個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。引物的確切長(zhǎng)度取決于諸如溫度、緩沖液和核苷酸組成之類(lèi)的因素。寡核苷酸引物最優(yōu)選含有約12-20個(gè)核苷酸，但它們也可以含有更多或更少核苷酸。當(dāng)互補(bǔ)的核酸鏈被分離時(shí)，不論核酸原來(lái)是雙鏈或是單鏈，分離后的鏈都適合用作合成另外的核酸鏈的模板。這種合成在允許引物與模板的雜交發(fā)生的條件下進(jìn)行。通常，合成是在緩沖的水溶液中進(jìn)行，該緩沖的水溶液優(yōu)選的PH值為7-9，最優(yōu)選的pH值為約8。優(yōu)選將摩爾過(guò)量(對(duì)于基因組核酸，通常為約108 1，引物模板)的兩種寡核苷酸引物加入含有分離的模板鏈的緩沖液中。當(dāng)本發(fā)明的方法用于診斷應(yīng)用時(shí)，互補(bǔ)鏈的量可能是未知的，因此無(wú)法始終確切知道引物的量相對(duì)于互補(bǔ)鏈的量。然而在實(shí)踐中，當(dāng)復(fù)雜核酸長(zhǎng)鏈的混合物中含有待擴(kuò)增序列時(shí)，所添加的引物的摩爾量通常超出互補(bǔ)鏈(模板)的摩爾量。優(yōu)選采用較大的摩爾過(guò)量，以提高該方法的效率。聚合反應(yīng)試劑可以為會(huì)實(shí)現(xiàn)引物延伸產(chǎn)物合成的任何化合物或系統(tǒng)，優(yōu)選為酶。用于這個(gè)目的的合適酶包括例如大腸桿菌(E. coli)DNA聚合酶I、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、其他可用的DNA聚合酶、聚合酶突變體、逆轉(zhuǎn)錄酶及其他酶，包括熱穩(wěn)定的酶(例如在實(shí)施足以引起變性的高溫后執(zhí)行引物延伸的那些酶)優(yōu)選試劑為T(mén)aq聚合酶。合適的酶將有利于核苷酸以正確的方式組合，從而形成與每個(gè)基因座核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。通常，合成將在每個(gè)引物的3'端開(kāi)始，并沿著模板鏈的5'方向繼續(xù)進(jìn)行，直到合成結(jié)束，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的分子。然而，也可能存在在5'端開(kāi)始合成并在其他方向繼續(xù)的聚合反應(yīng)試劑，其方法與上述相同。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，采用表達(dá)比率。確定在獲得的擴(kuò)增標(biāo)記量和擴(kuò)增的參考標(biāo)記或擴(kuò)增的對(duì)照標(biāo)記區(qū)量之間的比率可以實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。這可以使用定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)完成。比率可以插入統(tǒng)計(jì)模型內(nèi)，以測(cè)定前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性。本發(fā)明的試劑盒可優(yōu)選這樣由多種組分構(gòu)成，從而使得這些組分都含有至少一種引物或探針或檢測(cè)分子(如Scorpion報(bào)告基因)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包括用于擴(kuò)增且檢測(cè)標(biāo)記區(qū)段的試劑。任選地，試劑盒包括樣品制備試劑和/或制品(如管)，以從樣品中提取核酸。在優(yōu)選試劑盒中，包括了 RTPCR所需的試劑，例如，對(duì)應(yīng)的PCR引物組、熱穩(wěn)定的聚合酶(如Taq聚合酶)和合適的檢測(cè)試劑(如水解探針或分子信標(biāo))。在任選的優(yōu)選試劑盒中，檢測(cè)試劑為Scorpion報(bào)告基因或試劑。也可以使用單染料引物或雙鏈DNA特異性熒光染料(例如溴化乙錠)。試劑盒中的額外材料可以包括合適的反應(yīng)管或小瓶、屏蔽組合物，通常是蠟珠，任選包括鎂；必要的緩沖液和試劑，例如dNTP ;對(duì)照核酸和/或任何額外的緩沖液、化合物、輔因子、離子組成成分、蛋白質(zhì)和酶、聚合物等。任選地，試劑盒包括核酸提取試劑和材料。在本發(fā)明的優(yōu)選試劑盒中，提供對(duì)具有前列腺樣品的患者進(jìn)行測(cè)定的說(shuō)明書(shū)。最優(yōu)選提供由計(jì)算機(jī)指令編碼的制品用于制備來(lái)自Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析或其他統(tǒng)計(jì)比較器的預(yù)測(cè)。將該指令裝載到計(jì)算機(jī)例如通用計(jì)算機(jī)內(nèi)，從而使得當(dāng)基因分析的值和任選的Kattan參數(shù)輸入程序內(nèi)時(shí)，該計(jì)算機(jī)提供復(fù)發(fā)可能性(高與低比較或者數(shù)字指示物)作為輸出。在本發(fā)明的優(yōu)選試劑盒中，還可以提供列線圖的機(jī)械實(shí)現(xiàn)。此類(lèi)實(shí)現(xiàn)可以使用基于紙的組分或移動(dòng)機(jī)械部分，以允許考慮由列線圖使用的個(gè)別變量。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I目的需要復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的準(zhǔn)確估計(jì)值用于具有臨床局限性前列腺癌的患者的最佳管理。將列線圖和新型分子預(yù)測(cè)物組合到前列腺特異性抗原(PSA)復(fù)發(fā)的新預(yù)后模型內(nèi)。這個(gè)研究設(shè)計(jì)為鑒定與具有臨床局限性前列腺癌的患者中的PSA復(fù)發(fā)相關(guān)的基因，目的是開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)分類(lèi)器，所述預(yù)測(cè)分類(lèi)器可容易地應(yīng)用于目前常規(guī)臨床實(shí)踐中，以管理具有局限于器官的疾病的患者。此處，我們報(bào)道了臨床可行測(cè)試的開(kāi)發(fā)，所述臨床可行測(cè)試摻入可通過(guò)RTPCR測(cè)量的三種新型基因標(biāo)記的表達(dá)值，和在前列腺癌的臨床管理中廣泛使用的工具Kattan術(shù)后列線圖(11)，以評(píng)價(jià)PSA復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。最后，我們顯示與Kattan列線圖相比較，這種新分類(lèi)器提供對(duì)于預(yù)測(cè)在這個(gè)低?；颊呷后w中的生物化學(xué)復(fù)發(fā)的改善的準(zhǔn)確度。材料和方法分析來(lái)自福爾馬林固定的、石蠟包埋(FFPE)的局限性前列腺癌患者組織的基因表達(dá)概況，以鑒定與PSA復(fù)發(fā)結(jié)合的基因。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)再現(xiàn)所鑒定標(biāo)記的概況。來(lái)自這些基因中的三種的RTPCR概況連同來(lái)自Kattan術(shù)后列線圖的輸出一起用于產(chǎn)生PSA復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)模 型。結(jié)果在變量選擇后，建立將三種基因的表達(dá)值和術(shù)后列線圖組合的PSA復(fù)發(fā)模型。與關(guān)于列線圖O. 67的C-指數(shù)相比較，3基因加上列線圖模型在驗(yàn)證集中以O(shè). 77的一致性指數(shù)(c-指數(shù))預(yù)測(cè)5年P(guān)SA復(fù)發(fā)。這個(gè)模型鑒定通過(guò)列線圖未鑒定的處于復(fù)發(fā)的高危中的患者亞組。結(jié)論當(dāng)針對(duì)5年列線圖相比較時(shí)，這種新的基于基因的分類(lèi)器具有優(yōu)良的預(yù)測(cè)力，以評(píng)價(jià)具有局限于器官的前列腺癌的患者中的PSA復(fù)發(fā)危險(xiǎn)。這種分類(lèi)器應(yīng)提供患者進(jìn)入高危和低危組內(nèi)的更準(zhǔn)確分層，用于治療決定和輔助臨床試驗(yàn)。材料和方法患者和腫瘤樣品患者信息得自圣文森校園前列腺癌組(St. Vincent’ s Campus Prostate CancerGroup) (SVCPCG)數(shù)據(jù)庫(kù)(人類(lèi)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(Human Research Ethics CommitteeApproval)H00/088)。從1990年I月到2001年12月，960個(gè)患者在雪梨的圣文森醫(yī)院(StVincent’s Hospital, Sydney)用根治性前列腺切除術(shù)(RP)治療前列腺癌，沒(méi)有術(shù)前治療。在目前研究在評(píng)價(jià)的具有臨床局限性疾病的316個(gè)連續(xù)患者亞組是其病理學(xué)分期范圍從PT2A到pT3A的960的那些患者；對(duì)于審查患者的最低限度隨訪是五年；RP是初步治療；并且來(lái)自RP樣品的組織塊可以就在基因表達(dá)概況分析實(shí)驗(yàn)中的使用進(jìn)行評(píng)價(jià)。PSA復(fù)發(fā)的日期定義為在RP后在血清PSA ^ 0. 2ng/mL中的第一次增加的日期。將這些患者隨機(jī)分成訓(xùn)練集和測(cè)試集。測(cè)試集單獨(dú)用于驗(yàn)證目的。取決于變量是連續(xù)的、時(shí)間至事件的還是類(lèi)別的，通過(guò)t檢驗(yàn)、時(shí)序和卡方檢驗(yàn)來(lái)估計(jì)在訓(xùn)練集和測(cè)試集之間的臨床變量分布中的差異。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都是雙側(cè)的，并且顯著性定義為P < 0. 05?；虮硖艣r分析將來(lái)自每個(gè)FFPE組織塊的六μ m切片提交給病理學(xué)評(píng)議(JGK)，并且顯微解剖(macrodissected)以確保> 30 %的惡性上皮用于使用高純度RNA石臘試劑盒(HighPure RNA Paraffin kit)(印第安納州的印第安納波利斯市的羅氏診斷公司(RocheDiagnostics, Indianapolis, IN))的總 RNA 提取。用1200基因定制設(shè)計(jì)的DNA介導(dǎo)的退火、選擇、連接和延伸微陣列(DASL)(加利福尼亞州的圣地亞哥市的宜曼達(dá)公司(Illumina, San Diego,CA)),對(duì)訓(xùn)練系列中的所有總RNA樣品執(zhí)行基因表達(dá)概況分析實(shí)驗(yàn)(22)。DASL陣列的基因表達(dá)概況和設(shè)計(jì)可以在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(登記懸而未決的)中進(jìn)行評(píng)價(jià)?；谠谇傲邢侔┲械脑缙谘芯浚x擇三種對(duì)照基因ALASl、TUBA 和 ACTGl 用于微陣列和 RTPCR 分析(12，23)。使用存活模式的微陣列顯著性分析(SAM)分析用于測(cè)量在陣列上的每種基因的預(yù)后顯著性(24-26)。探針通過(guò)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的絕對(duì)值進(jìn)行排序。通過(guò)數(shù)據(jù)排列計(jì)算假發(fā)現(xiàn)率。RTPCR測(cè)定設(shè)計(jì)用于頂部排序的預(yù)后標(biāo)記候選物(η = 30)，包括對(duì)于增加和降低的探針在最低報(bào)道的發(fā)現(xiàn)率下的所有基因。在訓(xùn)練樣品中在陣列和RTPCR數(shù)據(jù)之間具有弱皮爾森系數(shù)(< O. 4)的基因排除進(jìn)一步分析。預(yù)后模型的構(gòu)建使用紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Centre)在線計(jì)算器(http://www. mskcc. org/mskcc/html/10088. cfm),使用術(shù)后歷史模型對(duì)于每個(gè)個(gè)體計(jì)算五年列線圖復(fù)發(fā)評(píng)分。為了選擇用于多變量模型的變量，使用訓(xùn)練樣品通過(guò)LI正則化路徑算法處理來(lái)自RTPCR的候選基因的SCT值以及來(lái)自列線圖的預(yù)測(cè)概率(25)。通過(guò)使用路徑算法交叉驗(yàn)證訓(xùn)練系列以對(duì)過(guò)度擬合Cox模型的潛力設(shè)置不同極限，選擇具有 最小誤差的標(biāo)志。通過(guò)使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型將這些所選變量與訓(xùn)練集擬合，建立用于采納的最終預(yù)測(cè)模型。在假陽(yáng)性和假陰性的代價(jià)相等的假定下，選擇用于模型的高危和低危分層的截止值，以及用于列線圖的截止值。在這個(gè)假定下，選擇給出最高訓(xùn)練集準(zhǔn)確度的截止值(由正確分類(lèi)的患者的總數(shù)目限定)。預(yù)后模型的驗(yàn)證為了估計(jì)預(yù)測(cè)性預(yù)后模型就測(cè)試集中的實(shí)際無(wú)復(fù)發(fā)而言的準(zhǔn)確度，由通過(guò)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸估計(jì)的預(yù)測(cè)5年無(wú)復(fù)發(fā)概率和在5年時(shí)的實(shí)際無(wú)復(fù)發(fā)概率的Kaplan-Meier估計(jì)量生成校準(zhǔn)曲線(24，27)。通過(guò)基于來(lái)自訓(xùn)練集的預(yù)選截止值將測(cè)試集患者分成低危和高危組，通過(guò)Kaplan-Meier曲線和風(fēng)險(xiǎn)比率評(píng)價(jià)最終預(yù)后模型在測(cè)試集中的表現(xiàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析在R，版本2. 5. O (www. r-project. org)中進(jìn)行?；颊咛卣鲝?16個(gè)前列腺切除術(shù)FFPE組織中分離總RNA，并且由于RNA降解排除20個(gè)樣品。在訓(xùn)練集和測(cè)試集中包括的患者的臨床和病理學(xué)特征概括于表I中。隨訪中值是72個(gè)月，并且從根治性前列腺切除術(shù)到生物化學(xué)復(fù)發(fā)的中值時(shí)間在復(fù)發(fā)的那些人中是34個(gè)月。296個(gè)患者中的九十八個(gè)發(fā)展復(fù)發(fā)，包括在手術(shù)5年內(nèi)發(fā)展復(fù)發(fā)的74個(gè)患者。訓(xùn)練系列由138個(gè)患者組成，而剩余158個(gè)留出用于測(cè)試集。在這兩個(gè)患者集合之間在臨床病理學(xué)特征中不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(表I)?；虮硖蛦巫兞糠治鐾ㄟ^(guò)DASL陣列分析來(lái)自138個(gè)患者的訓(xùn)練集的RNA樣品。SAM算法的排列揭示對(duì)于在DASL陣列上的20種基因0%的假發(fā)現(xiàn)率。如通過(guò)來(lái)自SAM分析的評(píng)分值排序的前30種基因具有6. 8%的假發(fā)現(xiàn)率。這30種基因隨后通過(guò)RTPCR分析使用相同訓(xùn)練集進(jìn)行評(píng)價(jià)。30所選基因中的六種顯示在DASL和RTPCR之間小于O. 4的關(guān)聯(lián)，并且因此從進(jìn)一步分析中去除。通過(guò)Cox回歸測(cè)量每種基因?qū)o(wú)復(fù)發(fā)概率的作用。風(fēng)險(xiǎn)比率定量對(duì)于I個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化CT的每個(gè)增量PSA復(fù)發(fā)的相對(duì)危險(xiǎn)。對(duì)于訓(xùn)練集和測(cè)試集記錄風(fēng)險(xiǎn)比率和P值(表2)。24種標(biāo)記中的二十三種(除了標(biāo)記HIST1H3D外)繼續(xù)與測(cè)試集中的復(fù)發(fā)具有顯著關(guān)聯(lián)。在相同分析中，5年術(shù)后列線圖也是訓(xùn)練集和測(cè)試集中的PSA復(fù)發(fā)的顯著預(yù)測(cè)物(P值分別為.OOl和.005)。實(shí)施例2 對(duì)實(shí)施例I的RTPCR訓(xùn)練集執(zhí)行進(jìn)一步的變量選擇，以建立多變量預(yù)后分類(lèi)器。通過(guò)LI正則化算法選擇四個(gè)變量3種基因(DPT、SSBP1和MYH11)和5年列線圖。這4個(gè)變量隨后使用Cox回歸分析對(duì)訓(xùn)練集建模。分類(lèi)器驗(yàn)證和存活分析當(dāng)對(duì)157個(gè)患者的獨(dú)立測(cè)試系列測(cè)試該預(yù)后模型時(shí)，分類(lèi)器的C-指數(shù)明顯高于列線圖的C-指數(shù)(O. 77與O. 67比較)(圖1A)。當(dāng)對(duì)來(lái)自相同研究機(jī)構(gòu)的由960個(gè)患者組成的連續(xù)前列腺癌患者同類(lèi)者(cohort)測(cè)試時(shí)，所述患者并不限于局限于器官的疾病，列線圖表現(xiàn)與公布的研究(O. 72的C-指數(shù))一致(圖1A)。我們隨后使用校準(zhǔn)曲線，以測(cè)量關(guān)于測(cè)試集的5年預(yù)測(cè)估計(jì)量與實(shí)際復(fù)發(fā)概率有多接近。與理想預(yù)測(cè)器相比較，該分類(lèi)器證 實(shí)跨越關(guān)于測(cè)試集的預(yù)測(cè)譜的良好校準(zhǔn)，而5年列線圖顯示在檢測(cè)更侵入性病例中的較少準(zhǔn)確度(圖1B)。來(lái)自測(cè)試集的截止值用于將測(cè)試集患者置于高?；虻臀＝M內(nèi)。通過(guò)基于來(lái)自訓(xùn)練集的截止值(所述截止值對(duì)訓(xùn)練樣品產(chǎn)生最高準(zhǔn)確度)將患者分成低危和高危組，對(duì)于測(cè)試集樣品生成Kaplan-Meier曲線。由測(cè)試集的預(yù)測(cè)的5年無(wú)疾病存活以及基于以O(shè). 3、O. 5,0. 7和O. 9的預(yù)測(cè)概率中的切割(cuts)在5年時(shí)的Kaplan-Meier估計(jì)量，生成校準(zhǔn)曲線。關(guān)于無(wú)PSA復(fù)發(fā)概率的Kaplan-Meier分析顯示關(guān)于預(yù)測(cè)的低危和高危組中的時(shí)間與PSA復(fù)發(fā)中的高度顯著差異(HR 6. 85,95% Cl = 3. 77至12. 43，P < · 001，圖2A)。在5年時(shí)，在兩個(gè)組之間的PSA復(fù)發(fā)中的絕對(duì)差是58% (75%與17%比較)。此外，該分類(lèi)器還代表關(guān)于下述患者亞組中的PSA復(fù)發(fā)的強(qiáng)預(yù)后因素格里森評(píng)分6或7(圖2B)，病理學(xué)分期 pT2 或 pT3a(圖 2C)，術(shù)前 PSA 濃度彡 10ng/mL 或 10 < PSA ( 20ng/mL(圖 2D)，和陽(yáng)性或陰性手術(shù)切緣(圖2E)。在訓(xùn)練集和測(cè)試集中包括的患者的臨床和病理學(xué)特征概括于表I中。隨訪中值是72個(gè)月。從根治性前列腺切除術(shù)到生物化學(xué)復(fù)發(fā)的平均時(shí)間和中值時(shí)間分別為40個(gè)月和34個(gè)月。296個(gè)患者中的九十八個(gè)(33%)發(fā)展復(fù)發(fā)，包括在手術(shù)5年內(nèi)發(fā)展復(fù)發(fā)的74(25% )個(gè)患者。
_8] 改良的預(yù)后模型的應(yīng)用為了估計(jì)該模型對(duì)患者管理的潛在影響，我們比較了使用該分類(lèi)器與5年術(shù)后列線圖相比較對(duì)測(cè)試同類(lèi)者的預(yù)后分層的準(zhǔn)確度。我們使用基于每個(gè)模型的最高準(zhǔn)確度的截止值，且隨后將這些應(yīng)用于測(cè)試集(圖3)。在157個(gè)測(cè)試集患者中，由列線圖預(yù)測(cè)為低危的136個(gè)具有23. 5%的復(fù)發(fā)率(32/136)。相比之下，當(dāng)應(yīng)用于這個(gè)組時(shí)，該分類(lèi)器將14個(gè)患者鑒定為具有復(fù)發(fā)的“高危險(xiǎn)”，包括具有已記錄的復(fù)發(fā)的12個(gè)患者(86% )。在該分類(lèi)器對(duì)于其賦予“低?！睜顟B(tài)的122個(gè)患者中，20個(gè)患者(16.4%)經(jīng)歷PSA復(fù)發(fā)。相反地，由列線圖預(yù)測(cè)為“高?！钡煞诸?lèi)器預(yù)測(cè)為“低?！钡?1個(gè)患者無(wú)一具有已記錄的復(fù)發(fā)。因而，該分類(lèi)器對(duì)這個(gè)系列的前列腺癌患者賦予除由術(shù)后列線圖提供的那種外的另外預(yù)后信息。實(shí)施例3 RTPCR測(cè)定設(shè)計(jì)用于候選標(biāo)記和三種(3)對(duì)照基因。多重PCR引物和探針設(shè)計(jì)用于標(biāo)記。CT值針對(duì)3種對(duì)照基因的平均值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
每種標(biāo)準(zhǔn)化的基因針對(duì)DASL信號(hào)值進(jìn)行標(biāo)繪。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄15，并且用基因特異性引物預(yù)擴(kuò)增。隨后使用ABI PRISMu 7900序列檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(APPLIED BIOSYSTEMS))定量預(yù)擴(kuò)增的 cDNA。DPT-1232 3096 正向引物GGGTTGGAAGGATTTCCTGAA(SEQ ID NO I)反向引物CCCTGCACTCATTTTCCTTACTG(SEQ ID NO 2)探針5' Fam-3' MGB 標(biāo)記的探針 TAGAAGACAAACGTTAGCATAC (SEQ ID NO 3)MYHl 1-5893 460 正向引物GCACTCAAGAGCAAGCTCAGAG(SEQ ID NO 4) 反向引物TCGTTTCCTCGCCTGGTG(SEQ ID NO 5)探針5' Fam-3' MGB 標(biāo)記的探針 AGGAAACTTCGCAGTGAT (SEQ ID NO 6)SSBP1-291 2990 正向引物AGTTTACCAACTGGGTGATGTCAG(SEQ ID NO 7)反向引物5' Fam-3' MGB TTGATATGCCACGTCTCTGAGG(SEQ ID NO 8)標(biāo)記的探針ATGGCACAGAATATCAG(SEQ ID NO 9)實(shí)施例4 還鑒定了另外的實(shí)驗(yàn)對(duì)象組，雖然它與優(yōu)選實(shí)驗(yàn)對(duì)象組相比較是亞最佳的，但憑自身的實(shí)力也是有用的。備選實(shí)驗(yàn)對(duì)象組各自可用作標(biāo)準(zhǔn)的單獨(dú)實(shí)驗(yàn)對(duì)象組或與Kattan列線圖組合使用，所述Kattan列線圖的表現(xiàn)通過(guò)備選實(shí)驗(yàn)對(duì)象組各自得到改善。箭頭符號(hào)指示對(duì)應(yīng)于模型的C-指數(shù)。Altl FLNC+RASL12+MYLK+FLNA+N0M_H5- > O. 71FLNC+RASL12+MYLK+FLNA- > O. 67Alt2 GASI+SMTN+LMODI+HIST1H3D+N0M_H5- > 0. 74GASI+SMTN+LMODI+HISTIH3D- > 0. 71Alt3 S0RBS1+PDLIM7+LIMS2+MT1X+N0M_H5- > 0. 73S0RBS1+PDLIM7+LIMS2+MT1X- > 0. 69實(shí)施例5 還鑒定的是用于剩余標(biāo)記的探針和引物對(duì)。它們呈現(xiàn)于表3中。實(shí)施例6 還開(kāi)發(fā)了用于MYHl 1、DPT和SSBPl以及ALAS、ACTG和TUBA的備選引物和探針組。與實(shí)施例3的引物和探針組相比較，結(jié)果至少一致或更佳。他們備選引物和探針是DPT558F TGCAGTGGAAAGGGATCGC(SEQ ID NO 10)DPT640R CCCAGATTTGGTATGTGGCA(SEQ ID NO 11)DPT588P_FAM CATAATGTGCCGGATGACTGAATA (SEQ ID NO 12)MYH 5895F GCACTCAAGAGCAAGCTCAGA(SEQ ID NO 13)MYH 5964R TAGAAGGAACGAAAGAGGTCTC(SEQ ID NO 14)
MYH 5925P_0range CCACAGGAAACTTCGCAGTGAT(SEQ ID NO 15)SSBPl ；281F GGGATAGTGAAGTTTACCAAC(SEQ ID NO 16)SSBPl ；359R TTGATATGCCACGTCTCTGA(SEQ ID NO 17)SSBPl ；312P (ORANGE)CAGTCAAAAGACAACATGGCACAG(SEQ ID NO 18)TUBA 586F TTCGCAAGCTGGCTGA(SEQ ID NO 19)TUBA 666R CATGAGCAGGGAGGTGAA(SEQ ID NO 20)TUBA 639P_Cy5(Quasar)AGCTTTGGTGGGGGAACTGGTTCT(SEQ ID NO 21)ALAS918F CAAGTGTCAGTCTGGTGCA (SEQ ID NO 22) ALAS984R GTTGTTTCAAAGTGTCCATAAC(SEQ ID NO 23)ALAS948P_FAM CTAGGAATGAGTCGCCACCCAC(SEQ ID NO 24)ACTG 862F AGCCTTCCTTCCTGGGTAT(SEQ ID NO 25)ACTG 903R TGATGGAGTTGAAGGTGGT(SEQ ID NO 26)ACTG 882P_Cy5(Quasar)GAATCTTGCGGCATCCACGA(SEQ ID NO 27)討論:就與診斷批準(zhǔn)平臺(tái)一起測(cè)量FFPE組織中的小基因集合表達(dá)的能力而言，所公開(kāi)分類(lèi)器的相對(duì)低水平的復(fù)雜性也是重要的。這些顯著進(jìn)展解決了影響在臨床診斷設(shè)置中成功實(shí)現(xiàn)這種預(yù)測(cè)工具的可能性的某些關(guān)鍵因素。需要極小濃度的衍生自FFPE組織的RNA也促進(jìn)其對(duì)常規(guī)病理學(xué)樣品包括術(shù)前經(jīng)直腸活組織檢查的潛在長(zhǎng)期適用性。前列腺癌相關(guān)基因表達(dá)的這種系統(tǒng)評(píng)價(jià)與PSA復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)，以便開(kāi)發(fā)具有潛在廣泛臨床效用的在臨床局限性前列腺癌中的復(fù)發(fā)的基于基因的分類(lèi)器。使用定制的DASL陣列(允許高流通量基因表達(dá)概況分析衍生自FFPE組織的RNA的微陣列平臺(tái))鑒定新型基因預(yù)測(cè)器(22)。這個(gè)研究的關(guān)鍵組分是定制的DASL陣列基因集合的設(shè)計(jì)，所述DASL陣列基因集合基于通過(guò)公布數(shù)據(jù)集的再分析鑒定的基因標(biāo)記(12，13)、內(nèi)部基因表達(dá)數(shù)據(jù)(未公布的)、和先前牽涉前列腺癌進(jìn)展的標(biāo)記(14，16，17)。這提供了關(guān)于在這個(gè)研究中最顯著的那30種基因的獨(dú)立驗(yàn)證程度。通過(guò)RTPCR進(jìn)一步驗(yàn)證在基因表達(dá)陣列分析中與PSA復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)的24種基因標(biāo)記，以產(chǎn)生優(yōu)選的3-基因標(biāo)志(DPT、MYH11和SSBP1)，當(dāng)與建立的列線圖組合時(shí)，所述優(yōu)選的3-基因標(biāo)志導(dǎo)致PSA復(fù)發(fā)的新分類(lèi)器。隨后在獨(dú)立的患者組中驗(yàn)證這種分類(lèi)器。DPT和MYHll是新型前列腺癌預(yù)后標(biāo)記，而SSBPl先前已與侵入性前列腺癌相關(guān)(17)ο這種新分類(lèi)器的價(jià)值超過(guò)用于前列腺癌復(fù)發(fā)的廣泛使用的列線圖的評(píng)價(jià)顯示該新分類(lèi)器鑒定具有復(fù)發(fā)的低危險(xiǎn)和高危險(xiǎn)的患者，具有比單獨(dú)的術(shù)后列線圖大得多的準(zhǔn)確度(9)。此處呈現(xiàn)的分類(lèi)器也能夠?qū)⒒诔Ｒ?guī)臨床病理學(xué)參數(shù)的臨床相關(guān)亞組內(nèi)的患者分層為高危和低危復(fù)發(fā)組。值得注意的是，分層具有格里森6和7癌癥的患者的能力代表超過(guò)目前方法的在預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度中的顯著進(jìn)展。PSA復(fù)發(fā)作為前列腺癌的顯著終點(diǎn)的用途存在爭(zhēng)議，因?yàn)閮H一小部分經(jīng)歷復(fù)發(fā)的患者進(jìn)展至臨床顯著疾病。這些關(guān)系將得到更明確地確定，因?yàn)檫@個(gè)同類(lèi)者隨著關(guān)于轉(zhuǎn)移和死于PrCa的數(shù)據(jù)而趨于完善(matures)。然而，明確的是當(dāng)大多數(shù)醫(yī)生和患者考慮進(jìn)一步的治療選項(xiàng)時(shí)，上升的前列腺切除術(shù)后PSA的檢測(cè)是主要決定點(diǎn)(5)。在這個(gè)背景下，使用5年列線圖估計(jì)這種分類(lèi)器的潛在影響是有效的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)前列腺切除術(shù)后的生物化學(xué)復(fù)發(fā)在5年內(nèi)出現(xiàn)。
重要的是當(dāng)針對(duì)前列腺癌中的分子表型和預(yù)后的其他公布標(biāo)志和基因標(biāo)記加以考慮時(shí)，這種新分類(lèi)器作為決定工具的影響(12-20)。這個(gè)研究是獨(dú)特的，特別開(kāi)發(fā)用于幫助預(yù)測(cè)在具有臨床局限性疾病的前列腺癌患者中的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)，因?yàn)檫@些患者代表在美國(guó)>80%的新近診斷的 前列腺癌病例。雖然公布的標(biāo)志和基因標(biāo)記已從代表病理學(xué)分期譜的患者同類(lèi)者中鑒定，但這個(gè)研究中的訓(xùn)練和測(cè)試同類(lèi)者限于局限于器官的前列腺癌。在預(yù)測(cè)工具的開(kāi)發(fā)中使用的患者組與預(yù)期靶組之間具有一致性的重要性通過(guò)與先前報(bào)道相比較的5年列線圖在臨床局限性患者的這個(gè)同類(lèi)者中的相對(duì)低表現(xiàn)得到強(qiáng)化。根據(jù)進(jìn)一步分析，這可能是由于在這個(gè)研究中僅評(píng)價(jià)局限于器官的病例的局限性。當(dāng)對(duì)來(lái)自相同研究機(jī)構(gòu)的連續(xù)前列腺癌患者同類(lèi)者測(cè)試時(shí)，所述患者并不限于局限于器官的疾病，列線圖表現(xiàn)與先前研究一致(9，11)。該分類(lèi)器的相對(duì)低水平的復(fù)雜性也是重要的。伴隨測(cè)量FFPE組織中的小基因集合表達(dá)的能力和批準(zhǔn)用于在存檔樣品中的診斷測(cè)試的平臺(tái)的使用，它是顯著的進(jìn)展，因?yàn)樗鉀Q了影響在臨床診斷設(shè)置中成功實(shí)現(xiàn)這種預(yù)測(cè)工具的可能性的某些關(guān)鍵因素。要求低濃度的衍生自FFPE組織的RNA也促進(jìn)其對(duì)常規(guī)病理學(xué)樣品包括術(shù)前經(jīng)直腸活組織檢查的潛在長(zhǎng)期適用性?，F(xiàn)在需要在手術(shù)和術(shù)前活組織檢查的外部同類(lèi)者中的進(jìn)一步驗(yàn)證，包括在活組織檢查中重復(fù)基因選擇，以證實(shí)這種分類(lèi)器在術(shù)前設(shè)置中的更廣泛適用性。用于局限性前列腺癌的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)分類(lèi)器的實(shí)現(xiàn)具有對(duì)于早期前列腺癌的患者管理的重要牽涉。具有局限性疾病和高危特征的患者很可能獲益于輔助療法，包括激素、輻射和全身治療，并且該利益應(yīng)在治療試驗(yàn)中加以估計(jì)(7，28，29)。采用此類(lèi)試劑的早期臨床試驗(yàn)在激素抗拒性設(shè)置中正在進(jìn)行，但最終可以在局限性前列腺癌中作為輔助療法進(jìn)行測(cè)試
(30)。這些研究的本質(zhì)是準(zhǔn)確鑒定高?；颊?，以確保同類(lèi)的患者組8。相反地，具有復(fù)發(fā)低危險(xiǎn)的患者的改善鑒定將減少這樣的患者的數(shù)目，由于通過(guò)PSA篩選鑒定的增加數(shù)目的無(wú)痛癌癥，所述患者暴露于治療的發(fā)病率。最后，用于局限性前列腺癌的改良預(yù)后模型的開(kāi)發(fā)具有利于更佳治療決定的潛力，或者放棄無(wú)痛疾病的治療，或者為具有復(fù)發(fā)高危險(xiǎn)的男性提供輔助化學(xué)療法。本公開(kāi)內(nèi)容中的所有參考文獻(xiàn)由于其所有相關(guān)教導(dǎo)在此以引用方式并入本文。參考文獻(xiàn):I. Ries LAG, Melbert D, Krapcho M等人SEER Cancer Statistics Review (SEER癌癥統(tǒng)計(jì)評(píng)述)，1975-2005。馬里蘭州的貝塞斯達(dá)國(guó)家癌癥研究所(Bethesda，MD :National Cancer Institute)，張貼至 SEER 網(wǎng)站，20082. Jemal A, Siegel R, Ward E 等人Cancer statistics (癌癥統(tǒng)計(jì))，2008。CACancer J Clin (臨床醫(yī)師癌癥雜志)2008 ;58 :71。3. Cooperberg MR, Moul Jff 和 Carrol PR The changing face of prostatecancer (前列腺癌的改頭換面)。J Clin Oncol (臨床腫瘤學(xué)雜志)2005 ;23 :8146。4. Wilt TJ SPCG-4 a needed START to PIVOTal data to promote and ProtecTevidence-based prostate cancer care (需要 START 至 PIVOTal 數(shù)據(jù)以促進(jìn)且保護(hù)基于證據(jù)的前列腺癌護(hù)理)。J Natl Cancer Inst (國(guó)立癌癥研究所雜志)2008 ;100 :1123。5. Scardino PT Localized prostate cancer is rarely a fatal disease (局限性前列腺癌很少是不治之癥)。Nat Clin Pract Urol (自然臨床診療泌尿?qū)W)2008 ;5 :1。
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訓(xùn)練同類(lèi)者測(cè)試同類(lèi)者
特征(患者數(shù)目=J38 )(患者數(shù)目=) P值 年齡，歲數(shù)
<605856 .50f
>6080102 格里森評(píng)分<65775 .17*
76472
8-101710
未知OI臨床分期
Tl5667 75*
權(quán)利要求
1.一種用于區(qū)分在前列腺癌的高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者和在前列腺癌的低復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別中的受試者的分類(lèi)器，所述分類(lèi)器包括 至少兩種診斷標(biāo)記的各自表達(dá)水平，每種表達(dá)水平相對(duì)于兩種或更多種對(duì)照標(biāo)記的平均水平進(jìn)行測(cè)量；和 基于Kattan列線圖的預(yù)測(cè)概率，其與所述至少兩種診斷標(biāo)記的表達(dá)水平組合，以將受試者指定至前列腺癌的高復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別和前列腺癌的低復(fù)發(fā)危險(xiǎn)類(lèi)別之一。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分類(lèi)器，其中所述Kattan列線圖是基于下組中的兩個(gè)或更多個(gè)成員的復(fù)合測(cè)量術(shù)前(和激素療法前，如果接受過(guò)該療法的話)PSA值、前列腺切除術(shù)時(shí)的PSA、手術(shù)時(shí)的主要格里森、手術(shù)時(shí)的次要格里森、前列腺切除術(shù)格里森總和、前列腺切除術(shù)年份、無(wú)疾病月數(shù)、手術(shù)切緣是否是陽(yáng)性的、癌癥是否在精囊中發(fā)現(xiàn)、是否存在包膜外延伸、癌癥是否在淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)(若有被取出)、放射治療前PSA、福射劑量(如果適用)、手術(shù)切緣是陽(yáng)性還是陰性的(如果適用)、是否存在精囊牽涉(如果適用)、是否存在淋巴結(jié)牽涉(如果適用)、是否存在包膜外牽涉(如果適用)、是否開(kāi)出新輔助激素處方、是否開(kāi)出新輔助放射處方。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分類(lèi)器，其中所述Kattan列線圖是基于下組中的兩個(gè)或更多個(gè)成員的復(fù)合測(cè)量治療前PSA水平、組合的格里森級(jí)別、樣品格里森總和、臨床分期、手術(shù)切緣狀態(tài)、在活組織檢查核心中癌癥的核心總長(zhǎng)度中的前列腺包膜侵襲最大癌癥長(zhǎng)度、核心陽(yáng)性水平百分比、前列腺外延伸、前列腺外延伸水平、細(xì)胞凋亡指數(shù)、一個(gè)或多個(gè)核心中的癌癥百分比、一個(gè)或多個(gè)核心中的高級(jí)別癌癥百分比、總腫瘤體積、癌癥的定位區(qū)、精囊侵襲的存在情況、精囊侵襲的類(lèi)型、p53、Ki-67、p27、DNA倍性狀態(tài)、淋巴結(jié)狀態(tài)和淋巴管侵襲。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分類(lèi)器，其包括診斷標(biāo)記MYHlI、SSBPl和DPT。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分類(lèi)器，其除MYH11、SSBP1和DPT外還包括選自表2的除組蛋白I H3d外的診斷標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分類(lèi)器，其中所述對(duì)照標(biāo)記是TUBA、ALASl和ACTG1。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分類(lèi)器，其中所述診斷標(biāo)記選自表2中呈現(xiàn)的除組蛋白IH3d外的標(biāo)記集合。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分類(lèi)器，其中對(duì)照標(biāo)記針對(duì)如通過(guò)RT-PCR檢測(cè)的相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平而選擇。
9.一種預(yù)測(cè)前列腺癌復(fù)發(fā)的方法，其包括測(cè)定相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的DPT表達(dá)水平；測(cè)定來(lái)自表2的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平；和將所述DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)于前列腺癌的復(fù)發(fā)概率的評(píng)分。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，作為轉(zhuǎn)化步驟的備選，其進(jìn)一步包括將所述DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平與前列腺癌復(fù)發(fā)的至少一種另外指示物組合的步驟，以測(cè)定復(fù)合評(píng)分。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述復(fù)合評(píng)分反映前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中在選自前列腺切除術(shù)、激素療法、單試劑化學(xué)療法、雙試劑化學(xué)療法和用法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的治療中的至少一種治療前，測(cè)定所述DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平。
13.一種用于檢測(cè)至少DPT的表達(dá)水平的試劑盒，所述試劑盒包括試劑以及第一探針組，其包括特異性識(shí)別DPT的第一探針和特異性識(shí)別選自表2的除組蛋白I H3d外的第二標(biāo)記的第二探針。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其還包括裝置，所述裝置用于將所述DPT的表達(dá)水平和來(lái)自表2的除組蛋白I H3d外的至少一種另外標(biāo)記的表達(dá)水平轉(zhuǎn)換成前列腺癌復(fù)發(fā)可能性的指示物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的試劑盒，其中所述裝置是列線圖。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述列線圖作為下組中的一個(gè)或多個(gè)成員實(shí)現(xiàn)機(jī)械裝置、圖示和軟件指令，以實(shí)現(xiàn)用于提供前列腺癌復(fù)發(fā)可能性指示物的表示的用戶界面。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了使用優(yōu)選的三基因分類(lèi)器的表達(dá)水平用于測(cè)定前列腺癌復(fù)發(fā)的可能性的方法、裝置和試劑盒。所述方法、裝置和試劑盒可以不依賴(lài)于目前在使用中的許多列線圖而使用，或用于改善此類(lèi)列線圖的總體表現(xiàn)。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102939534SQ201180017903
公開(kāi)日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者D.塔蘭托夫, T.杰特克, Y.張, Y.王, J.F.帕爾馬 申請(qǐng)人:維里德克斯有限責(zé)任公司