專利名稱：測定小體積體液樣品中的標(biāo)志物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定小體積體液樣品中的標(biāo)志物的方法。
背景技術(shù)：
這類方法用于快速測定小體積體液樣品中一種或多種標(biāo)志物的存在。已知方法和裝置公開于例如下列文獻(xiàn)中W0 2004/033101A1, WO 2007/000048A1以及WO2009/14360A1。WO 2007/000048A1描述了一種用于檢測小流體樣品中一種或多種標(biāo)志物的含有3種以上多孔膜的護(hù)理現(xiàn)場(point-of-care)裝置，用于從全血中識別標(biāo)志物。所描述的陣列包括第一步驟膜，其能夠截留紅細(xì)胞并含有檢測劑；第二步驟膜，其所具有的孔隙度與第一步驟相比進(jìn)一步截留紅細(xì)胞，且樣品溶血極少；以及第三步驟膜，其孔隙度低于第二步驟且含有捕獲探針。文獻(xiàn)US 2005/0244986A1公開了一種分析檢測裝置，其可用于例如妊娠測定中。 操作時，液體樣品施加于檢測裝置的下端。該檢測裝置設(shè)有功能區(qū)。環(huán)形區(qū)可作為對照，無論所施加檢測的液體樣品是否含有待測分析物，均可給出例如有色的信號。對分析物的測定在另一個環(huán)形區(qū)中進(jìn)行。使用者通過比較兩個區(qū)中產(chǎn)生的信號來確定分析物是否存在于所施加的液體樣品中。文獻(xiàn)WO 2007/149043A1公開了一種在液體樣品上進(jìn)行測定的測定裝置，其使用能夠與抗原結(jié)合且含有標(biāo)記的檢測結(jié)合物。文獻(xiàn)US 2009/0253119A1涉及一種包含檢測條的測流測定法和系統(tǒng)，用于檢測并定量在樣品、諸如含有細(xì)胞和流體的樣品中的分析物檢測。文獻(xiàn)EPl 975 619 Al提供了一種色譜檢測裝置，其包含從樣品展開方向的上游側(cè)起依次布置的第一血細(xì)胞分離部件、第二血細(xì)胞分離部件和色譜載體。發(fā)明概述本發(fā)明的目標(biāo)在于提供一種測定小體積體液樣品中的標(biāo)志物的改進(jìn)方法，其中避開了用于測定標(biāo)志物的流動檢測元件的不正確使用。這個目標(biāo)通過權(quán)利要求I的一種測定小體積體液樣品中的標(biāo)志物的方法解決。另夕卜，還提供了一種用于測定權(quán)利要求I的流動檢測元件的正確檢測性能的方法。本發(fā)明的有利發(fā)展在從屬權(quán)利要求中公開。在光學(xué)檢測測定過程中，可以測量選自下列光譜參數(shù)的一種或多種光譜參數(shù)吸收，熒光，反射，發(fā)射和透射。流動檢測元件上的一個或多個功能區(qū)可以設(shè)有兩個以上的功能亞區(qū)。例如，流動檢測元件上可以設(shè)置多個檢測亞區(qū)。通過測定正確的檢測性能，例如，可以避免將液體樣品施加于檢測元件未配置好的流動檢測元件上?？梢葬槍w液和/或體液的組分配置流動檢測元件。在此使用時，“組分”必需與后來可以加入到體液中的物質(zhì)區(qū)別開來。所添加的物質(zhì)也可以指混合物或者混合的物質(zhì)。在體液的情況下，舉例來說，這樣的物質(zhì)可以在從患者中采體液后加入到該體液中，例如可以加入抗體。相反，在此限定的組分是體液本身的一部分。全血樣品的組分例子有血清和血漿。例如，如果將液體樣品施加于未配置流動檢測元件的流動檢測元件上將會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。所提出的方法確保了正確執(zhí)行液體樣品中標(biāo)志物的測定。這是因為其中有一個測定正確的檢測性能的步驟，其讓使用者知道是否提供了正確的檢測性能，即，是否將正確的液體施加于流動檢測元件。優(yōu)選，通過讀取檢測區(qū)來測定液體樣品中的標(biāo)志物是通過使用一種或多種檢測波長的光學(xué)檢測來完成的。在優(yōu)選實施方案中，測定正確的檢測性能的步驟是通過使用不同于檢測波長的一種或多種波長進(jìn)行光學(xué)測定來執(zhí)行的。例如，可選擇不同于檢測波長的熒光和/或吸收波長。“流體連通的”在此使用時指的是流體、例如樣品可以基本上無阻礙地通過本發(fā)明裝置的一個區(qū)室或部分。所述特點優(yōu)選與液體樣品的實際存在與否無關(guān)。測定正確的檢測性能的步驟，特別是為了正確的樣品使用時，可以在液體樣品施 加于流動檢測元件和測定標(biāo)志物之間的時間期間的第一次測定之后，再重復(fù)進(jìn)行一次或幾次。即使在標(biāo)志物測定以后，也可以對正確的檢測性能進(jìn)行檢測，優(yōu)選將其作為檢測測定的一個附加步驟。為測定一個或多個功能區(qū)或其中的正確檢測性能、特別是正確的樣品使用起見，可以執(zhí)行所述步驟。在所施加的液體的一部分到達(dá)一個功能區(qū)后，可以在這一個功能區(qū)執(zhí)行測定正確的檢測性能的步驟。在這種情況下，對這一個功能區(qū)所測量的至少一種的光學(xué)參數(shù)與指定給這一個功能區(qū)的一種或多種預(yù)定的光學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。通常，“對一個功能區(qū)測量”在此使用時指的是測量所述參數(shù)是為了表征這一個功能區(qū)。光學(xué)測量可以在這一個功能區(qū)以內(nèi)的區(qū)域和/或位于這一個功能區(qū)以外的區(qū)域進(jìn)行。為測定一種或多種標(biāo)志物，可以配置一個檢測區(qū)或者多個檢測亞區(qū)?？梢杂盟龇椒y定的標(biāo)志物的例子在下文描述。降鈣素原(PCT)已成為敗血癥診斷的已確定的生物標(biāo)志物PCT反映細(xì)菌感染的嚴(yán)重程度并特別應(yīng)用于監(jiān)測感染發(fā)展成敗血癥、嚴(yán)重敗血癥或敗血性休克的進(jìn)程。PCT可用于測量全身炎性反應(yīng)的活性，控制治療成功并評估預(yù)后(Assicot M等Lancet1993，341:515-8;Clec’h C等降鈣素原在敗血性休克患者中的診斷和預(yù)后價值。CritCare Med 2004;32:I166-9;Lee YJ et al，Yonesei Med J 2004，45，29-37;Meisner MCur Opin Crit Care 2005, 11, 473-480;Wunder C 等 Infamm Res 2004，53，158-163)。敗血癥患者中PCT水平的升高和死亡率相關(guān)(Oberhoffer M等Clin Chem Lab Med1999;37:363-368)。腎上腺髓質(zhì)素(ADM)這種肽作為一種從人嗜鉻細(xì)胞瘤中分離出的含有52個氨基酸的新型降壓肽，在1993年被首次描述(Kitamura等(1993)，Biochem. Biophys. Res.Commun. 192:553-560)。同年，編碼含有185個氨基酸的前體肽的cDNA以及該前體肽的完整氨基酸序列也被公布(Kitamura 等(1993)，Biochem. Biophys. Res. Commun. 194:720-725)。該前體肽被引為“腎上腺髓質(zhì)素原前體”(pre-piO-ADM)，其特別是在N端含有一段21個氨基酸的信號序列。ADM肽含有pre-peo-ADM的95-146位氨基酸，通過對pre_peo_ADM的蛋白水解切割而形成。在切割pre-peo-ADM中形成的一些肽段已被具體表征，特別是具有生理活性的肽腎上腺髓質(zhì)素(ADM)和“PAMP”，后者是含有ρι -ρι -ADM中21個氨基酸的信號肽之后的20個氨基酸(22-41)的肽。另一個具有未知功能和很高的離體(exvivo)穩(wěn)定性的片段是腎上腺髓質(zhì)素原中區(qū)(MR-proADM) (Struck等(2004)，Peptides25 (8) : 1369-72),對它已開發(fā)了一種可靠的定量方法(Morgenthaler等(2005), Clin.Chem. 51(10) : 1823-9)。ADM是一種有效的血管舒張劑。其降壓效果尤其與ADM C端部分中的肽段相關(guān)。另一方面，ADM的N端肽序列表現(xiàn)出增壓效果(Kitamura等(2001)，Peptides22， 1713-1718)。內(nèi)皮素(ET) -I是一種來源于內(nèi)皮的內(nèi)源性強(qiáng)力血管收縮劑(YanagisawaM, Kurihara H, Kimura S，Gogo K, Masaki T, J Hypertens Suppl 1988; 6: S188-91 hET-Ι 通過激活平滑肌細(xì)胞上的ET(A)和ET(B)受體、引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加來發(fā)揮它的血管作用(Yanagisaw 等，JHypertens Suppl 1988;6:S 188-91)。成熟的內(nèi)皮素-I 來源于更大的稱為內(nèi)皮素原-I的前體。內(nèi)皮素原-I可以按照描述(Struck J, Morgenthaler NG, BergmannPeptides. 2005Dec ;26(12) : 2482_6)，經(jīng)蛋白水解加工成各種片段。這些片段在血液循環(huán)中 經(jīng)歷蛋白水解性降解，這種降解或快或慢地發(fā)生，其取決于片段類型以及循環(huán)中存在的蛋白酶的種類和濃度/活性。這些片段的一個例子是C端內(nèi)皮素原-l(CT-pix)ET-l)，其可用夾心免疫分析法測量(Papassotiriou J, Morgenthaler NG, Struck J, Alonso C, BergmannA.Clin Chem. 2006Jun;52(6):1144-51)。B型利鈉尿肽(BNP)是心力衰竭的定量標(biāo)志物。B型利鈉尿肽(BNP)及其氨基端片段、N端B型利鈉肽原(ΝΤ-ρι·οΒΝΡ)的使用顯著提高了 ED診斷的準(zhǔn)確率[Januzzi，J.L. , Jr.,等，Am J Cardiiol, 2005. 95(8) :P. 948-54 ;Maisel, A. S.,等，N Engl JMed, 2002. 347(3) :p. 161-7]，從而改善了對患者的評估和治療[Moe, G. W.,等，Circulatioη, 2007. 115(24) :ρ. 3103-10; 8. Mueller, C.,等，N Engl J Med, 2004. 350 (7) :p. 647-54] 循環(huán)中心房利鈉尿肽(ANP)的濃度比BNP高出約50-100倍[Pandey, K. N.，Peptides, 2005. 26(6) :p. 901-32]。所以，ANP提高反映出的生物學(xué)信號可以是病理生理學(xué)方面的，因此在診斷方面比BNP的信號更為重要。盡管如此，人們對ANP及其前體的診斷性能知之甚少[Cowie,M. R.,等，Lancet, 1997. 350 (9088) :ρ· 1349-53]。成熟的 ANP 來源于其前體N端-proANP，該前體在循環(huán)中比成熟的肽更穩(wěn)定，所以被認(rèn)為是更可靠的分析物[Vesely, D. L. , IUBMB Life, 2002. 53 (3) :ρ· 153-Pandey, Κ. N. , Peptides, 2005. 26 (6) :ρ· 901-32]。作為利鈉尿肽家族中的一員，心房利鈉尿肽(ANP)可調(diào)節(jié)幾項生理參數(shù)，包括利尿和尿鈉排泄以及降低動脈血壓(ΒΡ)。其主要在心臟的心房中產(chǎn)生，且占循環(huán)中利鈉尿肽的98%(Vesely DL. Life 2002;53:153-159)。ANP來源于對其前體激素原的切割，該前體在循環(huán)中比成熟的肽更穩(wěn)定。不同于現(xiàn)有免疫測定法使用的proANP的N端或C端中的表位，稱為中區(qū)-proANP (MR-proANP)的該前體激素的中區(qū)片段(NT-proANP的53-90位氨基酸)相對更能抵抗外蛋白酶的降解(Morgenthaler NG 等 Clin Chem 2004; 50:234-236; GersztenRE 等 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008)。肌紅蛋白是一種153個氨基酸的單鏈球蛋白，中心含有一個血紅素(含鐵卟啉)輔基，剩余的脫輔基蛋白質(zhì)圍繞中心折疊。肌紅蛋白是肌肉損傷的敏感標(biāo)志物，使其作為胸疼患者心臟病發(fā)作的潛在標(biāo)志物(M. Weber, M. Rau, K. Madlener, A. Elsaesser, D. Bankovic, V.Mitrovic 和 C. Hamm(2005)Clinical Biochemistry 38:1027)。CK-MB 和心臟肌I丐蛋白 T、即cTnT與ECG和臨床征象聯(lián)合使用，以診斷急性心肌梗塞(AMI)。心臟肌鈣蛋白是一種由T (cTcT)、I (cTcI)和C三種亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中T和I僅存在于心肌組織中并被用作用于診斷意圖的標(biāo)志物(Rottbauer W等，Eur Heart J 1996;17:3-8)。精氨酸加壓素(AVP)，也稱作加壓素、精氨加壓素或抗利尿激素(ADH)，是一種見于大多數(shù)哺乳動物包括人類的激素(Caldwell HK, Young WS 111(2006). In Lajtha A, LimR. Handbook of Neurochemistry and Molecular Neurobiology:Neuro-active Proteinsand Peptides (3rd edition ed.)(神經(jīng)化學(xué)和分子神經(jīng)生物性手冊神經(jīng)活性的蛋白和肽(第三版))· Berlin:Springer. Pp. 573-607. ISBN 0-387-30348-0)。加壓素是一種肽類激素。其來源于合成于下丘腦并儲存于垂體后葉囊泡中的前激素原前體。加壓素釋放的減少或腎臟對加壓素敏感度的降低均會導(dǎo)致尿崩癥，一種以高鈉血(血鈉濃度增高)、多尿(過量尿液產(chǎn)生)以及煩渴(口渴)為特征的病癥。
在此使用時，術(shù)語諸如“測定標(biāo)志物”等包括檢測樣品中標(biāo)志物的存在或不存在和/或定量標(biāo)志物的量和/或濃度。因此，需要根據(jù)標(biāo)志物的可檢測性存在、即測定法的檢測限來理解存在或不存在?！皹?biāo)志物”是指示生理或病理狀況的物質(zhì)。它們包括，例如，作為由于心臟組織的惡化從心肌細(xì)胞釋放到血液循環(huán)中的蛋白的心臟分析物、指示妊娠的激素、用于監(jiān)測糖尿病狀況的血糖、以及由于感染產(chǎn)生的多種蛋白質(zhì)或毒素。在有的實施方案中，標(biāo)志物是準(zhǔn)備用本發(fā)明的測定法、裝置、方法和應(yīng)用來檢測和/或定量的蛋白質(zhì)或肽。這包括長度為所述蛋白質(zhì)或肽的至少12個氨基酸、優(yōu)選至少15個氨基酸的片段。本發(fā)明的這類蛋白質(zhì)或肽的具體例子是與心血管事件的診斷和/或預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物，例如肌紅蛋白，肌鈣蛋白T (cTnT)和I (cTnl)，肌酐激酶MB (CK-MB)，F(xiàn)ABP，⑶F-15，ST-2，降鈣素原(PCT)，C-反應(yīng)蛋白(CRP)，腎上腺髓質(zhì)素原及其片段包括中區(qū)腎上腺髓質(zhì)素原(MR-proADM)、腎上腺髓質(zhì)素、PAMP> C端腎上腺髓質(zhì)素原(CT-proADM),內(nèi)皮素原_1及其片段包括C端內(nèi)皮素原-I (CT-proET-1)、大-內(nèi)皮素-1、內(nèi)皮素_1、NT_內(nèi)皮素原-1，proANP及其片段包括中區(qū)心房利鈉尿肽原(MR-proANP)、N端proANP (NT-proANP)、ANP，加壓素原及其片段包括C端精氨酸加壓素原肽(CT-pix)AVP，“和肽素”)、加壓素、后葉激素運(yùn)載蛋白II，proBNP及其片段包括BNP和N端proBNP (NT-proBNP)。應(yīng)該理解，在此所描述的標(biāo)志物蛋白質(zhì)和/或肽，包涵所述標(biāo)志物蛋白質(zhì)和/或肽的至少12個氨基酸的片段，優(yōu)選包涵至少15個氨基酸長度作為標(biāo)志物。此外，分別與妊娠或排卵相關(guān)的激素如人絨毛膜促性腺激素(hCG)和促黃體激素(LH)的激素也可以用本發(fā)明或其各種實施方案來檢測。其他針對疾病如癌癥的抗原，特別是前列腺癌抗原(前列腺血清抗原，PSA)，也可以用本發(fā)明來檢測，這也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的其他應(yīng)用包括與下列感染相關(guān)的標(biāo)志物的識別病毒感染，如肝炎；細(xì)菌和真菌感染，包括腸胃潰瘍的幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori);其他由炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、體風(fēng)(Pediculus humanis)、跳蚤(siphonatera)和革蘭氏陽性細(xì)菌如化胺性鏈球菌(Streptococcus pyognes)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneunoniae)和糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)所引起的感染,這些都是非限制性例子。本發(fā)明也可用于檢測藥物，包括濫用藥物。本發(fā)明也考慮到了諸如測定血液中葡萄糖含量的酶法測定。需要認(rèn)識的是，本裝置的使用不局限于這些具體的標(biāo)志物或，實際上，不局限于全血，而是同樣適用于其他分析程序，例如以上所述的例子。在優(yōu)選實施方案中，測定正確的檢測性能的步驟包含如下步驟，通過光學(xué)測定所施加的液體樣品是體液還是體液組分，針對測定體液或者體液組分中的標(biāo)志物來配置流動檢測元件，以此來確定正確的樣品使用。根據(jù)優(yōu)選實施方案，本方法還包含下列步驟施加小體積全血樣品，并且光學(xué)測定該全血樣品為未溶血還是溶血的血液。在優(yōu)選實施方案中，光學(xué)檢測定包含測量照射到流動檢測元件上受關(guān)注區(qū)域中的光的發(fā)射信號的步驟。所測得的發(fā)射信號可以和參考信號作比較，用于確定檢測的是未溶血還是溶血的血液。在此使用時，“全血樣品”特指未處理或基本未處理的血液樣品。在另一個優(yōu)選實施方案中，測量步驟包含光學(xué)測量流體連通到且處于檢測區(qū)和對照區(qū)之間的區(qū)域的步驟。因為這種情況下該研究區(qū)域處于檢測區(qū)的下游，所以光學(xué)測量提供了關(guān)于先進(jìn)入檢測區(qū)的那部分液體樣品的信息。 在優(yōu)選實施方案中，提供流動檢測元件的步驟包括下述步驟提供流動檢測元件，所述流動檢測元件具有位于施加區(qū)和檢測區(qū)之間且和這兩個區(qū)流體連通的橋接區(qū)，以及位于檢測區(qū)上游且和其流體連通的對照區(qū)。橋接區(qū)可以通過與施加區(qū)及檢測區(qū)流體連通的橋膜提供。所述橋膜的平均孔徑為8. 0±2 μ m，對血清或血漿的毛細(xì)流動2cm距離小于30秒和/或4cm距離小于180秒，其中血清或血漿在橋膜中的毛細(xì)流動小于第一種多孔材料但高于檢測區(qū)。另外，檢測區(qū)和對照區(qū)可以由一種或多種膜構(gòu)成。優(yōu)選地，該膜由多孔材料制成。根據(jù)一個進(jìn)一步的實施方案，測定正確的檢測性能的步驟包含光學(xué)測量選自下列的至少一種功能區(qū)的步驟施加區(qū)，橋接區(qū)，檢測區(qū)和對照區(qū)。在一個進(jìn)一步的實施方案中，測定正確的檢測性能的步驟包含光學(xué)測量位于多個功能區(qū)之外的流動檢測元件區(qū)域的步驟。所述測量可以作為在一個功能區(qū)內(nèi)的測量的替代或者補(bǔ)充。例如，可以對位于兩個功能區(qū)之間的流動檢測元件區(qū)域進(jìn)行光學(xué)測量。對于一個功能區(qū)中的正確液體的光學(xué)測量，可以對位于所關(guān)注的功能區(qū)上游和/或下游的區(qū)域來執(zhí)行。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法進(jìn)一步包含下述步驟施加小體積全血樣品，光學(xué)測定紅細(xì)胞滲漏到流動檢測元件上的關(guān)注區(qū)域。如果，例如，需要測定全血樣品中的標(biāo)志物，則通常需要避免紅細(xì)胞自己滲漏到檢測區(qū)。通過上述實施方案，可以檢查出這類滲漏是否發(fā)生。如果測定正確檢測性能的步驟顯示發(fā)生了這類滲漏，這就告知了使用者在那些條件下收集的測量結(jié)果可能并不準(zhǔn)確。根據(jù)一個進(jìn)一步的實施方案，測定正確檢測性能的步驟包含在不同時間進(jìn)行多次光學(xué)測量的步驟。多次光學(xué)測量可以在流動檢測元件受關(guān)注的同一區(qū)域或者不同區(qū)域進(jìn)行。在另一個實施方案中，測定標(biāo)志物的步驟包含至少一個下列的步驟測定液體樣品中標(biāo)志物的存在，以及測定液體樣品中的標(biāo)志物的濃度。在又一個實施方案中，測定正確的檢測性能的步驟包含光學(xué)測定所施加的液體樣品是體液還是體液組分的步驟，所述體液或體液組分選自全血樣品，血清樣品，血漿樣品，尿液樣品，腦脊液樣品，糞便樣品，唾液樣品和淋巴樣品。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種測定流動檢測元件的正確檢測性能的方法，所述方法包含以下步驟-提供一種具有多個功能區(qū)的流動檢測元件，所述多個功能區(qū)至少部分流體連通并且含有施加區(qū)和檢測區(qū)，所述檢測區(qū)與施加區(qū)流體連通并被配置用于測定體液和/或體液組分中的標(biāo)志物檢測，-將小體積液體樣品施加于流動檢測元件的樣品施加區(qū)，-測定正確的檢測性能，其中測定正確的檢測性能的步驟包含下列步驟測量功能區(qū)的至少一種光學(xué)參數(shù)，和將所測量的所述至少一種光學(xué)參數(shù)與指定給這一個或多個功能區(qū)的至少一種預(yù)定的光學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。
如果在測定正確的檢測性能的步驟中檢測出不正確的檢測性能，這可能表明分析系統(tǒng)阻礙進(jìn)一步的分析。例如，分析系統(tǒng)可能被阻塞以致不能進(jìn)一步使用要施加液體樣品的流動檢測元件。在一個優(yōu)選實施方案中，分析系統(tǒng)的使用者會獲得警告信號。警告信號可包含聲音信號和視頻信號至少其一。


接下來將參考不同的實施方案為例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋。在附圖中，圖I顯示了流動檢測元件的俯視示意2顯示了光學(xué)發(fā)射信號(相對單位)取決于沿著流動檢測元件I提供不同培養(yǎng)時間的全血樣品的的相對位置(相對單位)。發(fā)明的優(yōu)選實施方案的描述對以下實例的描述僅為闡明而不是希望限制本發(fā)明的范圍。形式的變化以及等同取代被視為根據(jù)情況可能提示或提供的變通手段。盡管在此使用了特定的術(shù)語，但此類術(shù)語只為描述性的意義，而不是為了限制。圖I顯示了流動檢測元件的俯視示意圖。流動檢測元件也可稱為護(hù)理現(xiàn)場裝置，其包含容納了膜主體2的裝置主體1，膜主體I上設(shè)置了多個功能區(qū)。所述功能區(qū)流體連通，包含以下區(qū)施加區(qū)3，橋接區(qū)4，檢測區(qū)5以及對照區(qū)6?！白o(hù)理現(xiàn)場”(point of care，P0C)檢測被定義為在靠近患者護(hù)理位置處或附近進(jìn)行的任何診斷檢測(，在 Kost GJ 編著，Principles and practice of point-of-caretesting(《護(hù)理現(xiàn)場檢測的原理與實踐》中，Kost的Goals, guidelines and principles forpoint-of-care testing(護(hù)理現(xiàn)場檢測的目標(biāo)、指導(dǎo)和原理))· Phiuladelphia:LippincottWilliams and Wilkins. 2002, Chapter I, pp 3-12)。通過將分析移到更接近患者，消除了部分中間步驟，有利于更短時間獲得結(jié)果以及更快管理反應(yīng)，從而改善后果不。POC檢測的優(yōu)點有更快的改變時間(turn-around-time, TAT),更快的醫(yī)療決定,避免長時間樣品運(yùn)輸以及只需小樣本體積(Heinschink 等，Pint-of-care testing. Laboratoriums Medizin2002. 26(1-2) :61-67)。施加區(qū)3被配置為接收小體積體液，該體液然后至少部分在膜主體中分別流到檢測區(qū)5和對照區(qū)6。在此使用時，“樣品施加區(qū)”特指施加樣品的裝置部分，舉例，所述施加可以通過將樣品施加區(qū)浸入到樣品里，或者通過用樣品轉(zhuǎn)移工具例如注射器或移液管來施加樣品。所以樣品施加區(qū)是裝置中的開口，其可以為例如袋或凹口的形式，通過它可以將樣品施加到第一種多空材料上。流動沿著在施加區(qū)3和對照區(qū)5之間形成的樣品流道發(fā)生。膜主體2可以設(shè)有一種或多種膜元件，在一個實施方案中所述膜元件提供在一疊膜中。由多空膜材料提供的流道具有允許毛細(xì)流動的尺寸。在一個實施方案中，檢測區(qū)4被配置用于測定全血樣品中標(biāo)志物的存在。流動檢測元件可以按如下使用。很明顯，當(dāng)與提供在施加區(qū)3內(nèi)和/或相鄰的第一種多空材料接觸時，所施加的樣品的紅細(xì)胞將開始和血漿分離，在其流動過程中，標(biāo)志物將與檢測劑相遇，所述檢測劑通常為但不限于針對標(biāo)志物表位的標(biāo)記抗體，從而形成標(biāo)志物-檢測劑復(fù)合物。在所描述的實施方案中，標(biāo)志物-檢測劑復(fù)合物隨后移動到由橋接膜提供的橋接區(qū)4，在這兒，紅細(xì)胞的遷移進(jìn)一步受阻/延遲。標(biāo)志物-檢測劑復(fù)合物隨后朝著由檢測膜提供的檢測區(qū)5移動并 遇上固定化的捕獲探針，所述探針通常為但不限于針對標(biāo)志物另一表位或檢測劑表位的抗體。標(biāo)志物-檢測劑復(fù)合物與固定化的捕獲探針的反應(yīng)形成可以用肉眼或合適儀器看到的集中的捕獲斑。在檢測區(qū)5中捕獲斑下游的任選對照區(qū)6將含有對照試劑。在優(yōu)選實施方案中，對照試劑可以為抗-動物IgG?；蛘撸鎸φ諈^(qū)6，檢測裝置的膜上的透明封條的長度變化可以使得樣品在到達(dá)檢測膜末端時以可控的方式蒸發(fā)，從而產(chǎn)生容易測出的信號。本發(fā)明的范圍還包括一次檢測流體樣品中的一種標(biāo)志物或甚至多種標(biāo)志物。相應(yīng)的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠領(lǐng)會可以在本發(fā)明的護(hù)理現(xiàn)場裝置上沉積一種或多種檢測劑和/或一種或多種捕獲探針。原則上，該測定法，亦即用于檢測標(biāo)志物的檢測劑和捕獲探針的組合可以基于應(yīng)用于診斷領(lǐng)域的任何類型。所述測定法可以為非競爭性測定法，即夾心測定法，或競爭性測定法(The Immunoassay Handbook (免疫測定手冊)，David Wild 編著，ElsevierLTD, Oxford;第三版· (2005年5月)，ISBN-13:978-0080445267;Hultschig C等，Curr OpinChem Biol. 2006Feb;10(I):4-10. PMID:16376134)。在此使用時，捕獲探針可以選自核酸分子，碳水化合物分子，PNA分子，適配體，蛋白質(zhì)，抗體，肽或糖蛋白，優(yōu)選抗體。在檢測裝置中技術(shù)人員可用的捕獲探針的任何標(biāo)記種類及相應(yīng)的檢測系統(tǒng)均可使用。已知的標(biāo)記包括但不局限于金屬、熒光、電化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo)記。金屬標(biāo)記由于其顯著的敏感性而特別優(yōu)選。在金屬里，最優(yōu)選金，主要由于其在這類反應(yīng)中的廣泛應(yīng)用且特點為人熟知。在有的實施方案中，第一種多孔材料含有可以和全血樣品中待測標(biāo)志物結(jié)合的抗體-金粒-結(jié)合物。在此需要理解，抗體-金粒-結(jié)合物原樣置于第一種多孔材料中，當(dāng)并且抗體-金粒-結(jié)合物與樣品接觸時會懸浮在樣品中并和樣品一塊傳送。所以，很明顯，抗體-金粒-結(jié)合物可以不是不可逆地固定于第一種多孔材料上。但是，在有的實施方案中，可以采用將抗體-金粒-結(jié)合物固定于第一種多孔材料上，其在與樣品接觸后可逆，例如其容易水解。所用金標(biāo)抗體的優(yōu)選粒度為大約20_65nm，但根據(jù)廣為了解的因素，例如標(biāo)志物的臨床截止點以及反應(yīng)物的親和力，可以接受可觀的變化。另外，通過使用可還原的銀鹽將其沉積為可見的產(chǎn)物，可以增強(qiáng)金信號使其容易察覺到。典型的反應(yīng)性鹽是乳酸銀，其作為可還原的銀離子源，使用氫醌作為還原劑。金屬銀圍繞每個金粒子形成容易分辨的黑色沉積物?；蛘?，如果使用了例如辣根過氧化物酶的酶標(biāo)，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序通過添加過氧化氫以及染料如CIS鄰苯二胺來檢測反應(yīng)?？梢栽诒景l(fā)明范圍內(nèi)很好使用的其他標(biāo)記是美國專利6046585中描述的順磁標(biāo)記(所述專利在此以其全文引為參考)，其能夠使得標(biāo)志物檢測的靈敏度更高。在本申請的情景中，“檢測劑”是一種材料，經(jīng)常是液體樣品中要檢測的標(biāo)志物的抗體。在有的實施方案中，其被可釋放地結(jié)合在液體樣品的施加點處或其下游的第一種多孔材料載體上。對大多數(shù)免疫化學(xué)分析而言，用可檢測的標(biāo)記如膠體金進(jìn)行標(biāo)記，并且與待測標(biāo)志物形成復(fù)合物。在橋接膜的血清進(jìn)行毛細(xì)流動的情景中，術(shù)語“水平變化”特指血清流向中的流速變化。
在此使用時，“從血細(xì)胞中分離血清”指的是截留血細(xì)胞，特別是紅細(xì)胞，而血清前進(jìn)到達(dá)裝置的相鄰區(qū)室或部分，例如下一個膜。因此，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少99%，更加優(yōu)選至少99. 5%，最優(yōu)選大約100%的紅細(xì)胞被截留。通過參考上述非限制性實施方案描述的用于測定體液中標(biāo)志物存在的方法包括測定正確的樣品使用的步驟。該步驟通過光譜測量完成。檢測并分析選自吸收、熒光、透射、反射和發(fā)射的一種或多種光譜參數(shù)來測定施加到流動檢測元件的施加區(qū)3并到達(dá)功能區(qū)之一的部分液體樣品是否是所配置的流動檢測元件的一種目標(biāo)體液，還是體液的一種組分。優(yōu)選地，對區(qū)域6進(jìn)行光學(xué)研究來測定正確的樣品使用。例如，可以對位于檢測區(qū)5和對照區(qū)6之間的區(qū)域7進(jìn)行光學(xué)研究來測定到達(dá)檢測區(qū)5和/或?qū)φ諈^(qū)6的液體樣品的種類。例如，可分析區(qū)域7的光學(xué)參數(shù)發(fā)射。在一個優(yōu)選實施方案中，上述方法含有下述步驟施加小體積全血樣品，并光學(xué)測定紅細(xì)胞滲漏到流動檢測元件上的關(guān)注區(qū)域中。如果，例如，需要測量全血樣品中的標(biāo)志物，則通常需要避免紅細(xì)胞自己滲漏到檢測區(qū)5。通過上述實施方案，可以檢查出這類滲漏是否發(fā)生。如果測定正確樣品使用的步驟顯示發(fā)生了這類滲漏，那么這就告知使用者在那些條件下收集的測量結(jié)果可能并不準(zhǔn)確。圖2顯示了光學(xué)發(fā)射信號(相對單位)取決于流動檢測元件I上提供不同培養(yǎng)時間的全血樣品的的相對位置(相關(guān)單位)。流動檢測元件I (參見圖I)從左到右掃描至少包含對照區(qū)6、區(qū)域7和檢測區(qū)5。在左手側(cè)，指定給對照區(qū)6的發(fā)射信號的所謂對照帶并不隨時間變化。右手側(cè)的發(fā)射信號的增強(qiáng)則說明有紅細(xì)胞滲漏到流動檢測元件I上的檢測區(qū)5。在說明書、權(quán)利要求書和附圖至少其一中所公開的特征，可以是獨立或以各種組合取作實現(xiàn)本發(fā)明各種實施方案的材料。
權(quán)利要求
1.一種測定小體積體液樣品中的標(biāo)志物的方法，所述方法包括以下步驟 提供具有多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)的流動檢測元件，所述多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)至少部分流體連通且包含施加區(qū)(3 )和檢測區(qū)(5 )，所述檢測區(qū)(5 )與施加區(qū)(3 )流體連通且配置用于測定體液和/或體液組分中的標(biāo)志物， 向流動檢測元件的樣品施加區(qū)(3)施加小體積液體樣品， 測定正確的檢測性能，其中測定正確的檢測性能的步驟包含以下步驟 -測量一個或多個功能區(qū)(3 ；4 ；5 ；6 ；7)的至少一種光學(xué)參數(shù)，以及-將所測量的所述至少一種光學(xué)參數(shù)與指定給所述一個或多個功能區(qū)(3 ；4 ；5 ；6 ；7)的至少一種預(yù)定的光學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，以及， -如果確定了正確的檢測性能，則通過對檢測區(qū)(5)讀數(shù)來測定液體樣品中的標(biāo)志物。
2.權(quán)利要求I的方法，其中測定正確的檢測性能的步驟包括通過光學(xué)測定到達(dá)多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)中的一個區(qū)的一部分所施加的液體樣品是體液還是體液的組分來測定正確的樣品使用的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法，所述方法還包括以下步驟 施加小體積的全血樣品，以及 光學(xué)測定到達(dá)檢測區(qū)(5)的一部分全血樣品是未溶血的還是溶血的血液。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中測量步驟包括光學(xué)測量流體連通于且位于檢測區(qū)(5)和對照區(qū)(6)之間的區(qū)域的步驟。
5.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，其中提供流動檢測元件的步驟包括提供具有至少一個下列區(qū)域的流動檢測元件的步驟位于施加區(qū)(3)和檢測區(qū)(5)之間且與它們流體連通的橋接區(qū)(4)，以及位于檢測區(qū)(5)上游且與其流體連通的對照區(qū)(6)。
6.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，其中測定正確的檢測性能的步驟包括下述步驟光學(xué)測量選自下列功能區(qū)的至少一個功能區(qū)(3，4，5，6，7):施加區(qū)(3)，橋接區(qū)(4)，檢測區(qū)(5)和對照區(qū)(6)。
7.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，其中測定正確的檢測性能的步驟包括光學(xué)測量流動檢測元件位于所述多個功能區(qū)(3，4，5,6,7)之外的區(qū)域的步驟。
8.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，所述方法還包括以下步驟 施加小體積的全血樣品，以及 光學(xué)測定滲漏到流動檢測元件上關(guān)注區(qū)域的紅細(xì)胞滲漏。
9.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，其中測定正確的檢測性能的步驟包括在不同時間進(jìn)行多次光學(xué)測量的步驟。
10.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，其中測定標(biāo)志物的步驟包括至少一個下列步驟 測定標(biāo)志物在液體樣品中的存在，以及 測定標(biāo)志物在液體樣品中的濃度。
11.根據(jù)至少一個前述權(quán)利要求的方法，只要從屬于權(quán)利要求3，其中測定正確的樣品使用的步驟包括光學(xué)測定到達(dá)一個功能區(qū)(3 ；4 ；5 ；6 ；7)的所施加的液體樣品部分是體液還是體液的組分的步驟，所述體液或體液的組分選自全血樣品，血清樣品，血漿樣品，尿液樣品，腦脊液樣品，糞便樣品，唾液樣品和淋巴樣品。
12.測定流動檢測元件的正確檢測性能的方法，所述方法包括以下步驟 提供具有多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)的流動檢測元件，所述多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)至少部分流體連通且包含施加區(qū)(3 )和檢測區(qū)(5 )，所述檢測區(qū)(5 )與施加區(qū)(3 )流體連通且配置用于測定體液和/或體液組分中的標(biāo)志物， 向流動檢測元件的樣品施加區(qū)(3)施加小體積液體樣品， 測定正確的檢測性能，其中測定正確的檢測性能的步驟包括以下步驟 -測量功能區(qū)(3 ；4 ；5 ；6 ；7)的至少一種光學(xué)參數(shù)，以及 -將所測量的所述至少一種光學(xué)參數(shù)與指定給所述一個或多個功能區(qū)(3 ；4 ；5 ；6 ；7)的至少一種預(yù)定的光學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定在小體積體液樣品中的標(biāo)志物的方法，所述方法包含以下步驟提供一種具有多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)的流動檢測元件，所述多個功能區(qū)(3，4，5，6，7)至少部分流體連通且包含施加區(qū)(3)和檢測區(qū)(5)，所述檢測區(qū)(5)與施加區(qū)(3)流體連通且配置用于測定體液和/或體液組分中的標(biāo)志物；向流動檢測元件的樣品施加區(qū)(3)施加小體積液體樣品，測定正確的檢測性能，其中測定正確的檢測性能的步驟包含以下步驟測量一個或多個功能區(qū)(3；4；5；6；7)的至少一種光學(xué)參數(shù)，將所測量的所述至少一種光學(xué)參數(shù)與指定給所述一個或多個功能區(qū)(3；4；5；6；7)的至少一種預(yù)定的光學(xué)參數(shù)進(jìn)行比較，以及，如果確定了正確的檢測性能，則通過對檢測區(qū)(5)讀數(shù)來測定液體樣品中的標(biāo)志物。另外，還提供了一種測定流動檢測元件的正確檢測性能的方法。
文檔編號G01N21/86GK102770751SQ201180010746
公開日2012年11月7日 申請日期2011年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月23日
發(fā)明者弗洛里安·?？斯?申請人:B.R.A.H.M.S 有限公司