專利名稱：應(yīng)用于快速診斷肺癌的專用微流控芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
應(yīng)用于快速診斷肺癌的專用微流控芯片
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種復(fù)合納米微粒修飾電極的肺癌快速診斷器件，該肺癌快速診斷器件是基于抗原/抗體特異性反應(yīng)來診斷肺癌的專用微流控芯片，屬于分析測試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肺癌(Lung cancer)是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，絕大多數(shù)肺癌起源于支氣管粘膜上皮，故亦稱支氣管肺癌。近50多年來，世界各國特別是工業(yè)發(fā)達(dá)國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位，2003年世界衛(wèi)生組織(WHO) 公布的死亡率是110萬/年，發(fā)病率是120萬/年。女性患肺癌的發(fā)生率尤其有上升的趨勢。肺癌目前是全世界癌癥死因的第一名，1995年全世界有60萬人死于肺癌，而且每年人數(shù)都在上升。因此，開發(fā)簡單、快速、高敏感性和特異性診斷方法、試劑和器件，對肺癌進(jìn)行早期診斷和早期治療是防治肺癌并降低病死率的最有效辦法。目前，臨床上用來診斷肺癌的方法有X射線檢查、支氣管鏡檢查、ECT檢查、剖胸探查術(shù)以及生物學(xué)與生物化學(xué)檢查等方法。前四種方法雖然檢測技術(shù)準(zhǔn)確可靠，但設(shè)備昂貴，前處理繁瑣耗時(shí)且需專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)護(hù)人員，很難推廣并普及至廣大肺癌患者現(xiàn)場以及廉價(jià)應(yīng)用?；诿庖邔W(xué)的生物學(xué)與生物化學(xué)檢查方法具有免疫分析本身特有的高選擇性，對肺癌的早期診斷，判斷療效及預(yù)后等方面均有重要意義。然而肺癌的檢測比較復(fù)雜， 傳統(tǒng)的免疫分析通常只針對單一的肺癌診斷抗原進(jìn)行檢測。由于同一種診斷抗原可能出現(xiàn)在不同的癌癥中，或不同種診斷抗原可在同一癌癥中同時(shí)出現(xiàn)，肺癌的診斷抗原主要有 CEA抗原、CA19-9抗原、SCC抗原、NSE抗原等幾種抗原，因此，開展高效的多重免疫分析方法，從生物相關(guān)性的角度同時(shí)真實(shí)地定性、定量反映多種診斷抗原的種類和數(shù)量，在早期預(yù)防和檢測肺癌、判斷肺癌發(fā)展程度、觀察和評價(jià)肺癌治療效果等方面都具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了電化學(xué)檢測的高靈敏度和免疫分析的高特異性，具有樣品用量小、檢測快速、結(jié)果準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于癌癥診斷抗原的檢測，其自動化程度高、廉價(jià)、易制備、快速靈敏等獨(dú)特優(yōu)勢，配合免疫反應(yīng)的高效專一，非常適合構(gòu)建肺癌多重免疫分析檢測的分析儀。有“生命科學(xué)集成電路”之稱的微流控芯片是構(gòu)建微型化、集成化的電化學(xué)免疫傳感器的理想技術(shù)。微流控芯片技術(shù)是將采樣、預(yù)處理、加試劑、反應(yīng)、分離、檢測等集成在一塊微芯片上完成的一門前沿技術(shù)，具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、污染小、操作費(fèi)用低、儀器使用簡便等優(yōu)點(diǎn)且非常適合工業(yè)化生產(chǎn)。微流控技術(shù)代表著21世紀(jì)分析儀器走向微型化、集成化的發(fā)展方向。構(gòu)建適合于肺癌快速診斷的微流控安培檢測芯片具有以下優(yōu)勢(1)通過微加工技術(shù)很容易在芯片上集成多個檢測通道和檢測電極，做到多種肺癌診斷抗原同時(shí)分析，技術(shù)可行性高。(2)通過微流動注射技術(shù)，樣品在管路中的流動保證了電極表面時(shí)刻更新，較好克服了電極易被污染、假陽性率高、結(jié)果平行性差等問題。( 微流控傳感器上管路直徑只有μ m級，反應(yīng)池體積也只有μ L級，分析時(shí)所需試劑用量極少，分析物到達(dá)電極表面的擴(kuò)散距離短、因此可以大大減少溫育時(shí)間，實(shí)現(xiàn)快速聯(lián)檢目標(biāo)。(4)目前微流控傳感器多基于光學(xué)檢測系統(tǒng)，儀器昂貴體積大，全集成很難，而且檢測成本很高，限制了其推廣。而安培免疫傳感器中采用電化學(xué)檢測，體積小、自動化程度高、成本低。目前，在微流控芯片技術(shù)領(lǐng)域，利用肺癌多種診斷抗原的同時(shí)檢測來快速診斷肺癌的相關(guān)技術(shù)和方法尚未見報(bào)道。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的技術(shù)問題是，在微流控芯片技術(shù)這樣一個總的技術(shù)框架內(nèi)，研發(fā)出一種能夠利用肺癌的多種診斷抗體來對肺癌的多種診斷抗原進(jìn)行同時(shí)檢測、快速診斷的專用微流控芯片。本實(shí)用新型通過如下方案解決所述技術(shù)問題，該方案提供的裝置是一種肺癌診斷專用的微流控芯片，該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是一蓋片以及一基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道、 三個池狀物和依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極、對電極以及參比電極， 管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯(lián)通，管道的另一端與余下的另一個池狀物聯(lián)通，所述工作電極由金屬電極以及涂覆在金屬電極表面的膜組成，所述膜由石墨烯、納米金、肺癌診斷抗體與高分子Nafion溶液的混合物構(gòu)成。作為本實(shí)用新型的進(jìn)一步改進(jìn)，所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由四條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四條分支管道內(nèi)，以及，該四個工作電極表層涂覆的肺癌診斷抗體物質(zhì)分別是能與肺癌診斷抗原能特異性結(jié)合的CEA抗體、CA19-9抗體、SCC抗體和NSE抗體。所述工作電極上的膜為復(fù)合納米微粒敏感膜，其中包埋了肺癌診斷抗體。該膜是將石墨烯、納米金、各種肺癌診斷抗體與高分子的Nafion溶液充分混合并振蕩均勻，通過微量注射器滴加于金屬電極表面并使其過夜干燥成膜而成。所述微流控芯片結(jié)構(gòu)中的管道，其內(nèi)徑尺寸均可以是任意選定的尺寸，但是，出于盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗等方面的考慮，所述管道最好均選用毛細(xì)管級的通道，所述毛細(xì)管級的通道意即毛細(xì)管通道，其內(nèi)徑與通常意義上的毛細(xì)管的內(nèi)徑相當(dāng)。所述毛細(xì)管其內(nèi)部通道的橫截面形狀可以是任意的形狀，所述橫截面形狀例如圓形、橢圓形、方形、矩形、條形，當(dāng)然也可以是任意的存在彎曲的線形，并且，所述毛細(xì)管的內(nèi)部形狀隨著管道的延伸，不同部位的橫截面形狀也可以允許是不同的形狀。本案微流控芯片的結(jié)構(gòu)中涉及若干種電極，其尺寸是適于安置在相應(yīng)位置管道內(nèi)的尺寸，但是，基于盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗等方面的考慮，所述電極均為適于安置在毛細(xì)管內(nèi)的微小尺寸的電極， 其中的每一個電極的形狀均可以是任意選定的形狀，所述任意選定的形狀例如方片形狀、 矩形片狀、條狀或圓形片狀等等。其中的每一個電極的材料均可以是任意選定的材料，所述任意選定的材料例如金、銀、鉬或其它金屬等。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及若干個池狀物，所述池狀物是用于實(shí)際被測血清樣品、緩沖溶液以及廢液存儲的池形或囊形構(gòu)造，其中的每一個池狀物的內(nèi)腔其形狀均可以是任意選定的形狀，所述內(nèi)腔形狀例如圓柱形空腔狀、方柱形空腔狀、橢圓形空腔狀或球形空腔狀等等。所述池狀物的尺寸可以是任意選定的尺寸，但是，為了能夠盡量少用待測液樣以及降低試劑損耗，所述池狀物最好是能夠與毛細(xì)管匹配的微小型的池狀物。本案裝置當(dāng)然還可以進(jìn)一步包括一些附件，所述附件例如多道電化學(xué)工作站以及微流動泵等等，所述多道電化學(xué)工作站的技術(shù)含義以及微流動泵的技術(shù)含義是公知的。本案微流控芯片結(jié)構(gòu)中涉及的各個工作電極以及對電極以及參比電極等，可以分別經(jīng)由相應(yīng)的專用串線與所述多道電化學(xué)工作站的相應(yīng)接口進(jìn)行聯(lián)接。所述專用串線是用來將各所述電極與所述多道電化學(xué)工作站的各相應(yīng)接口進(jìn)行相互聯(lián)接的專用電纜。所述微流動泵專用于驅(qū)動微量液體流動，所述微流動泵可以與按需選定的任意一個所述池狀物聯(lián)通。本案微流控芯片的具體實(shí)現(xiàn)路徑可以有多種方法，選其一詳解如下一、高聚物(聚碳酸酯PC)蓋片上化學(xué)鍍微金電極的制備1、以石英/鉻板為光掩模，用選擇波長的紫外光作為光源對PC蓋片表面的選擇性區(qū)域進(jìn)行輻射，生成羧基。2、采用己二胺作為胺化劑，l-[3，-(N_N- 二甲基胺)丙基]_3_己基碳二亞胺鹽酸鹽為偶合劑對經(jīng)過選擇性區(qū)域照射的PC蓋片進(jìn)行胺化反應(yīng)，形成酰胺鍵。3、將經(jīng)過選擇性區(qū)域胺化反應(yīng)的PC蓋片浸入一定濃度的氯金酸溶液中反應(yīng)，金離子絡(luò)合于胺基表面。4、用蒸餾水清洗以后，再將其浸入硼氫化鈉溶液中還原8min。5、用蒸餾水清洗以后，再將其浸入0. 5mol/L的硫氰化鉀溶液中超聲清洗30min， 防止過鍍。6、將經(jīng)過清洗的PC蓋片浸入含有金離子、絡(luò)合劑和還原劑甲醛的鍍液中，于 45-60°C下反應(yīng) lh。7、將鍍有微金電極的蓋片放入烘箱中退火處理約池，即得到本發(fā)明的高聚物PC 多微金電極蓋片。其中微金電極長3mm，寬3mm，厚度約為0. 1mm，相互之間間距約為0. 5mm。二、帶有微通道的高聚物(聚碳酸酯PC)基片的制作1、制作單晶硅陽模繪制芯片設(shè)計(jì)圖，圖形線條寬度約為25-100 μ m，采用高清晰激光照排系統(tǒng)輸出在透明的膠片上，即得到光刻掩模。通過化學(xué)氣相沉積法在基片表面上沉積一層氮化硅薄膜作為犧牲層，在此基片上通過旋轉(zhuǎn)覆膜技術(shù)覆蓋一層光敏膠，于烘箱中60°C處理15-20min ；將光刻掩模覆蓋在基片上，通過暴光成像的原理將光刻掩模上的圖像轉(zhuǎn)移到基片表面的光膠層上；通過干法腐蝕的方法將光膠層上的平面二維圖形加工成具有一定深度的立體結(jié)構(gòu)。即可得到具有凸起的通道的單晶硅陽模。制備好的單晶硅陽模依次用H2A H2SO4溶液(體積比為1 4)，丙酮和蒸餾水清洗，以除去其表面的氧化物。2、采用熱壓法復(fù)制微通道將PC片切割成長約km，寬3cm的尺寸。超聲清洗，自然晾干，在熱壓裝置中將PC 片加熱到軟化溫度(110°C)左右，然后在單晶硅陽模上施加一定的壓力，并持續(xù)約IminjP 可在PC片壓制出與單晶硅陽模互補(bǔ)的微通道。然后，將陽模和刻有微通道的PC基片一起冷卻后脫模，就得到所需的微通道。3、在蓋片上制作三個微小型池狀物在蓋片上采用電鉆在不同的位置上分別鉆出三個微小型池狀物。[0030]三、將高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片在低溫氧等離子氣氛中處理干凈。四、將含有石墨烯、納米金、肺癌診斷抗體與高分子Nafion溶液的混合物溶液分別涂覆于對應(yīng)的微金工作電極上，過夜干燥。五、芯片封合在顯微鏡下對準(zhǔn)高聚物微金電極蓋片和帶有微通道的高聚物基片，將此基片和蓋片固定并用二片蓋玻片夾緊，放置在烘箱中于一定溫度下保溫15min，即可得到所需的四通道微流控芯片。六、將步驟四所完成的PC片分別在工作電極、參考電極及對電極末端利用銀膠接上銅片作為導(dǎo)線，待銀膠完全干后再封上熱熔膠以固定銅片，即完成整個四通道微流控芯片的制作。詳解的本案微流控芯片的上述具體實(shí)現(xiàn)路徑其相關(guān)各個操作參數(shù)可以根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整。本案微流控芯片的使用方法采用外加微泵驅(qū)動液流在四通道微流控芯片的毛細(xì)管通道中穩(wěn)定流動，利用四通道電化學(xué)分析儀器分別對四種肺癌診斷抗原加以檢測。本案微流控芯片的具體檢測使用步驟如下1、采用四通道電化學(xué)分析儀，在微管路中通入一定濃度的作為電子媒介體的鐵氰化鉀溶液，在外加微泵驅(qū)動下，采用安培法檢測上述過程的電流大小。2、在微管路中加入實(shí)際血清樣品液，在外加微泵驅(qū)動下，各種肺癌診斷抗原分子被各通道中工作電極表面上相應(yīng)的肺癌診斷抗體分子捕獲。3、肺癌診斷抗體分子與血清樣品中的肺癌診斷抗原分子形成免疫復(fù)合物，對電子媒介體鐵氰化鉀的電子傳遞起到一定的阻礙作用，安培法檢測上述過程的電流減小程度。4、將電流減小程度的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，由此獲得各種肺癌診斷抗原分子的種類和含量，對肺癌情況進(jìn)行綜合診斷。本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是，在一塊物理器件即微流控芯片上集成了分別涂覆有四種肺癌診斷抗體物質(zhì)的四個工作電極，該四個工作電極分別針對檢測肺癌的四種特征診斷抗原，本案微流控芯片集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了該芯片的使用有助于加快肺癌診斷速度、 提高診斷準(zhǔn)確率、降低診斷費(fèi)用。

圖1是本案微流控芯片實(shí)施例構(gòu)造示意圖，所展示的是該例結(jié)構(gòu)的俯視角度下的透視的形態(tài)，圖中未描繪出所述附件。圖中，1、2、11分別是三個裝設(shè)位置不同的池狀物，3是歧管狀流體通道，4代表裝設(shè)位置不同但相互并聯(lián)形成并聯(lián)聯(lián)通結(jié)構(gòu)的各種管道以及分支管道，5是裝設(shè)在管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷CEA抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極， 6是裝設(shè)在管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷CA19-9抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極，7是裝設(shè)在管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷SCC抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極，8是裝設(shè)在管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷NSE抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極，9是對電極，10是參比電極。
具體實(shí)施方式在圖1所展示的本案實(shí)施例中，該器件也即微流控芯片的結(jié)構(gòu)，包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，兩片板狀物分別是微流控芯片的蓋片以及微流控芯片的基片。在兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道，以及，三個池狀物。該三個池狀物分別是實(shí)際血清樣品存儲的池狀物1、緩沖溶液存儲的池狀物2和廢液存儲的池狀物11。所述管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道3分別與池狀物1以及池狀物2聯(lián)通，所述管道的另一端與余下的一個池狀物11聯(lián)通。該微流控制片還設(shè)有依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極、對電極9和參比電極10。工作電極包括金屬電極以及在金屬電極表層涂覆由石墨烯、納米金、肺癌診斷抗體與高分子Nafion溶液的混合物構(gòu)成的敏感膜。所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，該呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由四條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極分別是工作電極5，6，7，8。其中，工作電極5是裝設(shè)在分支管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷CEA抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極，工作電極6 是裝設(shè)在分支管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷CA19-9抗體與高分子Nafion 溶液的混合物的工作電極，工作電極7是裝設(shè)在分支管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、 肺癌診斷SCC抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極，工作電極8是裝設(shè)在分支管道內(nèi)的其表層涂覆石墨烯、納米金、肺癌診斷NSE抗體與高分子Nafion溶液的混合物的工作電極。本實(shí)用新型微流控芯片的附件還有微流動泵及多道電化學(xué)工作站等附件(未圖示)。本例結(jié)構(gòu)中的各池狀物可以根據(jù)需要與作為附件的微流動泵按任何方式聯(lián)通。本例結(jié)構(gòu)中的各工作電極以及對電極以及參比電極可以分別經(jīng)由各自專用的電纜或曰串線分別與作為附件的多道電化學(xué)工作站的對應(yīng)電纜接口或曰串線接口聯(lián)接。
權(quán)利要求1.一種肺癌快速診斷專用的微流控芯片，其特征在于該微流控芯片的結(jié)構(gòu)包括貼合裝設(shè)在一起的兩片板狀物，所述兩片板狀物分別是一蓋片以及一基片，在所述兩片板狀物之間的相互貼合的位置上裝設(shè)有管道、三個池狀物和依序分別裝設(shè)在所述管道內(nèi)不同位置上的工作電極、對電極以及參比電極，管道的一端經(jīng)由歧管狀流體通道分別與其中的兩個池狀物聯(lián)通，管道的另一端與余下的另一個池狀物聯(lián)通，所述工作電極由金屬電極以及涂覆在金屬電極表面的含肺癌診斷抗體的敏感膜構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺癌快速診斷專用的微流控芯片，其特征在于所述管道的構(gòu)造呈并聯(lián)構(gòu)造，所述呈并聯(lián)構(gòu)造的管道由四條分支管道并聯(lián)構(gòu)成，以及，所述工作電極的數(shù)量是四個，該四個工作電極的裝設(shè)位置分別位于所述四條分支管道內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任意一項(xiàng)所述的肺癌快速診斷專用的微流控芯片，其特征在于所述管道均為毛細(xì)管通道。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種復(fù)合納米微粒修飾電極的肺癌快速診斷器件，該器件是微流控芯片，屬于分析測試領(lǐng)域。該微流控芯片內(nèi)含有呈并聯(lián)構(gòu)造的管道，該并聯(lián)構(gòu)造含有四條相互并聯(lián)的分支管道，共有四個工作電極分別裝設(shè)在所述四條分支管道內(nèi)，所述工作電極由金屬電極以及涂覆在其表面的含有石墨烯、納米金、肺癌診斷抗體與高分子Nafion溶液的混合物構(gòu)成，該四個工作電極表面的肺癌診斷抗體物質(zhì)分別是特異性抗體CEA抗體、CA19-9抗體、SCC抗體和NSE抗體。該芯片具有簡約、集成的結(jié)構(gòu)。本實(shí)用新型有利于加快肺癌診斷速度、提高診斷準(zhǔn)確率、降低診斷費(fèi)用。
文檔編號G01N33/574GK202066861SQ20112008260
公開日2011年12月7日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者李海英, 李龍飛, 楊欣, 滿沛志, 牛興杰, 袁吉, 鄭甜 申請人:懷化學(xué)院