專利名稱:基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本實(shí)用新型涉及一種生物檢測(cè)技術(shù),特別是微流控蛋白電泳沖芯片檢技術(shù),確切講是基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置。
背景技術(shù):
蛋白質(zhì)分析在生物學(xué),醫(yī)學(xué),制藥,生態(tài)學(xué)(農(nóng)業(yè),環(huán)境,食品)研究及產(chǎn)業(yè)過程中被大量應(yīng)用,是一項(xiàng)不可缺少的基本技術(shù)。在現(xiàn)代科學(xué),生產(chǎn),生活過程中被廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)分析方法一般采用免疫印跡(western blot)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)以及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的單點(diǎn)檢測(cè)方法。這些方法費(fèi)時(shí),費(fèi)材,檢測(cè)步驟和過程復(fù)雜。生物芯片技術(shù)是近年興起,汲取生物技術(shù)、微電子加工技術(shù)、納米技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的豐富內(nèi)涵和精華發(fā)展而成,體現(xiàn)了生物技術(shù)的綜合優(yōu)勢(shì)。生物芯片技術(shù)簡(jiǎn)化了反應(yīng)步驟,克服了上述所有缺點(diǎn),具有同步多點(diǎn)檢測(cè),快速,省材,高效,準(zhǔn)確,經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn),在生物檢測(cè)領(lǐng)域具有劃時(shí)代的意義,是蛋白質(zhì)分析方法大勢(shì)所趨的發(fā)展方向。生物芯片就是在經(jīng)過特殊的表面超微加工處理并連接上相關(guān)的探測(cè)生物分子的一塊厘米見方的材料(玻片、硅片、塑料膜)上進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng),然后由專用的儀器收集檢測(cè)信號(hào),再用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)并給出結(jié)果。生物芯片是微電子學(xué)、微流體力學(xué)、化學(xué)、信息學(xué)和生物學(xué)相互交叉形成的一項(xiàng)高新技術(shù)。生物芯片技術(shù)可以對(duì)細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)等生物組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快捷和大信息量的檢測(cè)分析。目前常見的生物芯片依其技術(shù)特征分為三類第一類為微陣列芯片,包括基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片,技術(shù)較為成熟的微陣列芯片已經(jīng)大量進(jìn)入實(shí)用。第二類為微流控芯片(屬于主動(dòng)式芯片),包括各類樣品制備芯片、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)芯片、 毛細(xì)管電泳芯片和色譜芯片等。是生物芯片的第二代產(chǎn)品。微流體芯片等技術(shù)正在逐漸成熟并開始被各領(lǐng)域應(yīng)用。第三類為以生物芯片為基礎(chǔ)的集成化分析系統(tǒng)(也被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室)?!靶酒瑢?shí)驗(yàn)室”可以完成諸如樣品制備、試劑輸送、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測(cè)、信息處理和傳遞等一系列復(fù)雜工作。是生物芯片技術(shù)的最高境界。依其檢測(cè)對(duì)象可分為四類基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。電阻脈沖感應(yīng)芯片屬于微流控蛋白電泳沖芯片一類。生物芯片原理由兩部分組成即生物雜交(如核酸引物與DNA或RNA特異結(jié)合; 或抗原抗體特異結(jié)合等)和物理化學(xué)信號(hào)傳遞[如電子,光學(xué),壓電(piezoelectric), 磁,顯色等]。目前通用的生物芯片的分析技術(shù)原理是熒光抗體免疫標(biāo)記顯色原理,其物理化學(xué)信號(hào)傳遞系統(tǒng)為色譜光譜,并通過光學(xué)系統(tǒng)分析。色譜分光光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)面臨價(jià)部件復(fù)雜,格昂貴,體積龐大,不便攜帶的技術(shù)瓶頸。庫(kù)爾特原理由Wallace H. Coulter于1941年發(fā)明。因他發(fā)現(xiàn)通過電負(fù)荷測(cè)定可測(cè)量顆粒的直徑和數(shù)量而被命名為庫(kù)爾特測(cè)定原理。以該原理制造的各種庫(kù)爾特計(jì)數(shù)器 (Coulter Counter),由于能快速準(zhǔn)確測(cè)定從細(xì)胞到各種顆粒(如病毒,DNA,金屬顆粒,聚合材料顆粒等)而被醫(yī)院等相關(guān)機(jī)構(gòu)廣泛采用至今。是一個(gè)非常成熟可靠的技術(shù)原理。近十年來用庫(kù)爾特測(cè)定原理開發(fā)出了離子通道膜片鉗技術(shù)(ion channel patch clamp)已被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞和細(xì)胞離子通道的研究和藥物開發(fā)。其核心理論是當(dāng)?shù)蛯?dǎo)電的分子顆粒占據(jù)通道空間時(shí),替代了原有的導(dǎo)電液體,引起電阻短暫增加,產(chǎn)生電阻脈沖。其電阻脈沖的大小與分子顆粒的直徑直接相關(guān)(庫(kù)爾特測(cè)定原理)。以庫(kù)爾特原理制作的計(jì)數(shù)儀都是以機(jī)械提供泵動(dòng)力系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)測(cè)定顆粒流動(dòng)的。當(dāng)把庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀微縮成芯片時(shí),應(yīng)用微泵驅(qū)動(dòng)芯片反應(yīng)液會(huì)帶來很多不便需要安裝很多微管,微泵,微閥等。一方面使制作工藝復(fù)雜化,限制了芯片體積微型化,另一方面大大增加了芯片制作及使用成本。從而限制了微流控芯片的發(fā)展應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種工藝簡(jiǎn)單、芯片體積小、快速、簡(jiǎn)便、成本低的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置。本實(shí)用新型的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的,基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是包括檢測(cè)平臺(tái),檢測(cè)平臺(tái)內(nèi)有漏斗加樣口和漏斗出口,漏斗加樣口和漏斗出口內(nèi)分別有反應(yīng)池和泄池,反應(yīng)池和泄池內(nèi)的反應(yīng)液,三明治電極的正電極和三明治電極的負(fù)電極的一端分別插入反應(yīng)池和泄池,三明治電極的正電極和三明治電極的負(fù)電極的另一端與檢測(cè)單元電連接。三明治電極的正電極和三明治電極的負(fù)電極分別由兩層電極和兩層電極之間絕緣層構(gòu)成,三明治電極的正電極和三明治電極的負(fù)電極其中一層輸出穩(wěn)定的直流電壓到反應(yīng)池電極和泄池電極,輸出穩(wěn)定的直流電壓稱為電壓電極組,三明治電極的正電極和三明治電極的負(fù)電極的另一層電極為信號(hào)電極組,從芯片反應(yīng)中采集變化的電阻信號(hào)。所述的檢測(cè)單元包括,MCU處理器、電壓信號(hào)接口端、弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路、信號(hào)濾波處理單元、穩(wěn)壓電源單元、信號(hào)采集控制電路和信號(hào)分析單元,所述的電壓電極組1與穩(wěn)壓電源單元電連接,穩(wěn)壓電源單元提供的0. 2-0. 4伏的直流電壓。 所述的信號(hào)電極組與檢測(cè)電路的弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路輸入端電連接,弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路輸出端經(jīng)信號(hào)濾波處理單元濾波處理后,與信號(hào)采集控制電路輸入端電連接,MCU 處理器與信號(hào)采集控制電路控制端電連接。所述的弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路包括由四個(gè)運(yùn)算放大器U1、U2、U3、U4和外部電阻R1、 R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Cl及C2構(gòu)成三運(yùn)放差分測(cè)量放大器電路,其中,Ul和 U2構(gòu)成兩個(gè)前級(jí)差分電路,兩個(gè)前級(jí)差分電路的同相輸入端分別接來自反應(yīng)池電極7和泄池電極8變化的電阻信號(hào),兩個(gè)前級(jí)差分電路Ul的異相輸入端分別分兩路,一路通過電阻 Rl與U2異相輸入端電連接的電阻R2串聯(lián)電連接,Ul的異相輸入端另一路通過電阻R7與 Ul的輸出端電連接,U2的異相輸入端通過電阻R8與U2的輸出端電連接,Rl和R2的連接點(diǎn)通過運(yùn)放U4構(gòu)成的射隨器與連接反應(yīng)池電極7和泄池電極8的信號(hào)線屏蔽層電連接;Ul 的輸出端通過電阻R5接運(yùn)放U3的異相端,U3的異相端與U3的輸出端并接電阻R9和電容 C2,U3的同相端與地之間并接電阻RlO和電容Cl。所述的R3 禾口 R4 可取 IOk Ω、Rl 禾口 R2 可取 1. Ok Ω、R7 禾口 R8 可取 20k Ω、R5 禾口 R6 可取 IOk Ω、R9 禾口 RlO 可取 20k Ω、Cl 禾口 C2 可取 10pF。所述的三運(yùn)放差分測(cè)量放大器電路放大倍數(shù)在18-22倍之間。本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是由于采用了“浮地”電路設(shè)計(jì),通過取Rl和R2上的共模信號(hào),由U4放大去驅(qū)動(dòng)屏蔽層,使電路具有很高的共模抑制能力,對(duì)于50HZ交流電源干擾及外界其它電噪聲干擾可大幅度消除。下面結(jié)合實(shí)施例附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明
圖1是本實(shí)用新型實(shí)施例結(jié)構(gòu)示意圖;圖2是本實(shí)用新型實(shí)施例電路原理圖;圖3是圖2中檢測(cè)單元的電路圖。圖中,1、電壓電極組;2、絕緣層;3、信號(hào)電極組;4、三明治電極的正電極;5、三明治電極的負(fù)電極;6、檢測(cè)平臺(tái);7、漏斗加樣口 ;8、漏斗出口 ;9、檢測(cè)單元;901、MCU處理器; 902、電壓信號(hào)接口端;903、弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路;904、信號(hào)濾波處理單元;905、穩(wěn)壓電源單元;906、信號(hào)采集控制電路和信號(hào)分析單元907。
具體實(shí)施方式
如圖1所示,包括檢測(cè)平臺(tái)6,包括檢測(cè)平臺(tái)6,檢測(cè)平臺(tái)6內(nèi)有漏斗加樣口 7和漏斗出口 8,漏斗加樣口 7和漏斗出口 8內(nèi)分別有反應(yīng)池和泄池,反應(yīng)池和泄池內(nèi)的反應(yīng)液,三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5的一端分別插入反應(yīng)池和泄池,三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5的另一端與檢測(cè)單元電9連接。三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5分別由兩層電極和兩層電極之間絕緣層2構(gòu)成,三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5其中一層輸出穩(wěn)定的直流電壓到反應(yīng)池和泄池內(nèi)的反應(yīng)液,輸出穩(wěn)定的直流電壓稱為電壓電極組1,三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5的另一層電極為信號(hào)電極組3,從芯片反應(yīng)中采集變化的電阻信號(hào)。電壓電極組1與漏斗加樣口內(nèi)的反應(yīng)池和漏斗出口內(nèi)的泄池通過反應(yīng)液連接形成電壓閉合回路。信號(hào)電極組3與漏斗加樣口內(nèi)的反應(yīng)池和漏斗出口內(nèi)的泄池通過反應(yīng)液連接形成電流閉合回路。信號(hào)電極組3的信號(hào)輸出與檢測(cè)單元9電連接,由檢測(cè)單元9分析處理電信號(hào)進(jìn)行信號(hào)采集,識(shí)別,分析。如圖2所示,檢測(cè)單元9包括,MCU處理器901、電壓信號(hào)接口端902、弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路903、信號(hào)濾波處理單元904、穩(wěn)壓電源單元905、信號(hào)采集控制電路906和信號(hào)分析單元907。供給三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5中的電壓是由穩(wěn)壓電源單元905提供的0. 2-0. 4伏的直流電壓。三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5 中的輸出電流通過電壓信號(hào)接口端902與檢測(cè)電路9的弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路903輸入端電連接,弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路903輸出端經(jīng)電連接的信號(hào)濾波處理單元904濾波處理,濾波處理后的信號(hào)在進(jìn)入信號(hào)采集控制電路906,由信號(hào)采集控制電路906進(jìn)入MCU處理器901, 由MCU處理器901經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換電路進(jìn)行轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)進(jìn)行處理。信號(hào)濾波處理單元904包所換括程控放大與濾波處理,信號(hào)濾波處理單元904保證信號(hào)的完整傳輸和減少外來干擾,為后級(jí)信號(hào)采集做好準(zhǔn)備。信號(hào)采集控制電路906在MCU處理器901的控制下進(jìn)行多位模數(shù)轉(zhuǎn)換(A/D變換) 以便數(shù)據(jù)處理。由于是微弱信號(hào),將約0. 03毫伏生物電信號(hào)進(jìn)行變化放大,要對(duì)電源有極高的要求。[0026]弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路903如圖3所示,弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路903包括由四個(gè)運(yùn)算放大器 Ul、U2、U3、U4 和外部電阻 Rl、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、Cl 及 C2 構(gòu)成三運(yùn)放差分測(cè)量放大器電路,其中,Ul和U2構(gòu)成兩個(gè)前級(jí)差分電路,兩個(gè)前級(jí)差分電路的同相輸入端分別接來自反應(yīng)池電極7和泄池電極8變化的電阻信號(hào),兩個(gè)前級(jí)差分電路Ul的異相輸入端分別分兩路,一路通過電阻Rl與U2異相輸入端電連接的電阻R2串聯(lián)電連接,Ul 的異相輸入端另一路通過電阻R7與Ul的輸出端電連接,U2的異相輸入端通過電阻R8與 U2的輸出端電連接,Rl和R2的連接點(diǎn)通過運(yùn)放U4構(gòu)成的射隨器與連接反應(yīng)池電極7和泄池電極8的信號(hào)線屏蔽層電連接;Ul的輸出端通過電阻R5接運(yùn)放U3的異相端,U3的異相端與U3的輸出端并接電阻R9和電容C2,U3的同相端與地之間并接電阻RlO和電容Cl。 U3可選精密低漂型運(yùn)算放大器,R3和R4可取IOk Ω、Rl和R2可取1. Ok Ω、R7和R8可取 20kQ、R5和R6可取IOkQ、R9和RlO可取20k Ω、Cl和C2可取10pF??紤]到微控信號(hào)的高頻響應(yīng)的存在,放大倍數(shù)應(yīng)控制在18-22倍之間。放大18-22倍后的輸出信號(hào)與分析單元907電連接,由分析單元907識(shí)別和分析芯片中的生物芯片。由于采用了“浮地”電路設(shè)計(jì),通過取Rl和R2上的共模信號(hào),由U4放大去驅(qū)動(dòng)屏蔽層,使電路具有很高的共模抑制能力,對(duì)于50HZ交流電源干擾及外界其它電噪聲干擾可大幅度消除。使用時(shí),加樣品和抗體標(biāo)記探針液各IuL于漏斗加樣口,待測(cè)反應(yīng)液與混有特異抗原(體)顆粒與樣品中的相應(yīng)的抗體(原)立即形成抗原抗體結(jié)合顆?;旌衔?混合顆粒),然后同時(shí)分別插入三明治二合一電極于漏斗加樣口 7和漏斗出口 8內(nèi),三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5的電壓電極組1由穩(wěn)壓電源單元905輸入恒定電壓,使放入漏斗加樣口 7和漏斗出口 8內(nèi)的反應(yīng)液形成導(dǎo)電閉合通路,檢測(cè)單元9內(nèi)的穩(wěn)壓電源單元905驅(qū)動(dòng)含電荷的混合顆粒,由經(jīng)芯片濾膜濾掉凝聚混合顆粒,使單個(gè)混合顆粒進(jìn)入芯片反應(yīng)池,在通過芯片測(cè)定孔向芯片泄池移動(dòng)。當(dāng)單個(gè)混合顆粒通過芯片測(cè)定孔時(shí),混合顆粒的導(dǎo)電率低于反應(yīng)液的導(dǎo)電率而產(chǎn)生一個(gè)電阻脈沖。通過三明治電極的正電極4和三明治電極的負(fù)電極5的一組信號(hào)電極組3捕捉電阻脈沖信號(hào),信號(hào)電極組3將獲取的信號(hào)送到弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路903進(jìn)行放大,再由后級(jí)電路進(jìn)行分析處理并報(bào)告出抗原抗體特異的結(jié)果。
權(quán)利要求1.基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是包括檢測(cè)平臺(tái)(6),檢測(cè)平臺(tái)(6)內(nèi)有漏斗加樣口(7)和漏斗出口(8),漏斗加樣口(7)和漏斗出口⑶內(nèi)分別有反應(yīng)池和泄池,反應(yīng)池和泄池內(nèi)的反應(yīng)液,三明治電極的正電極(4)和三明治電極的負(fù)電極(5)的一端分別插入反應(yīng)池和泄池,三明治電極的正電極⑷和三明治電極的負(fù)電極 (5)的另一端與檢測(cè)單元電(9)連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是所述的三明治電極的正電極⑷和三明治電極的負(fù)電極(5)分別由兩層電極和兩層電極之間絕緣層⑵構(gòu)成,三明治電極的正電極⑷和三明治電極的負(fù)電極(5)其中一層輸出穩(wěn)定的直流電壓到反應(yīng)池和泄池內(nèi)的反應(yīng)液,輸出穩(wěn)定的直流電壓一組為電壓電極組 (1),三明治電極的正電極(4)和三明治電極的負(fù)電極(5)的另一層電極為信號(hào)電極組(3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是所述的檢測(cè)單元(9)包括MCU處理器(901)、電壓信號(hào)接口端(902)、弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路(903)、信號(hào)濾波處理單元(904)、穩(wěn)壓電源單元(905)、信號(hào)采集控制電路(906)和信號(hào)分析單元(907),所述的電壓電極組(1)與穩(wěn)壓電源單元(905)電連接,穩(wěn)壓電源單元 (905)輸出0. 2-0. 4伏的直流電壓。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是所述的信號(hào)電極組(3)與檢測(cè)電路(9)的弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路(903)輸入端電連接,弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路(903)輸出端經(jīng)信號(hào)濾波處理單元(904)濾波處理后,與信號(hào)采集控制電路(906)輸入端電連接,MCU處理器(901)與信號(hào)采集控制電路(906)控制端電連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是所述的弱脈沖電流轉(zhuǎn)換電路包括由四個(gè)運(yùn)算放大器Ul、U2、U3、U4和外部電阻Rl、R2、 R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、RlO、Cl及C2構(gòu)成三運(yùn)放差分測(cè)量放大器電路,其中,Ul和U2構(gòu)成兩個(gè)前級(jí)差分電路,兩個(gè)前級(jí)差分電路的同相輸入端分別接來自反應(yīng)池電極7和泄池電極8變化的電阻信號(hào),兩個(gè)前級(jí)差分電路Ul的異相輸入端分別分兩路,一路通過電阻Rl與 U2異相輸入端電連接的電阻R2串聯(lián)電連接,Ul的異相輸入端另一路通過電阻R7與Ul的輸出端電連接,U2的異相輸入端通過電阻R8與U2的輸出端電連接,Rl和R2的連接點(diǎn)通過運(yùn)放U4構(gòu)成的射隨器與連接反應(yīng)池電極7和泄池電極8的信號(hào)線屏蔽層電連接;Ul的輸出端通過電阻R5接運(yùn)放U3的異相端,U3的異相端與U3的輸出端并接電阻R9和電容C2, U3的同相端與地之間并接電阻RlO和電容Cl。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是所述的R3禾口 R4可取IOk Ω、Rl禾口 R2可取1. Ok Ω、R7禾口 R8可取20k Ω、R5禾口 R6可取 IOk Ω、R9 禾口 RlO 可取 20k Ω、Cl 禾口 C2 可取 10pF。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置,其特征是所述的三運(yùn)放差分測(cè)量放大器電路放大倍數(shù)在18-22倍之間。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種生物檢測(cè)技術(shù),特別是微流控蛋白電泳沖芯片檢技術(shù),確切講是基于庫(kù)爾特原理的電阻脈沖式生物芯片檢測(cè)裝置。包括檢測(cè)平臺(tái)(6),檢測(cè)平臺(tái)(6)內(nèi)有漏斗加樣口(7)和漏斗出口(8),漏斗加樣口7和漏斗出口(8)內(nèi)分別有反應(yīng)池和泄池,反應(yīng)池和泄池內(nèi)的反應(yīng)液,三明治電極的正電極(4)和的負(fù)電極(5)的一端分別插入反應(yīng)池和泄池,三明治電極的正電極(4)和三明治電極的負(fù)電極(5)的另一端與檢測(cè)單元電(9)連接。由于采用了三明治電極和“浮地”電路設(shè)計(jì),通過取R1和R2上的共模信號(hào),由U4放大去驅(qū)動(dòng)屏蔽層,使電路具有很高的共模抑制能力,對(duì)于50Hz交流電源干擾及外界其它電噪聲干擾可大幅度消除。
文檔編號(hào)G01N27/08GK202119745SQ20112006300
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者朱棠, 楊振江, 林暉, 王惠杰 申請(qǐng)人:朱棠, 林暉, 王惠杰