專利名稱：一種檢測苯乙醇胺a的間接競爭法酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和獸藥殘留檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種用于檢測苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
苯乙醇胺A又稱為克侖巴胺(clenrapmine CLRA)，學(xué)名為2_4-(4_硝基苯基)丁基-2-基氨基-1-甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)?？藖霭桶肥歉Ｄ亓_的同分異構(gòu)體，是美國禮來公司合成萊克多R胺的副產(chǎn)物，具有同痺肉精和萊克多R胺相同的作用和效果，屬于激動劑的一種，具有營養(yǎng)再分配作用。被農(nóng)業(yè)部第1519號公告列為禁止在飼料和動物飲水中使用的物質(zhì)，苯乙醇胺A與“瘦肉精”同屬于腎上腺素受體激動劑，2010年底農(nóng)業(yè)部公告禁止在飼料和動物飲用水中添加該物質(zhì)?，F(xiàn)有的苯乙醇胺A檢測方法多為色譜法，但是這些方法的靈敏度受樣品的凈化、 濃縮等步驟的影響較大；再者這些方法需要復(fù)雜的儀器，且過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場大量樣本的篩查?；诳乖贵w免疫反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)為苯乙醇胺A殘留物的分析檢測提供了一個新的途徑。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原分子的設(shè)計、合成和人工全抗原及抗體的制備。因為苯乙醇胺A是小分子化合物，本身沒有免疫原性，必須將其與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到具有免疫原性的人工抗原。目前苯乙醇胺A的ELISA方法尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明提供了一種快速檢測苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒包括苯乙醇胺A特異性抗體、苯乙醇胺A-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。其中苯乙醇胺A特異性抗體為兔抗苯乙醇胺A的多克隆抗體，可用苯乙醇胺A與載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原通過免疫動物(例如兔)制得。所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。所述的苯乙醇胺A-載體蛋白偶聯(lián)物采用化學(xué)方法偶聯(lián)得到。所述酶標(biāo)二抗的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶，所述酶標(biāo)二抗可以用商品化的辣根過氧化物酶酶標(biāo)二抗，也可以通過過碘酸鈉法或戊二醛法將辣根過氧化物酶與二抗偶聯(lián)制得。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述酶標(biāo)二抗為羊抗兔IgG抗體。用于制備所述酶標(biāo)板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應(yīng)板凹孔。為方便現(xiàn)場檢測和大量樣本篩查，所述試劑盒還可以進一步包括包被有苯乙醇胺 A抗原的酶標(biāo)板、苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。所述的洗滌液為0. 05% -0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑 A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1 1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。所述的濃縮樣品稀釋液為含0. 吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢飼料測樣品中苯乙醇胺A含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有苯乙醇胺A抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入抗苯乙醇胺A多克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記二抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終上，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。本發(fā)明試劑盒的檢測原理為將苯乙醇胺A抗原吸附于固相載體上，加入樣本或苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入苯乙醇胺A抗體工作液，待測樣品中苯乙醇胺A和固相載體上包被的苯乙醇胺A抗原競爭苯乙醇胺A抗體，再加入酶標(biāo)記抗抗體進行酶活性的放大作用，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中苯乙醇胺A的量呈負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出苯乙醇胺A濃度范圍。有益效果本發(fā)明檢測苯乙醇胺A的試劑盒主要采用間接競爭酶聯(lián)免疫測定法定性或定量樣品中苯乙醇胺A含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品。本發(fā)明該試劑盒采用高特異性的苯乙醇胺A多克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少試劑盒的操作步驟，為使用者節(jié)省時間并降低因操作步驟冗繁造成的誤差， 本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強、高精確度、高準(zhǔn)確度、對儀器設(shè)備要求低、試劑保存時間長、自動化程度高、無放射性同位素污染的等優(yōu)點，可在飼料及動物源性產(chǎn)品檢測中發(fā)揮重要作用。


附圖為苯乙醇胺A間接競爭抑制曲線。 具體實施方案提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，而決不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成任何限制。實施例1免疫原的合成及免疫血清的制備1. 1試劑與儀器苯乙醇胺A (杭州迪恩科技有限公司惠贈)，琥珀酸酐(購自北京耀北生物技術(shù)有限公司)，吡啶(Pyridine, AR. WM = 79. 10，含量> 99. 5%，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，N，N- 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美國新澤西州ACR0S0RGANICS公司生產(chǎn)，購自百靈威化學(xué)試劑公司)，EDC(購自百靈威化學(xué)試劑公司)，牛血清白蛋白(BSA)JP 清蛋白(OVA)等(購自北京耀北生物技術(shù)有限公司)，其它試劑均為分析純。雙光束紫外可見分光光度儀(TU-1909，北京普析通用儀器有限公司)，層析裝置 (3057型便攜式記錄儀，重慶川儀四廠；SBS系列數(shù)控計滴器，恒流泵，自動部分收集器，層析柱，上海滬西分析儀器廠)，磁力攪拌器(上海東榮豐科學(xué)儀器有限公司)，臺式離心機(Minispin 最大轉(zhuǎn)速 13400rpm 最大離心力 12100rcf，2ml X 12)，1. 2苯乙醇胺A人工抗原的合成稱取苯乙醇胺A 3. 3mg(0. Olmmol)溶于0. 4ml吡啶溶液中，加入琥珀酸酐^ig室溫攪拌反應(yīng)過夜。吹干吡啶，用0. aiilDMF溶解酸酐活化的苯乙醇胺A，活化的苯乙醇胺A溶液逐滴加入到0. IM pH 7. 5冰冷載體蛋白(BSA或OVA)PBS溶液中，然后加入EDC 20mg，攪拌反應(yīng)過夜。然后，將偶聯(lián)物過S印hadeXG-25M凝膠層析純化，用0. OlM pH 7. 4PBS三倍柱床體積平衡，調(diào)節(jié)流速至3ml/min，樣品濃縮至5ml加入到平衡好的層析柱中層析提純偶聯(lián)物， 洗脫液用 PH 7. 4 0. OlM PBS。1. 3免疫及特異性抗體的制備將上述苯乙醇胺A-BSA偶聯(lián)物用生理鹽水稀釋成lmg/ml溶液備用。選取6只體重2 2. 5Kg健康雄性新西蘭大白兔。將偶聯(lián)物與等量弗氏完全佐劑通過注射器對抽法混合成油包水的乳濁液，按lmg/Kg體重的量進行首次免疫，采取背部皮下多點注射。每隔兩周加強免疫一次，用弗氏不完全佐劑代替弗氏完全佐劑，劑量及方法同首次免疫。從第三次免疫開始，每次免疫后10天，耳緣靜脈取血1ml，進行抗體效價檢測，當(dāng)抗體效價不再升高時，不加佐劑進行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后頸動脈放血，室溫凝固后4°C過夜，8000r/min離心10分鐘，除去血塊，血清部分用50%飽和硫酸銨溶液沉淀，離心去上清液，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，再用33%飽和硫酸銨溶液沉淀兩次，沉淀物用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經(jīng)透析后用SephadexG-25M層析，即得多克隆抗體。實施例2免疫檢測方法的建立2. 1 ELISA方法確定最佳包被濃度將ΙΟΟΟμ g/mlU00y g/mlU0y g/ml,5y g/mlUu g/ml,0. 25 μ g/ml 系列濃度的卵清蛋白(OVA)-苯乙醇胺A偶聯(lián)物按每孔100μ 1包被酶標(biāo)板，4°C包被Mh，洗滌5次， 拍干，按每孔200μ1封閉液4°C下封閉12h，洗滌3次，拍干。加入1 500稀釋的抗血清100 μ 1，室溫作用池，洗滌三次，立即加入100 μ 1酶標(biāo)羊抗兔抗體，室溫作用30min，洗滌三次，加100 μ 1底物液，室溫避光作用15min，50 μ 1終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測A值 G50nm)。同時設(shè)置空白對照孔(不加抗血清，只加其稀釋液)和平行重復(fù)孔，取OD值為 1.0左右時的包被濃度為最佳濃度。試驗數(shù)據(jù)列于表3。表1不同包被濃度的OD值
權(quán)利要求
1.一種檢測苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒，其中包括苯乙醇胺A特異性抗體、苯乙醇胺A-載體蛋白偶聯(lián)物和酶標(biāo)二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括包被了苯乙醇胺A抗原或抗苯乙醇胺A特異性抗體的酶標(biāo)板、苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液和濃縮樣品稀釋液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述苯乙醇胺A特異性抗體為兔多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白或鑰孔銅蘭蛋白(KLH)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)二抗的酶為辣根過氧化物酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)二抗為羊抗兔IgG抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含有 0. 05% -0. 5%吐溫-20磷酸鹽緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述的濃縮樣品稀釋液為含 0. 吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。
10.一種檢測樣品中苯乙醇胺A含量的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-9任一所述的試劑盒進行檢測，向包被有苯乙醇胺A抗原的酶標(biāo)板孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，再加入抗苯乙醇胺A多克隆抗體，孵育后洗滌拍干，加入酶標(biāo)記二抗，孵育后洗滌拍干，顯色、終上，用酶標(biāo)儀測定吸光度值；(3)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒包括苯乙醇胺A特異性抗體、苯乙醇胺A與載體蛋白的偶聯(lián)物、和酶標(biāo)二抗。本發(fā)明的檢測苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫試劑盒靈敏、快速、準(zhǔn)確，主要用于大批樣品的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準(zhǔn)確性等特點，可快速檢測飼料及畜產(chǎn)品中殘留的苯乙醇胺A。
文檔編號G01N33/543GK102520158SQ201110445520
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者于洪俠 申請人:于洪俠