專利名稱：一種用于對(duì)硫磷快速檢測(cè)的直接包被elisa方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于對(duì)硫磷快速檢測(cè)的ELISA方法，特別涉及直接包被ELISA檢測(cè)方法，屬于檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，建立的直接包被ELISA檢測(cè)方法可以用于研制對(duì)硫磷免疫速測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
對(duì)硫磷(0，O-二乙基-0-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯)為淺黃色液體，沸點(diǎn)113°C /6.7Pa，熔點(diǎn)6°C，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，在水中溶解度約為24ppm。在中性及弱酸性介質(zhì)中比較穩(wěn)定，但在堿性溶液中很快水解。對(duì)硫磷是廣譜高毒的有機(jī)磷酸酯類殺蟲、殺螨劑，具有強(qiáng)烈的觸殺與胃毒作用并有一定的熏蒸作用。對(duì)硫磷對(duì)人畜的毒性很高，中毒事件常有發(fā)生，且在食品和蔬菜中的殘留量超標(biāo)情況較多。對(duì)硫磷對(duì)人類的毒副作用主要表現(xiàn)為抑制膽堿酯酶活性，引起慢性中毒、遲發(fā)性神經(jīng)毒性問題，引起神經(jīng)生理功能紊亂。此外，我國(guó)出口的農(nóng)產(chǎn)品也因有機(jī)磷農(nóng)藥殘留超標(biāo)而屢屢發(fā)生被拒收、扣留、退貨、索賠和撤消合同等事件，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于以上情況，我國(guó)政府已決定停止生產(chǎn)和使用對(duì)硫磷，并將其列為農(nóng)藥殘留的重要檢測(cè)對(duì)象。因此，建立快速、高效、靈敏的對(duì)硫磷檢測(cè)方法具有重要意義。對(duì)硫磷殘留量的檢測(cè)方法主要依賴于昂貴、費(fèi)時(shí)、前處理復(fù)雜的儀器分析方法，如HPLC、GC、GC-MS等。ELISA具有選擇性好、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)彌補(bǔ)了儀器方法的不足，成為快速篩選檢測(cè)方法發(fā)展的一種趨勢(shì)。在常規(guī)ELISA中，小分子半抗原需要與載體蛋白偶聯(lián)，合成半抗原-蛋白偶聯(lián)物，并通過疏水作用固定在酶標(biāo)板表面。然而這種非特異性吸附存在著很多弊端:首先半抗原與載體蛋白偶聯(lián)反應(yīng)沒有好的重復(fù)性，不利于分析標(biāo)準(zhǔn)化。其次半抗原-載體蛋白是通過靜電作用固定在酶標(biāo)板表面，該過程很容易導(dǎo)致小分子半抗原被載體蛋白屏蔽。在微孔板表面直接偶聯(lián)半抗原的形式可以克服上述的一些缺點(diǎn)。通常酶標(biāo)板表面沒有功能基團(tuán)與半抗原偶聯(lián)，所以需要在聚苯乙烯表面修飾上一些功能基團(tuán)，如羥基，醛基，氨基等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種直接包被ELISA方法用于對(duì)硫磷的快速檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:一種氨基對(duì)硫磷，其結(jié)構(gòu)式如式I所示:
權(quán)利要求
1.一種對(duì)硫磷半抗原,具有式I結(jié)構(gòu):
2.式I所示對(duì)硫磷半抗原的制備方法，由如下步驟組成: 稱取對(duì)硫磷5g溶于50mL乙醚，倒入分液漏斗中，用冷的1 %碳酸鈉溶液萃取四次，每次.1OmL,棄去水層；上述乙醚相中加入40mL乙酸-濃鹽酸(9/1，v/v)，加入8g鋅粉(分多次緩慢加入)，將混合物攪拌回流反應(yīng)45min，生成黃色反應(yīng)物；冷卻后過濾去除沉淀,用氯仿洗滌沉淀，合并濾液后用25mL蒸餾水洗滌，棄去上層水相，氯仿層用無水硫酸鈉干燥過夜；過濾后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓下除去溶劑，得到橙紅色油狀物即為氨基對(duì)硫酸粗品，上述粗品中加入2%鹽酸，調(diào)節(jié)pH為1-2，除去不溶物；該混合物用己烷萃取2次，每次10mL，棄去己烷層，水層中加入10%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH為10 11時(shí)，出現(xiàn)桔紅色油狀物，再用CHCl3萃取2次，每次10mL，分出保留CHCl3層，加無水硫酸鈉干燥過夜，減壓蒸餾得到桔紅色油狀物。
3.一種用于對(duì)硫磷快速檢測(cè)的直接包被ELISA檢測(cè)方法，具體步驟如下: .0.0lmol L_1 pH9.6碳酸鹽緩沖液將戊二醛稀釋成6%，加入到中度吸附微孔板中，每孔100 μ L，37°C孵育2h ;去離子水洗滌3次，每次200 μ L ；80mmol L-1 ρΗ8.0PBS緩沖液將氨基化對(duì)硫磷稀釋成適當(dāng)濃度加入到微孔板中，37°C孵育2h ;PBST洗滌后，加含1%甘氨酸的0.0lmol/LPB封閉溶液，37°C反應(yīng)Ih除去戊二醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上剩余的醛基；洗滌后干燥保存； 洗滌后，加入含1 % BSA的PB稀釋的50 μ L抗對(duì)硫磷抗體以及50 μ L標(biāo)準(zhǔn)溶液(100，.20,4,0.8,0.16，0.032,0.0064,0.00128,0.000256，O μ g mL-1)，37。。反應(yīng) 1.5h ;充分洗滌后，每孔加入100 μ L酶標(biāo)二抗(0.0lmol L-1PBS, pH 7.4含有適當(dāng)濃度的BSA)，37°C孵育.45min ;洗滌6次后，加入100 μ L底物37°C反應(yīng)IOmin ;加入H2SO4 (2mol L-1,50μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處吸光值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)硫磷的快速檢測(cè)方法，屬于生物檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明首先將對(duì)硫磷進(jìn)行氨基化改造，使用戊二醛溶液處理聚苯乙烯微孔板，使微孔板表面產(chǎn)生帶有醛基的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，利用醛基與氨基對(duì)硫磷的氨基反應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián)，從而完成氨基對(duì)硫磷的直接包被。通過對(duì)戊二醛濃度、氨基化對(duì)硫磷濃度、封閉條件等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種氨基化對(duì)硫磷直接包被ELISA用于檢測(cè)對(duì)硫磷。與常規(guī)ELISA相比，氨基化對(duì)硫磷直接包被ELISA具有較高的靈敏度，通過實(shí)際樣品加標(biāo)回收分析，氨基化對(duì)硫磷直接包被ELISA表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性(CV為3.21％～6.32％)和精確度(回收率為83％-116.6％)，該方法相比傳統(tǒng)包被完全抗原的ELISA方法相比，更簡(jiǎn)單快速，該方法可以用于研制快速檢測(cè)對(duì)硫磷殘留的免疫速測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/543GK103172660SQ20111044063
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者高志賢, 彭媛, 寧保安, 賽娜, 白家磊, 孫思明 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所