專利名稱：一種測(cè)定痕量曲普瑞林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定痕量曲普瑞林的方法。
背景技術(shù)：
曲普瑞林是人工合成的十肽，為促性腺激素釋放激素(GnRH)的類似物。其結(jié)構(gòu)的改良是將天然分子結(jié)構(gòu)中的第六個(gè)左旋氨基酸(甘氨酸)，以右旋色氨酸取代。曲普瑞林作用與GnRH相同，但其血漿半衰期延長(zhǎng)且對(duì)GnRH受體的親和力更強(qiáng)，因此曲普瑞林成為GnRH受體的強(qiáng)力激動(dòng)劑。曲普瑞林注射后，最初會(huì)刺激垂體分泌促性腺激素(Gn)，即黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)。當(dāng)垂體經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的刺激后會(huì)進(jìn)入不應(yīng)期，促性腺激素的釋放會(huì)減少，因而使性類固醇(睪丸酮或雌激素)降低至去勢(shì)水平。上述作用是可逆轉(zhuǎn)的。臨床上曲普瑞林被用于治療各種激素依賴性疾病如前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位、子宮肌瘤和性早熟。曲普瑞林已上市的產(chǎn)品主要有注射劑和長(zhǎng)效緩釋微球制劑，曲普瑞林臨床常用劑量:每天一次皮下注射0.5毫克，連續(xù)七天，然后每天一次皮下注射0.1毫克，作為維持劑量；體外授精術(shù)(IVF)每天一次皮下注射0.5毫克，七至十天，然后每天一次皮下注射0.1毫克。曲普瑞林臨床應(yīng)用的不良反應(yīng)是由于激素的產(chǎn)生被抑制而可能引起的藥理副作用，因此臨床治療時(shí)應(yīng)密切監(jiān)測(cè)性類固醇血漿水平。曲普瑞林臨床極低的用量，就可能引起極強(qiáng)的臨床不良反應(yīng)，這些情況都迫切需要建立一種操作簡(jiǎn)單，特異性好及高靈敏的痕量曲普瑞林檢測(cè)技術(shù)，目前血漿及排泄物等生物樣品中痕量曲普瑞林的檢測(cè)是利用放射免疫法進(jìn)行測(cè)定，由于它測(cè)定的是蛋白多肽的特異性片段，樣品中其他有抗原決定簇的代謝片段或者曲普瑞林的自身降解產(chǎn)物也能和免疫試劑反應(yīng)，增加結(jié)果誤差，并且其具有放射性，對(duì)檢測(cè)人員有潛在的傷害可能；且其試劑盒非常昂貴，必須配備高級(jí)儀器設(shè)備，不適合臨床及科研使用。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，本發(fā)明人進(jìn)行深入研究，提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高的痕量曲普瑞林的測(cè)定方法。所述方法采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，其高效液相的流動(dòng)相采用含酸的水溶液-甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫，所述酸為乙酸或丙酸，優(yōu)選為乙酸；酸的體積百分濃度0.01-0.1%，優(yōu)選為0.01-0.05%，更優(yōu)選為0.02%。所述體積百分濃度為IOOml水中所含酸的體積(ml)數(shù)。在液質(zhì)聯(lián)用方法中，液相色譜流動(dòng)相的選擇具有非常重要的作用。本發(fā)明所述流動(dòng)相的有機(jī)相選擇甲醇，相比乙腈等其他有機(jī)溶劑，甲醇在測(cè)定痕量曲普瑞林時(shí)有更高的響應(yīng)值和較好的色譜行為；流動(dòng)相的水相中添加酸可明顯提高方法的靈敏度，其中添加乙酸或丙酸比甲酸等其他酸，可以顯著提高檢測(cè)限近十倍。所述檢測(cè)限是指在樣品中能檢出的被測(cè)組分的最低濃度(量)，即產(chǎn)生信號(hào)(峰高)為基線噪音標(biāo)準(zhǔn)差k倍時(shí)的樣品濃度，一般將檢測(cè)限定義為信噪比(S/N) 3: I時(shí)的濃度。所述梯度洗脫含酸水溶液和甲醇的體積比具體如下表，其中第三時(shí)間段可省略，但優(yōu)選含有第三時(shí)間段，可減少連續(xù)進(jìn)樣后柱壓升高和噪音。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定痕量曲普瑞林的方法，其特征在于采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，高效液相的流動(dòng)相采用含酸的水溶液-甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫，所述酸為乙酸或丙酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酸的體積百分濃度為0.01-0.1 %。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于酸的體積百分濃度為0.01% -0.05%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于酸的體積百分濃度為0.02%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在酸為乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于高效液相色譜梯度洗脫為，第一時(shí)間段含酸的水溶液A與甲醇B的體積比為75-95: 25-5;第二時(shí)間段A與B的體積比為30-50: 70-50 ;第三時(shí)間段A與B體積比為0_10: 100-90 ;第四時(shí)間段A與B的體積比為 75-95: 25-5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于省略第三時(shí)間段。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于第一時(shí)間段A與B的體積比為90: 10;第二時(shí)間段A與B的體積比為40: 60;第三時(shí)間段A與B的體積比為2: 98;第四時(shí)間段A與B的體積比為90: 10。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，用于哺乳動(dòng)物在使用曲普瑞林制劑后，檢測(cè)體內(nèi)曲普瑞林的含量變化及代謝研究的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測(cè)定痕量曲普瑞林的方法，采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣品中痕量曲普瑞林進(jìn)行測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高。本發(fā)明還涉及所述測(cè)定方法用于定性或定量檢測(cè)生物樣品中的曲普瑞林的含量及其曲普瑞林制劑藥代動(dòng)力學(xué)研究的用途。
文檔編號(hào)G01N30/06GK103163258SQ201110409108
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者韓江彬, 沙春潔, 宋濤, 王濤, 孫考祥, 劉萬(wàn)卉 申請(qǐng)人:山東綠葉制藥有限公司