專利名稱：：固相多肽合成曲普瑞林的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及曲普瑞林的制備方法，尤其涉及固相多肽合成曲普瑞林的制備方法。
背景技術(shù)：
：中文名曲普瑞林，醋酸曲普瑞林，英文名Triptorelin，TriptorelinAcetate結(jié)構(gòu)式pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，分子式C64H82N18Ol3分子量1311.5曲普瑞林臨床用于治療相關(guān)性激素病癥，包括晚期前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位、中樞性性早熟癥等。曲普瑞林是一種促性腺激素釋放激素類似物，主要作用于垂體前葉，大劑量應(yīng)用初期可以引起一過性黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)釋放增多，后期則導(dǎo)致垂體敏感性降低，使LH、FSH和性激素分泌減少。醋酸曲普瑞林用于治療相關(guān)性激素病癥，包括晚期前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位、中樞性性早熟癥。1974年日本武田化工的FujinoMasahiko等人首先發(fā)明促黃體激素釋放激素的十肽酰胺類似物的合成工藝。并在日本、德國(guó)、美國(guó)等國(guó)家申請(qǐng)專利，專利號(hào)分別為JP19740027442、DE2446005、US4008209(液相法)。目前的方法均存在著一定的缺陷，每一輪脫帽須用三氟醋酸，故接肽收率低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本較高；三廢污染多，并使用三氟醋酸進(jìn)行純化，污染環(huán)境，純化收率一般在25%以下。因此目前的方法限制了醋酸曲普瑞林的大規(guī)模生產(chǎn)和使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相多肽合成曲普瑞林的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)以.RinkAmideAM樹脂或.RinkAmideMBHA樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；(2)切肽，獲得粗品；(3)粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，凍干后，制得曲普瑞林精品。按照本發(fā)明，所說的依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的方法，包括如下步驟(1)制備Fmoc-Gly-樹脂取所說的樹脂用DMF浸泡0.52小時(shí)，使樹脂充分溶脹，抽干，然后加入溶解于接肽試劑的Fpioc-Gly-OH(FW:297.3)、TBTU/HBTU(FW:321)和HOBt(FW:153，)的混合物，106(TC反應(yīng)0.54小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，106(TC反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干。所說的樹脂取代量為0.5-1.lmmol/g;所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:5~15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比，下同；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；HOBt的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g;(2)制備Fmoc-Pro-Gly-樹脂在步驟(1)的Fmoc-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，10~60"反應(yīng)5~60分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，然后加入溶解于接肽試劑的Fmoc-Pro-OH(FW:337.4)、TBTU/HBTU(FW:321)、HOBT(FW:153,)的混合物，1060。C反應(yīng)0.5-1.5小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Pro-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，106(TC反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗漆，抽干。所說的樹脂取代量為0.5-1.lmmol/g;所說的接肽試劑為NMM:DMF-1:5~15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比，下同；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；HOBT=的摩爾數(shù)為樹脂的26倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g;(3)制備Fmoc-Arg(Pbl)-Pro-Gly-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，1060。C反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW:648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060。C反應(yīng)0.5-4小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的26倍。HOBT摩爾數(shù)為樹脂的26倍；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；(4)制備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(3)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，10-60。C反應(yīng)5~60分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Leu-OH(FW:321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060。C反應(yīng)0.54小時(shí)，抽干，.分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(4)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106(TC反應(yīng)5~60分鐘，抽千，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Trp-OH(FW:354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，106(TC反應(yīng)0.5~4小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-D-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Tyr(tBu)-D陽(yáng)Trp-Leu-Arg(Pbf)隱Pro-Gly-樹脂在歩驟(5)的Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，10~60°。反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW:459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060。C反應(yīng)0.5-4小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(P的-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5-20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(但u)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106(TC反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW:383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10~60°C反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)隱D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(7)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106℃反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Trp-OH(FW:426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，106(TC反應(yīng)0.5-4小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為520ml/g;Fmoc-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(9)制備Fmoc-His(Trt)-T卬-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(8)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，106(TC反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW:619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，1060'C反應(yīng)0.54小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)墨Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的26倍。Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(10)制備pGlu-His(Trt)國(guó)Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(9)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Tip-Leu-Arg(PbO-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，1060。C反應(yīng)560分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的pGlu-OH(FW:129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10-60。C反應(yīng)0.54小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽千，獲得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)國(guó)Tyr(tBu)-D-Trp國(guó)Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;pGlu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上。按照本發(fā)明，所說的切肽包括如下步驟將上述步驟(10)所獲得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加入預(yù)冷至010'C的切肽試劑中，203(TC反應(yīng)1~3小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，真空干燥，獲得切肽后的粗品；所說的切肽試劑為TFA/EDT/H20/TIS=800680ml/3518ml/3518ml/l03.6ml;按照本發(fā)明，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下歩驟將曲普瑞林粗品溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18(或C8)柱純化，流速為100-650ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品，總收率25.4(以樹脂的60mmo1計(jì))。乙酸的重量濃度為0.5~10%，乙酸中曲普瑞林粗品的重量濃度為150%;流動(dòng)相為0.11M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸乙腈=96:14;本發(fā)明的曲普瑞林工藝路線有下列特點(diǎn)，具備規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，三廢少，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，接肽收率高(每步接肽收率為》98%)，降低了成本，采用切肽試劑(TFA/EDT/H20/TIS)進(jìn)行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱進(jìn)行分離純化，避免使用TFA(三氟醋酸)進(jìn)行純化，減少三廢，純化收率高達(dá)25%以上，每步接肽收率均在98%以上；切肽后收率為78.8%，總收率為25.4%。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1實(shí)施例和前述過程中所采用的原料列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實(shí)施例中接肽試劑為NMM:DMF=1:10，體積比;脫帽試劑為PIP:DMF=1:3.5，體積比；合成肽鏈制備Fmoc-Gly-樹脂1)取75g樹脂(0.8mmol/g樹脂，60mmol)，用1000mlDMF浸泡1小時(shí)，使樹脂充分溶脹，抽干。2)取71g(FW:297.3240mmo1)Fmoc-Gly-OH、77.lg(FW:321,240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。3)抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗漆三次，抽干。制備Fmoc-Pro-Gly-樹脂1)加1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。2)取81g(FW:337.4,240mmo1)Fmoc-Pro-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。3)抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。制備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂1)加1000ml脫帽試齊U，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。2)加入155.7g(FW:648.8，240mmo1)Fmoc-Arg(Pbf)-OH、77.1g(FW:321，240纖o1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。3)抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。制備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。力卩84.9g(FW:354,240mmo1)Fmoc國(guó)Leu-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25。C反應(yīng)l小時(shí)。其余操作同上。制備Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加lOOOml脫帽試齊U，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。加84.9g(FW:354,240mmo1)Fmoc-D-lYp-OH、77.1g(FW:426.5，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。其余操作同上。制備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。加110.4g(FW:459.5，240匪o1)Fmoc-Tyr(tBu)-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25。C反應(yīng)1小時(shí)。其余操作同上。制備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。加92.1g(FW:383.4，240mmo1)Fmoc-Ser(tBu)-OH、77.1g(FW:321,240mmol)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240腿o1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。制備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂力口1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。加126.3g(FW:426.5，240畫o1)Fmoc-Trp-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153，240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。其余操作同上。制備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。加148.7g(FW:619.7,240腿o1)Fmoc-His(Trt)-OH、77.1g(FW:321，240謹(jǐn)o1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25。C反應(yīng)l小時(shí)。加入1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)10分鐘。制備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂加1000ml脫帽試劑，25。C反應(yīng)15分鐘，抽干，分別用DMF、無(wú)水乙醇和DMF各洗滌三次，抽干。加30.9g(FW:129,240mmo1)pGlu-OH、77.1g(FW:321，240mmo1)TBTU/HBTU、36.6g(FW:153,240mmo1)HOBT，用750ml接肽試劑溶解，加入反應(yīng)容器，25'C反應(yīng)1小時(shí)。切肽將保護(hù)十肽轉(zhuǎn)移至1000ml反應(yīng)器中，加入事先配制好并預(yù)冷至約5'C的試劑(TFA/EDT/H2O/TIS=680ml/18ml/18ml/3.6ml),25。C攪拌2小時(shí)。減壓除溶劑至小體積，加入1000ml冷乙醚沉淀，離心收集，用無(wú)水乙醚洗后，真空干燥。得曲普瑞林粗品62g(47.3mrno1)，收率78.8%。分離純化-將曲普瑞林粗品溶于5%乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18柱純化，流動(dòng)相0.1MNH4Ac:乙腈(7.5:2.5，體積比)；流速為500ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的^[出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，約得20g白色塊狀物成品(MW:131L5，15.25mmo1),總收率25.4%(以樹脂的60mmo1計(jì))。權(quán)利要求1.固相多肽合成曲普瑞林的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)以.RinkAmideAM樹脂或.RinkAmideMBHA樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)；(2)切肽，獲得粗品；(3)粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，凍干后，制得曲普瑞林精品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)的方法，包括如下歩驟(1)制備Fmoc-Gly-樹脂取所說的樹脂用DMF浸泡，使樹脂溶脹，抽干，然后加入溶解于接肽試劑的Fmoc-Gly-OH(FW:297.3)、TBTU/HBTU(FW:32I)和HOBt(FW:153，)的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干；所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:5~15，體積比，下同；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比，下同；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；HOBt的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-Gly-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g;(2)制備Fmoc-Pro-Gly-樹脂在歩驟(1)的Fmoc-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，然后加入溶解于接肽試劑的Fmoc-Pro-OH(FW:337.4)、TBTU/HBTU(FW:321)、'HOBT(FW:153,)的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Pro-Gly-樹脂；加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干。所說的接肽試劑為NMM:DMF=1:5~15，體積比；所說的脫帽試劑為PIP:DMF=1:2~5，體積比；混合物中樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；HOBT=的摩爾數(shù)為樹脂的26倍；Fmoc-Pro-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g;(3)制備Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(2)的Fmoc-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(FW:648.8)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;TBTU/HBTU的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。HOBT摩爾數(shù)為樹脂的26倍；Fmoc-Arg(Pbf)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；(4)制備Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(3)的Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，203(TC反應(yīng)5~30分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Leu-OH(FW:321)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，203(TC反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Leu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍。Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(5)制備Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(4)的Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，2030。C反應(yīng)5~30分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-D-Trp-OH(FW:354)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，203(TC反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(PW)-Pro-Gly-樹脂；混合物中-Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-D-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(6)制備Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(5)的Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，20~30"反應(yīng)5~30分鐘，抽干，分別用DMF和乙醇洗漆，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Tyr(tBu)-OH(FW:459.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，2030。C反應(yīng)0.5~1.5小時(shí)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Tyr(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(7)制備Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(6)的Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Ser(tBu)-OH(FW:383.4)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂；混合物中Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(PbO-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Ser(tBu)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(8)制備Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(PbO-Pro-Gly-樹脂在步驟(7)的Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-Trp-OH(FW:426.5)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly隱樹月旨；混合物中Fmoc-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-Trp-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-SerOBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(9)制備Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)隱Pro-Gly-樹脂在步驟(8)的Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，力口入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的Fmoc-His(Trt)-OH(FW:619.7)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly陽(yáng)樹脂；混合物中Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;Fmoc-His(Trt)-OH的摩爾數(shù)為樹脂的26倍；Fmoc-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為520ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上；(10)制備pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-T卬-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂在步驟(9)的Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp陽(yáng)Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂中，加入脫帽試劑，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，加入用接肽試劑溶解的pGlu-OH(FW:129)、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反應(yīng)，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)匿Pro-Gly陽(yáng)樹脂；混合物中Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂重量體積濃度為5~20ml/g;pGlu-OH的摩爾數(shù)為樹脂的2~6倍；Fmoc-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-Pro-Gly-樹脂的重量與脫帽試劑的加入量的比例為5~20ml/g脫帽試劑；其余操作以及工藝條件同上。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所說的切肽包括如下步驟將權(quán)利要求2步驟(IO)所獲得的pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Trp-Leu-Arg(Pbf)-1"0-0^-樹脂加入預(yù)冷至0~10^的切肽試劑中，反應(yīng)，收集切肽后的粗品；所說的切肽試劑為TFA/EDT/H20/TIS=800680ml/3518ml/3518ml/l03.6ml。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化分離純化的方法包括如下步驟將曲普瑞林粗品溶于乙酸中，過濾，濾液經(jīng)C18(或C8)柱純化，流速為100-650ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm;用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，凍干，獲得成品，總收率25.4(以樹脂的60mmo1計(jì))；流動(dòng)相為0.11M醋酸鹽或磷酸鹽或三氟乙酸乙腈=96:14。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，乙酸的重量濃度為0.5~10%，乙酸中曲普瑞林粗品的重量濃度為1~50%。6.根據(jù)權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，脫帽反應(yīng)溫度為10~60°C，反應(yīng)時(shí)間為530分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，接肽反應(yīng)溫度為10~60°C，反應(yīng)時(shí)間為0.5-1.5小時(shí)。8.根據(jù)權(quán)利要求15任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，切肽溫度為10~60°C，時(shí)間為1~6小時(shí)。全文摘要本發(fā)明公開了一種固相多肽合成曲普瑞林的制備方法，包括如下步驟以.RinkAmideAM樹脂或.RinkAmideMBHA樹脂起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，獲得保護(hù)十肽樹脂，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，獲得粗品，粗品經(jīng)C18(或C8)柱分離純化，凍干后，制得曲普瑞林精品。本發(fā)明的方法，工藝穩(wěn)定，原輔材料來源方便，生產(chǎn)周期短，收率高，質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，接肽收率高，避免使用氟化氫等劇毒試劑，三廢污染少，純化收率高達(dá)25％以上，每步接肽收率均在98％以上；切肽后收率為78.8％，總收率為25.4％。文檔編號(hào)C07K7/06GK101357936SQ200710044419公開日2009年2月4日申請(qǐng)日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者周逸明,頎崔申請(qǐng)人:崔頎;周逸明;上海蘇豪逸明制藥有限公司