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一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法

文檔序號:6024486閱讀:1338來源:國知局
專利名稱:一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種利用圖案化表面對生物樣品進行一步富集和除鹽凈化的處理方法,這種圖案化表面可以被廣泛地應(yīng)用于生物樣品的預(yù)處理及檢測。
背景技術(shù)
基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF MS)是一種有效的軟電離方法,具有很高的靈敏度,適用于蛋白質(zhì)組學中生物樣品的分析檢測。但是,在質(zhì)譜分析過程中,由于樣品沉積面積的不可控制以及基質(zhì)和樣品不均勻的共結(jié)晶會降低質(zhì)譜分析的檢測靈敏度及重現(xiàn)性。另外,生物樣品中存在的鹽及其它的一些試劑也會嚴重地干擾樣品和基質(zhì)的結(jié)晶,導(dǎo)致質(zhì)譜信號微弱甚至淬滅質(zhì)譜信號。因此,利用合適的樣品預(yù)處理方法來富集和除鹽凈化對于MALDI分析和檢測是非常重要的。一些離線方法如HPLC,ZipTipC18以及一些功能化的納米粒子都被用于預(yù)先分離復(fù)雜的生物樣品。雖然樣品得到純化,但是由于其復(fù)雜的操作過程就不可避免會造成樣品損失以及污染物的引進。為了克服離線方法的不足,在線樣品富集及除鹽的方法引起了廣泛的關(guān)注。近幾年,科學家利用旋涂或滴涂的方法將疏水聚合物如聚四氟乙烯、石蠟、尼龍等修飾在 MALDI 的樣品板上(J. Mass Spectrom. 2002,37,512 ;Anal. Chem. 1997,69,4716 ; Anal.Biochem. 2004,327,222 ;Anal. Chem. 1998,70,750 J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5,230)。在進行水洗除鹽的時候由于鹽與疏水聚合物的作用力很弱,鹽會被溶解在水中而被除掉,但是額外的水洗步驟則會導(dǎo)致不可避免的樣品損失,同時也不利于高通量的質(zhì)譜檢測。2007年,Jia首次利用大量的基質(zhì)溶液推洗污染物的方法來實現(xiàn)免于水洗的在線樣品富集及除鹽(Proteomics 2007,7,2497 ;中國專利,公開號:CN1811407A) 0但是這種方法需要大量基質(zhì)溶液排鹽,會導(dǎo)致部分分析物損失;另外,這種方法還需要嚴格控制樣品溶液的沉積體積。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供一種操作簡單快速、高靈敏度、高通量的一步樣品除鹽和富集的新方法。具體涉及在基底(硅,玻璃,石英等)上構(gòu)筑具有疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的封閉(環(huán)形或方形)圖案化表面,使多肽或蛋白樣品實現(xiàn)簡單快速地靶上在線免水洗除鹽和同步富集,避免了樣品的損失,并進行MALDI-TOF MS的分析和檢測的新方法。本發(fā)明提出的利用疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的封閉圖案化表面對生物樣品進行在線免水洗除鹽和同步富集的方法,具體的步驟如下1、在基底上構(gòu)筑疏水-親水-疏水區(qū)域的封閉圖案化表面;2、將1 5μ L多肽或蛋白溶液滴在上述步驟制備的圖案化表面上,在室溫下自然晾干,從而得到干燥的樣品點;在自然晾干的過程中,由于圖案化表面的中央疏水區(qū)域?qū)Φ鞍谆蚨嚯挠泻軓姷氖杷嗷プ饔枚鴮o機鹽等污染物的吸附很弱,從而使無機鹽等污染物被大部分轉(zhuǎn)移到親水區(qū)域,而多肽或蛋白則被吸附到中央疏水區(qū)域;3、將1 5yL、5 20mg/ml的基質(zhì)溶液(溶質(zhì)為芥子酸、2-氰基-4-羥基肉桂酸或2,5-二羥基苯甲酸,溶劑為乙腈與三氟乙酸水溶液等體積混合,三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的體積分數(shù)為0. 1% )滴在上述干燥的樣品點上,室溫下自然晾干后,在圖案化表面上形成樣品和基質(zhì)均勻的共結(jié)晶;在此過程中,少部分殘留在中央疏水區(qū)域的無機鹽等污染物會重新溶解在水溶液里,從而被進一步帶到親水區(qū)域,而蛋白或多肽仍能保留在中央疏水區(qū)域;4、無需額外的水洗除鹽步驟也無需過量的基質(zhì)溶液除鹽,將上述步驟富集除鹽后的樣品直接進行MALDI-TOF MS的分析和檢測。上述方法中,步驟1中構(gòu)筑的疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的封閉圖案化表面的具體方法,包括如下幾個步驟A.選取基底,對基底進行清潔及親水化處理;B.在基底上構(gòu)筑厚度0.2 200 μ m、半徑250 IOOOym的聚合物涂層(聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)或光刻膠等);C.以步驟B構(gòu)筑的聚合物涂層為擋層,在擋層以外的基底上修飾含氟單分子層 (十七氟癸基三甲氧基硅烷、十三氟辛基三甲氧基硅烷等)或蒸鍍金屬層(金或銀)作為疏水層,其厚度為20 200nm;D.將步驟C得到的基底浸入有機溶劑中進行超聲處理除去聚合物擋層,隨后用水超聲除去基底上殘留的有機溶劑,從而在基底上形成半徑250 1000 μ m的空白親水區(qū)域;E.在步驟D得到的基底的空白親水區(qū)域中央制備厚度0.2 200 μ m、半徑10 500 μ m的聚合物層(PMMA、PS或其他疏水聚合物)或金屬層(金、銀),作為中央疏水區(qū)域, 從而在基底上得到疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的封閉圖案化表面。基底(如硅片、玻璃片、石英片等)的清潔處理和親水化處理主要有兩種方法,第一種方法是首先用氧等離子體系統(tǒng)對基底表面進行處理,目的是除去表面殘留有機物并使表面羥基化,成為親水表面,氧氣流速60 140ml/min,功率100 300W,處理時間1 IOmin ;再用高純水對基底表面超聲清洗2 3次,每次時間為2 5min,使表面徹底清潔并羥基化;第二種方法是在體積比為NH3 ·Η20 H2O2 H2O= (1 3) (1 3) (3 8)的溶液中,在50 90°C的溫度下將基底浸泡30 90min,然后在功率為40 100W超聲清洗儀中清洗2 5min,再用高純水超聲清洗2 3次,每次時間為2 5min,使表面徹底清潔并羥基化。步驟B和E中對于疏水層的制備可以利用毛細管滴涂和蘸筆技術(shù)、光刻技術(shù)、遮擋板蒸鍍金屬技術(shù)或紅外激光精確定位打孔粘性膜技術(shù)完成。(1)毛細管滴涂和蘸筆技術(shù)是用毛細管或聚二甲基硅氧烷(PDMS)蘸取一定濃度的聚合物(PMMA或PS,2. 5 7. 5(wt%), 溶于二甲苯溶液)溶液,然后接觸并滴涂在基底上;( 光刻技術(shù)則是采用旋涂的方法將光刻膠旋涂于處理過的基底上,旋涂速度為1000 SOOOrpm,然后置于光刻掩膜板下,在 390nm的紫外光下曝光20s 5min后用相應(yīng)的顯影液洗脫后,從而構(gòu)筑出有序結(jié)構(gòu)的基底; (3)遮擋板蒸鍍金屬技術(shù),即利用具有孔洞的金屬擋板覆蓋在基底上進行蒸鍍,孔洞處就能被蒸鍍,其他地方則不能;(4)紅外激光精確定位打孔粘性膜技術(shù)是利用紅外激光在厚度為30 50 μ m的聚乙烯酰亞胺膜(Kapton膜)上精確的留下所需半徑Q50 1000 μ m或是10 500 μ m)的小孔,并將其粘在基底上,將0. 1 1 μ L的聚合物溶液滴在小孔內(nèi),待溶劑蒸發(fā)后,將聚乙烯酰亞胺粘性膜揭去,形成均勻的疏水聚合物圖層陣列。步驟C中疏水層的構(gòu)筑主要有以下兩種方法第一種方法是利用含氟的硅烷化試劑(十七氟癸基三甲氧基硅烷、十三氟辛基三甲氧基硅烷等)在步驟B所形成的擋層以外的親水化基底表面上進行單層膜組裝生長,具體制備方法如下將具有聚合物擋層的基底表面(親水化處理過)貼在干凈的上表面皿,用移液槍吸取1 5μ L的含氟的硅烷化試劑滴于下表面皿,扣上上表面皿,在100 250°C下加熱生長1 5個小時,從而在基底上得到疏水層;第二種是利用遮擋板蒸鍍技術(shù)在擋層以外的基底表面(親水化處理過)上進行金屬(金和銀)的蒸鍍,從而在基底上得到疏水層;本發(fā)明可以非常有效地一步實現(xiàn)樣品的除鹽和富集的效果,無需洗脫和額外的水洗步驟,也無需過量的基質(zhì)溶液。本發(fā)明所采用的圖案化表面具有不同的親疏水區(qū)域,首先當多肽或蛋白溶液沉積在此表面上時,由于最外圈的疏水層的存在,會將樣品溶液有效地局限在該疏水層形成的環(huán)形區(qū)域里,起到富集的作用。在溶劑蒸發(fā)的過程中,對于含鹽樣品,由于圖案化表面的中央疏水區(qū)域?qū)Φ鞍谆蚨嚯挠泻軓姷氖杷嗷プ饔?,從而使無機鹽等和樣品會被分別地轉(zhuǎn)移到兩疏水區(qū)域中間的環(huán)形親水區(qū)域和中央疏水區(qū)域,達到樣品除鹽凈化的目的。本發(fā)明中由于樣品在制備的基底上的沉積面積(約2mm2)小于傳統(tǒng)的不銹鋼靶板點樣(約20mm2)的方法,所以樣品與基質(zhì)容易形成更加細小、均勻的共結(jié)晶,在激光的激發(fā)下就會有更多的樣品分子被解析離子化,從而提高了 MALDI-TOF MS的靈敏度和重現(xiàn)性。利用本發(fā)明構(gòu)筑的圖案化表面,在MALDI-TOF MS檢測中,信噪比、靈敏度及耐鹽能力都有很顯著的提高。我們研究發(fā)現(xiàn),利用這種方法構(gòu)筑的疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的圖案化表面,具有很強的樣品富集及除鹽能力。如圖6所示,我們在傳統(tǒng)的不銹鋼靶板上測試血管緊張素III能夠得到其最低檢測限是IOfmol μ L—1,而在這種圖案化表面上所測試得到的最低檢測限是IOOattmol μ L—1,質(zhì)譜檢測的靈敏度提高了兩個數(shù)量級。另外,如圖7所示,即使樣品里含有很高濃度的鹽,例如氯化鈉(IM),碳酸氫銨(IOOmM),或尿素(IM),在圖案化的表面上由于鹽能夠有效地被排除,因此仍然能檢測到很好的質(zhì)譜信號。而在傳統(tǒng)的不銹鋼靶板上由于鹽會干擾到基質(zhì)和樣品的共結(jié)晶,所以檢測不到樣品信號。以上證實了這種疏水-親水-疏水相間的環(huán)形圖案化表面能有效地富集和除鹽凈化分析物樣品,具有很大的實際應(yīng)用價值。


圖1 本發(fā)明所述疏水-親水-疏水的環(huán)形圖案化表面的構(gòu)筑示意圖;圖2 含鹽樣品在圖案化表面上一步除鹽和富集方法流程示意圖;圖3 在高通量樣品載板上滴加溶液的顯微數(shù)碼照片;圖4 樣品和鹽在表面上選擇性分離的掃描電鏡照片及能譜圖;圖5 低濃度樣品在不銹鋼靶板上和圖案化表面上測試的質(zhì)譜圖;圖6 血管緊張素III在不銹鋼靶板上和圖案化表面上的最低檢測限;圖7 不同種類鹽的存在下樣品在不銹鋼靶板上和圖案化表面上測試的質(zhì)譜圖8 利用ZipTipC18純化含有不同種類鹽的樣品的質(zhì)譜圖;圖9 蛋白的酶解產(chǎn)物在不銹鋼靶板上和圖案化表面上測試的質(zhì)譜圖及所鑒定出的多肽的序列。圖中標號1為聚合物涂層,2為基底(硅片、石英片、玻璃片等),4為疏水含氟單分子層或金屬層,12為分析物(蛋白或多肽),13為無機鹽或污染物,14為基質(zhì),15為含無機鹽等污染物的樣品,16為滴加的基質(zhì)溶液;步驟3為以聚合物涂層為擋層在基底上進行疏水含氟單分子層或金屬層修飾,步驟5為在有機溶劑中超聲去除聚合物涂層,步驟6為在基底空白親水區(qū)域的中央進行疏水層修飾,步驟7為在圖案化表面滴加含鹽生物樣品,步驟8為含鹽生物樣品中溶劑的蒸發(fā),步驟9為在樣品表面滴加基質(zhì)溶液,步驟10為基質(zhì)溶液中溶劑的蒸發(fā),步驟11為進行MALDI-TOF MS檢測;圖1所示是疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的環(huán)形圖案化表面的構(gòu)筑示意圖。首先, 在清洗后的基底上用毛細管滴涂方法滴加PMMA的二甲苯溶液O. 5 7. 5% )),形成的PMMA斑點的半徑約為250 1000 μ m ;再以該PMMA點為擋層,在基底上組裝生長含氟的單分子層(步驟幻;然后在丙酮或氯仿等有機溶劑中超聲去除PMMA點(步驟幻,再在基底中心形成的空白區(qū)域滴涂PMMA的二甲苯溶液(步驟6),其半徑為10 500 μ m。如圖1所示,該含氟單分子層可以用金屬(金或銀等)代替;中間的PMMA疏水點可以用其他疏水材料(PS或光刻膠)代替。圖2所示實施例1所述的含鹽樣品在圖案化表面上一步除鹽和富集方法流程示意圖。利用圖1所得的基底,將含有鹽的樣品溶液沉積在基底上(步驟7),由于最外圈含氟疏水層的憎水性,樣品溶液會局限沉積在面積較小的環(huán)形區(qū)域從而改善了樣品在表面分散的均勻性;當溶劑蒸發(fā)時(步驟8),樣品中的鹽由于其水溶性會被富集在中間環(huán)形的親水的裸硅區(qū)域,而多肽或蛋白由于和中央疏水聚合物之間通過疏水-疏水相互作用被保留在中央的聚合物的表面上,實現(xiàn)了樣品的一步富集和除鹽。待溶劑揮發(fā)完全后,基質(zhì)溶液被滴加在疏水聚合物的表面(步驟9),原來少量遺留在中央的聚合物表面上的鹽又會重新的溶解從而被基質(zhì)帶到聚合物的外圍即中間親水的裸硅區(qū)域達到二次除鹽的目的。圖3所示實施例6所述的樣品溶液在高通量圖案化表面上的顯微數(shù)碼照片。通過顯微數(shù)碼照片可以看出當把樣品溶液滴加在基板上的時候,由于最外圈的含氟的單分子層具有很強的憎水性,使得樣品溶液收縮沉積在一個小的區(qū)域里,這就可以控制樣品沉積點的大小,也改善樣品在整個表面分布的均勻性。圖4所示實施例1所述的樣品富集、除鹽的掃描電鏡及能譜圖。A圖是樣品沉積在圖案化表面的基板上,在空氣中自然晾干后所得的掃面電鏡圖和外面結(jié)晶物質(zhì)的能譜圖。 通過掃描電鏡圖可以看出當溶劑蒸發(fā)完全后,樣品中的鹽被排除到中間親水的區(qū)域,通過能譜分析可以確定是樣品中排出來的鹽。B圖是當基質(zhì)溶液加入到中央的聚合物表面并自然晾干后,在聚合物的表面上可以清楚地看見基質(zhì)均勻的結(jié)晶,通過能譜分析證實是基質(zhì)的結(jié)晶。圖5所示實施例9所述的低濃度樣品在不銹鋼靶板上和圖案化表面上測試所得的質(zhì)譜圖。A圖和C圖是多肽混合物(血管舒緩激肽-M1,血管緊張素II-M2和血管緊張素 III-M3)和溶菌酶蛋白在不銹鋼靶板上所得的質(zhì)譜圖,可以看出樣品的信號很弱甚至無法檢測到信號。B圖和D圖是在圖案化表面上所得的質(zhì)譜圖,可以看出樣品的信號被顯著地增強,并且信噪比有十分明顯地提高。說明圖案化表面具有很好的樣品富集效果。本發(fā)明所示的方法能把質(zhì)譜檢測的靈敏度提高兩個數(shù)量級。以血管緊張素III 的檢測為例,如圖6所示實施例10所述的在傳統(tǒng)的不銹鋼靶板上所得到的最低檢測限是 IOfmol μ L—1,而在這種圖案化表面上所得到的最低檢測限是IOOattmol μ L—1。通過對比A 圖(不銹鋼靶板)和B圖(圖案化表面)上測試血管緊張素III所得的最低檢測限,可以說明圖案化的表面對樣品的富集作用更有利于痕量樣品的檢測。圖7所示實施例11所述的在不同種類鹽的存在下樣品在不銹鋼靶板上和圖案化表面上測試所得的質(zhì)譜圖。Α,C,E圖分別表示含有氯化鈉,碳酸氫銨或尿素的樣品在不銹鋼靶板上所得的質(zhì)譜圖,可以看出在不銹鋼靶板上,質(zhì)譜的信號被嚴重地抑制。這是因為當樣品中含有很高濃度的鹽,會嚴重影響基質(zhì)與樣品的結(jié)晶,降低質(zhì)譜測試的性能。B,D,F(xiàn) 圖分別表示在圖案化表面上所得的質(zhì)譜圖,可以看出在圖案化表面上能獲得很好的質(zhì)譜信號,主要是因為樣品中的鹽被有效排除。圖8所示實施例12所述的利用ZipTipC18純化含有不同種類鹽的樣品的質(zhì)譜圖。 通常質(zhì)譜分析前對含鹽的微量樣品采用ZipTipC18對其進行脫鹽。Α,B, C圖分別表示含有氯化鈉,碳酸氫銨或尿素的樣品利用ZipTipCw脫鹽后沉積在不銹鋼靶板上所得的質(zhì)譜圖。 通過ZipTipC18與圖案化表面兩種技術(shù)(如圖8和圖7所示)的對比,可以看出圖案化表面在除鹽性能方面比ZipTipCw更勝一籌,主要是因為ZipTipC18操作步驟復(fù)雜和離線除鹽會造成不可避免的樣品損失。圖9所示實施例13所述的蛋白的酶解產(chǎn)物在不銹鋼靶板上和圖案化表面上測試所得的質(zhì)譜圖。在蛋白質(zhì)組學中,通常樣品含量很低且含鹽濃度比較高。以肌紅蛋白酶解產(chǎn)物測試為例,A圖是在不銹鋼靶板上測試所得的質(zhì)譜圖,只有7個多肽能被檢測出來,而 B圖是在圖案化表面測試所得的質(zhì)譜圖,能夠檢測出14個多肽。表1中的Α,Β分別代表在傳統(tǒng)不銹鋼靶板上及圖案化表面上進行測試,*代表的是所能鑒定出的多肽序列,可以看出在圖案化表面上測試所得的整個序列的覆蓋率要遠遠高于在不銹鋼靶板上的。因此,可以將這種圖案化表面的基板應(yīng)用到蛋白質(zhì)組學分析。表1 從肌紅蛋白酶解產(chǎn)物中檢測到的多肽序列
權(quán)利要求
1.一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其步驟為1)在基底上構(gòu)筑疏水-親水-疏水區(qū)域的封閉圖案化表面;a)選取基底,對基底進行清潔及親水化處理;b)在基底上構(gòu)筑厚度0.2 200 μ m、半徑250 1000 μ m的聚合物涂層;c)以步驟B構(gòu)筑的聚合物涂層為擋層,在擋層以外的基底上修飾含氟單分子層或蒸鍍金屬層作為疏水層,其厚度為20 200nm ;d)將步驟C得到的基底浸入有機溶劑中進行超聲處理除去聚合物擋層,隨后用水超聲除去基底上殘留的有機溶劑,從而在基底上形成半徑250 1000 μ m的空白親水區(qū)域;e)在步驟D得到的基底的空白親水區(qū)域中央制備厚度0.2 200 μ m、半徑10 500 μ m 的聚合物層或金屬層,作為中央疏水區(qū)域,從而在基底上得到疏水-親水-疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)的封閉圖案化表面。2)將1 5μL多肽或蛋白溶液滴在上述步驟制備的圖案化表面上,在室溫下自然晾干,從而得到干燥的樣品點;3)將1 5yL、5 20mg/ml的基質(zhì)溶液滴在上述干燥的樣品點上,室溫下自然晾干后,在圖案化表面上形成樣品和基質(zhì)均勻的共結(jié)晶,從而實現(xiàn)對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理。
2.如權(quán)利要求1所述的一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其特征在于作為聚合物涂層的聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或光刻膠。
3.如權(quán)利要求1所述的一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其特征在于含氟單分子層為十七氟癸基三甲氧基硅烷或十三氟辛基三甲氧基硅烷的單分子層。
4.如權(quán)利要求1所述的一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其特征在于金屬層為金或銀層。
5.如權(quán)利要求1所述的一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其特征在于半徑10 500 μ m的聚合物層的聚合物為聚甲基丙烯酸甲酯或聚苯乙烯。
6.如權(quán)利要求1所述的一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其特征在于基質(zhì)溶液為芥子酸、2-氰基-4-羥基肉桂酸或2,5-二羥基苯甲酸的溶液,溶劑為乙腈和三氟乙酸水溶液等體積混合,三氟乙酸水溶液中三氟乙酸的質(zhì)量分數(shù)為0. 1%。
7.如權(quán)利要求1所述的一種對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理的方法,其特征在于基底為硅片、玻璃片或石英片。
全文摘要
本發(fā)明屬于生化分析技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種利用圖案化表面對生物樣品進行一步富集和除鹽凈化的處理方法,這種圖案化表面可以被廣泛地應(yīng)用于生物樣品的預(yù)處理及檢測。其步驟為在基底上構(gòu)筑疏水-親水-疏水區(qū)域的封閉圖案化表面;將多肽或蛋白溶液滴在上述步驟制備的圖案化表面上,在室溫下自然晾干,從而得到干燥的樣品點;將基質(zhì)溶液滴在上述干燥的樣品點上,室溫下自然晾干后,在圖案化表面上形成樣品和基質(zhì)均勻的共結(jié)晶,從而實現(xiàn)對生物樣品進行富集和除鹽凈化處理。利用本發(fā)明構(gòu)筑的圖案化表面,在MALDI-TOF MS檢測中,信噪比、靈敏度及耐鹽能力都有很顯著的提高,具有很大的實際應(yīng)用價值。
文檔編號G01N1/40GK102519779SQ20111040116
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者呂男, 國新華, 曾周芳, 王燕東 申請人:吉林大學
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