專利名稱：一種測定酶法脫毛液中總糖含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
脫毛工續(xù)是制革生產(chǎn)中必須進行的一步，但傳統(tǒng)的硫化物脫毛對環(huán)境污染嚴重。酶法脫毛可減少污染，但通常應(yīng)用的蛋白酶，對皮膠原本身造成相當?shù)膿p傷，所以，酶法脫毛必須嚴格控制其進程。脫毛液中糖含量是研究和控制酶法脫毛的一種重要手段。本發(fā)明采用硫酸-苯酚法測定其中羥基糖含量，采用乙酰丙酮法測定其中氨基糖含量，從而計算總糖含量。本發(fā)明應(yīng)用于皮革生產(chǎn)中。
背景技術(shù)：
制革工藝中的脫毛是通過物理、化學(xué)或者生物處理的方法使毛和表皮脫離真皮的過程。同時，生皮的膠原纖維間含有很多的可溶性蛋白和纖維間質(zhì)，干燥后，它們把纖維粘在一起，使生皮板硬，不耐彎折，因此，脫毛過程中還要去除這些纖維間質(zhì)，松散膠原纖維，為后續(xù)工藝創(chuàng)造良好條件。傳統(tǒng)的灰堿法脫毛，脫毛干凈、操作簡便、容易控制、質(zhì)量穩(wěn)定，且成本較低。但污染嚴重，脫毛是制革準備階段的主要污染源，約占整個準備階段的84% B0D,75% C0D,85%TDS,還有有毒的硫化物產(chǎn)生。為了減少灰堿法的污染，采用了酶法脫毛。酶脫毛作為一種生物法，無疑更符合當今世界環(huán)保的理念。早期的“發(fā)汗法”可能是最古老的酶脫毛技術(shù)。所謂“發(fā)汗法”就是利用附著在皮上的微生物菌株，在一定條件下，對動物皮組織進行作用，使毛和真皮的聯(lián)結(jié)松開，從而脫毛。本質(zhì)上是附在皮上的腐敗細菌發(fā)酵生長，所釋放出的酶產(chǎn)生了脫毛作用。澳大利亞細綿羊皮采用發(fā)汗法脫毛，可以保證貴重的羊毛不受損傷。后來的學(xué)者從發(fā)汗法脫毛的原料皮上分離到多種具有脫毛能力的菌株。如從澳大利亞細綿羊毛中分離出普通變形桿菌、無色桿菌、黃桿菌，具有脫毛能力。英國的原料皮上分離出普通變形桿菌；美國的原料皮分離的則是極毛桿菌。日本的農(nóng)田春和二見明分離出枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌。這些菌株發(fā)酵得到的酶制劑對羊皮脫毛能力良好。真正現(xiàn)代酶脫毛技術(shù)的創(chuàng)始人則是德國人R5hm，他于1908年發(fā)明了軟化酶Oropon, 1910年發(fā)明了酶脫毛工藝“Arazym Process”,其使用的酶是以動物胰臟為主的酶制劑，開創(chuàng)了現(xiàn)代酶技術(shù)在皮革中應(yīng)用的先河。該技術(shù)在美國用于山羊和小山羊皮的脫毛，直至1930s。二戰(zhàn)以后，隨著工業(yè)微生物生產(chǎn)技術(shù)的突破，大量來自于細菌、霉菌、放線菌的新型酶制劑出現(xiàn)，取代了來自動植物的酶制劑，酶脫毛再次受到重視。在此期間，Burton、Reed,美國東部地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心的Cordon、Bailey、Cooper,意大利的Simoncini,澳大利亞的Yates,德國的SchlSsser、Heidemann,蘇聯(lián)的色色金娜，以及印度和日本的學(xué)者，運用當時的生物知識、測試手段，對酶脫毛技術(shù)從工藝到原理進行了深入的研究，取得重大進展。但由于酶脫毛過程控制難、對皮損傷大、價格高等原因，到1970年后，第二次遭到冷落。值得一提的是，此時，由于特殊的原因，我國的酶脫毛技術(shù)曾經(jīng)紅火一時。
進入90年代，由于世界各國對環(huán)境保護的日益重視，生物技術(shù)的重大突破，酶脫毛技術(shù)第三次受到重視。最早用于皮革工業(yè)的酶制劑正是來自動物胰臟的胰酶，它是一種蛋白酶。早期的酶脫毛多用胰酶，德國、美國稱為“Arazym”，蘇聯(lián)則稱為“奧羅邦”，在山羊皮上取得一定效果，其它皮張效果不佳，粒面容易產(chǎn)生管皺和松面。也有從植物中提取蛋白酶來脫毛的。最早的是從木瓜(Carica papaya)中提取木瓜蛋白酶，具有一定的脫毛能力，但成本太高。1953年，印度的S. Bose等從Calotropisgigantea(—種巨大牛角瓜)提取植物蛋白酶“馬塔爾”乳液,從Eleusine coracana(—種蟋蟀草屬植物)提取淀粉酶“拉特然”乳液，用于脫毛，適用于印度小公牛皮、山羊皮。據(jù)報道，用植物提取液進行酶脫毛在印度至今仍有應(yīng)用。Rose、Chellan等于2004年在美國申請了相類似的專利。毫無疑問，脫毛用酶制劑的主要來源是微生物。細菌、霉菌、放線菌中都有一些菌株可產(chǎn)生具有脫毛能力的蛋白酶。早期報道的細菌有覃狀芽抱桿菌(Bacillus mycodies)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megatherium)、馬鈴薯芽抱桿菌(Bacillus mesentericus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)等。放線菌有白色鏈霉菌(St. albus)、抗生素鏈霉菌(St. antibioticus)、金色鏈霉菌(St. aureus)、灰色鏈霉菌(St. grseus)等。霉菌有黑曲霉(Asp. niger)、米曲霉(Asp. oryzae)、黃曲霉(Asp. f lavus)等。但是，蛋白酶脫毛的同時，不可避免會損傷真皮的結(jié)構(gòu)，影響皮制品的使用性能，這嚴重影響了酶脫毛的應(yīng)用。必須對酶脫毛的機理和過程進行深入的研究和嚴格的控制。自從酶用于皮的脫毛，人 們就開始研究酶脫毛的機理。從開始的組織切片、光學(xué)顯微鏡觀察，到后來的化學(xué)水平、電子顯微鏡觀察、生物技術(shù)的運用等，不斷深入，取得許多成果。但由于原皮結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、脫毛用酶的復(fù)雜性，所得結(jié)論比較分散，甚至相互矛盾。由于評判、測試困難，許多理論證據(jù)不夠充分，還有待進一步研究。酶脫毛達到的主要目的倒是基本公認的，S卩①毛和皮分離，從而去毛。②除去纖維間質(zhì)，松散真皮中膠原結(jié)構(gòu)，為后續(xù)工藝中各種試劑的滲透創(chuàng)造良好條件。整個酶脫毛過程涉及的幾個主要問題，如①酶作用于皮的哪一部分？作用于什么成份？②什么酶有作用？③用何種底物測定酶活，可以表征酶的脫毛能力？④酶是如何滲透到脫毛作用點的？⑤酶對皮的損傷是如何產(chǎn)生的？不同研究者存在著一定的分歧。芭芭金娜通過組織切片法，研究發(fā)現(xiàn)在酶脫毛過程中，毛囊中的毛根、馬氏層、乳頭層的肥大細胞等處的類粘蛋白逐漸被水解，致使毛、皮分離，牛羊皮的表皮層被溶解；同時，整個原皮中的類粘蛋白也被水解，膠原纖維得以松散[79]。Yates認為酶通過水解粘蛋白、類粘蛋白，破壞了真皮和表皮的連接,破壞了毛根和基膜的連接。透射電鏡研究表明，酶破壞了毛根、毛球和毛乳頭細胞之間的“橋粒”聯(lián)接，隨著“橋?！北淮蜷_，細胞相互分離，毛根鞘失去對毛根的包裹作用，毛球失去對毛乳頭的緊鉗作用，毛可以從毛囊中脫落出來。李志強教授最近研究發(fā)現(xiàn)，基膜及其周圍組織的蛋白提取物被廣泛水解，與脫毛有關(guān)。總之，酶脫毛過程中，有大量粘蛋白、類粘蛋白或者其它蛋白質(zhì)被水解，導(dǎo)致脫毛，酶溶液中總蛋白質(zhì)濃度增加，總蛋白質(zhì)濃度和脫毛進程直接相關(guān)。另一方面，由于粘蛋白有蛋白部分和粘多糖部分組成，粘蛋白被水解，除了蛋白質(zhì)脫落外，多糖部分也溶入酶液。所以，脫毛液中糖含量增加。芭芭金娜認為脫毛液中的還原糖含量和脫毛能力有關(guān)，糖含量越高，即脫毛能力越強[79]。Cordon則認為糖含量和脫毛進程不相適應(yīng)，證據(jù)不夠充分[83]。金寶仲等則認為兩者有聯(lián)系，但關(guān)系不很明確。而且，粘蛋白中粘多糖的水解，使膠原結(jié)構(gòu)得以松散，這一點是普遍承認的。Alexander認為糖含量可以作為反映膠原松散程度的指標?？傊话闱闆r下，脫毛溶液中的糖含量可以表征皮的松散程度指標，同時，也部分反映了整個脫毛進程。過去，主要是通過研究脫毛液中的蛋白質(zhì)變化情況，來研究脫毛機理，對脫毛液中糖的分析不夠重視，近年來對糖的分析逐漸多起來。糖和糖胺多糖的分析方法很多，包括光譜法、共振光散射法、圓二色性法、熒光法、高壓液相法、毛細管電泳法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法等。無疑，光譜法是簡單而最常用的方法，在皮革研究中，正是采用分光光度法來分析脫毛液中的糖含量。常用的比色法包括硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、硫酸-咔唑法、鄰甲苯胺法、3，5-二硝基水楊酸法等。但是，這些方法僅僅分析了其中的羥基糖部分，而對氨基糖部分均忽略了。其計算出來的總糖含量是不全面的，有偏差的。本發(fā)明采用新的方法來計算總糖含量。本研究綜合考慮了各個方面，認為分光光度法應(yīng)用于脫毛液中，切實可行、方便快捷。選擇了硫酸-苯酚法 和3，5-二硝基水楊酸法進行了研究。闡述了分析方法的適用性、穩(wěn)定性和操作要點。由于粘蛋白中的糖有一半是氨基糖，而上述比色方法均不能測定氨基糖，故用對2-氨基糖選擇性很強的乙酰丙酮法來測定氨基糖。幾種方法相結(jié)合，可以反映脫毛液中的糖含量，并能估算糖鏈的平均大小，可用于進一步研究酶法脫毛的機理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用硫酸-苯酚法來測定脫毛液中羥基糖含量，乙酰丙酮法來測定氨基糖含量，兩者相加計算總糖含量。
具體實施例方式實施例一1.脫毛豬皮充分水洗，并脫脂后，經(jīng)過堿膨脹，切成4cmX4cm的皮塊，用于脫毛。酶用量按每克皮400u計，酶用ρΗΙΟ. 5的硼砂緩沖溶液(O. 05M)溶解，并按液比2. 5 :1配制。皮塊和酶按用量放入廣口瓶中，蓋緊，32°C，振搖器中振搖。每隔一定時間，吸取酶液，測定脫毛液中糖含量。2.硫酸-苯酚法測定羥基糖含量(I)標準曲線的確定分別取葡萄糖標準溶液O. 0,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5ml置于干燥的比色管中，加水至O. 5ml，分別加入5%苯酚溶液O. 5ml，搖勻，快速加入2. 5ml濃硫酸，充分振搖，于25 30°C放置20min，以空白為參比調(diào)零，于490nm測量吸光度，并作標準曲線。(2)脫毛液的測定脫毛液稀釋10倍，再取O. 5ml進行測定，并以O(shè)時酶液為空白。(3)羥基糖含量的計算脫毛液的測定結(jié)果用2.⑴中的標準曲線計算羥基糖含量。3.乙酰丙酮法測定氨基糖含量(I)標準曲線的確定分別取鹽酸氨基葡萄糖標準溶液O、1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0ml，置于干燥的比色管中，各加水至5. 0ml，再加入1. Oml乙酰丙酮溶液，搖勻，沸水浴中加熱25min，取出，冷卻。加對-二甲氨基苯甲醛溶液1.0!111，搖勻，601保溫lhr，放置冷卻。以空白為參比調(diào)零，于525nm測量吸光度，并作標準曲線。(2)脫毛液的測定將脫毛液用6M鹽酸100°C水解6hr，用6M氫氧化鈉中和至pH7. 0，并以適量體積定容。取5. Oml進行測定，并以O(shè)時酶液為空白，(3)氨基糖含量的計算；

脫毛液的測定結(jié)果用3.⑴中的標準曲線計算氨基糖含量。4.總糖含量的計算將2中得到的羥基糖含量和3中得到的氨基糖含量相加即可得到總糖含量。實施例二1.脫毛牛皮充分水洗，經(jīng)過堿膨脹，切成4cmX4cm的皮塊，用于脫毛。酶用量按每克皮400u計，酶用ρΗΙΟ. 5的硼砂緩沖溶液(O. 05M)溶解，并按液比2. 5 I配制。皮塊和酶按用量放入廣口瓶中，蓋緊，320C，振搖器中振搖。每隔一定時間，吸取酶液，測定脫毛液中糖含量。2.其它步驟同實施例一，即可得到總糖含量。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明分別測定脫毛液中羥基糖含量和氨基糖含量，兩者相加計算總糖含量。
2.(I)中測定脫毛液中羥基糖含量的方法是硫酸-苯酚法。
3.(I)中測定脫毛液中氨基糖含量的方法是乙酰丙酮法。
全文摘要
在皮革生產(chǎn)的脫毛工序中，測定總糖含量是研究和控制酶法脫毛的一種重要手段。本發(fā)明采用硫酸-苯酚法來測定脫毛液中羥基糖含量，乙酰丙酮法來測定氨基糖含量，兩者相加計算總糖含量，克服了以往測定總糖含量時，忽略了氧基糖含量的缺點。本發(fā)明可用于皮革生產(chǎn)中的脫毛工序。
文檔編號G01N31/22GK103063803SQ20111031938
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者宋健 申請人:江南大學(xué)