專利名稱：偵測與辨別分子目標(biāo)物之裝置與方法
偵測與辨別分子目標(biāo)物之裝置與方法本申請是申請日為2010年3月10日、申請?zhí)枮?01080006477. 0、發(fā)明名稱為“偵
測與辨別分子目標(biāo)物之裝置與方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于一種偵測裝置，與使用此裝置以偵測及/或辨別一目標(biāo)物的方法。 此外，系關(guān)于一偵測裝置，其可偵測及/或辨別一發(fā)射低強(qiáng)度光之目標(biāo)物。
現(xiàn)有技術(shù)人類基因體計(jì)劃(The Human Genome Project, HGP)刺激定序處理量的大量增加且導(dǎo)致定序成本相對降低，其與每個(gè)基因體13年及近三十億美元之成本相比，定序成本已顯著降低一確切地，兩個(gè)獨(dú)立之基因體最近已被完成(McGuire et al.，Science 317 1687 (2007) )0個(gè)人基因體代表對于病患與健康照護(hù)提供者兩者之醫(yī)學(xué)治療中的典范轉(zhuǎn)移 (paradigm shift)。藉由管理疾病之基因風(fēng)險(xiǎn)因子，健康照護(hù)提供者可更立即實(shí)施預(yù)防性藥物與提供訂做治療。由于具有經(jīng)完成之基因體大銀行，藥物設(shè)計(jì)與投藥可更加有效，將藥物基因?qū)W(pharmacogenetics)的初期領(lǐng)域往前推進(jìn)。許多常見的DNA定序技術(shù)執(zhí)行光電子技術(shù)為藉由偵測發(fā)射自目標(biāo)物的光來偵測及/或辨別目標(biāo)物的方法。而使用于這些技術(shù)的偵測裝置通常昂貴且效率不高。常見方法通?；谠谝惶囟úㄩL波段中的測量，其中發(fā)射自要被偵測之目標(biāo)物的光具有最高強(qiáng)度。之后將測量之強(qiáng)度用以計(jì)算目標(biāo)物的濃度或量。近來，偵測發(fā)射自一單一目標(biāo)物的光變?yōu)闊衢T。例如，可能需要偵測發(fā)射自一單一染料分子之熒光以例如辨別此分子。此類熒光的強(qiáng)度通常非常低，以致常見偵測裝置與方法不適合來偵測此類弱光。再者，分析程序，例如流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry)或類流式細(xì)胞技術(shù)微流實(shí)驗(yàn)室芯片 (flow-cytometry-like microfluidic lab-on-a-chip)裝置的靈敏度可能被光偵測器的靈敏度所限制。增加此程序之靈敏度以允許其可偵測于相對低程度存在之物質(zhì)，而此物質(zhì)仍被感興趣于，例如診斷或研究應(yīng)用中。此外，在許多常見裝置中，常使用彩色濾光片，以允許一特定波長波段中之發(fā)射光的一部份通過并阻擋此發(fā)射光的其它部分。因此，此裝置為復(fù)雜的且需要更多空間。此外， 由于發(fā)射光的部分被彩色濾光片所阻擋，所以到達(dá)光偵測器之光子的數(shù)目減少。這使此類裝置與方法更不適合用來偵測及/或辨別，具微弱發(fā)射的目標(biāo)物。因此，需要偵測及/或辨別一目標(biāo)物，特別是發(fā)射低強(qiáng)度發(fā)射光的目標(biāo)物，例如一單一染料分子的裝置與方法。

發(fā)明內(nèi)容依照本發(fā)明之一實(shí)施方案，其提供一種偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置。該裝置包括一光偵測器，包括至少一第一光學(xué)傳感器與一第二光學(xué)傳感器，其具有測定光強(qiáng)度之能力；以及一計(jì)算機(jī)，其處理由該等光學(xué)傳感器所產(chǎn)生之輸出訊號，并比較該處理之一結(jié)果與對應(yīng)至(之)一已知類型的一已知結(jié)果以確定是否該目標(biāo)物屬于該已知類型。又依照本發(fā)明之一實(shí)施方案，其提供一種偵測具發(fā)光能力目標(biāo)物之方法。該方法包括提供一光偵測器，包括至少一第一光學(xué)傳感器與一第二光學(xué)傳感器，其中該光偵測器吸收發(fā)射自至少一目標(biāo)物的光；處理由該至少兩個(gè)光學(xué)傳感器所產(chǎn)生之輸出訊號；以及比較該處理之至少一結(jié)果與對應(yīng)于至少一已知類型的至少一已知結(jié)果以確定是否該至少一目標(biāo)物屬于該至少一已知類型。又依照本發(fā)明之一實(shí)施方案，其提供一種非短暫計(jì)算機(jī)可讀取媒體，其以一計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品編碼。該計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品當(dāng)被一計(jì)算機(jī)所執(zhí)行時(shí)，其指示該計(jì)算機(jī)處理由至少一第一光學(xué)傳感器與一第二光學(xué)傳感器所產(chǎn)生之輸出訊號，其中該輸出訊號可反應(yīng)第一光學(xué)傳感器與第二光學(xué)傳感器吸收發(fā)射自目標(biāo)物之光的情形；以及比較該處理的一結(jié)果與對應(yīng)至一已知類型的一已知結(jié)果以確定是否一目標(biāo)物屬于該已知類型。又依照本發(fā)明之一實(shí)施方案，其提供一種核酸定序的方法，包括下列步驟(a)執(zhí)行至少一核酸分子之單一分子核酸定序，其中該單一分子核酸定序?qū)е鹿獾陌l(fā)射，該光與該核酸所包括之至少一堿基的身份相關(guān)；(b)以至少一光偵測器偵測該光，該光偵測器包括至少一第一光學(xué)傳感器與一第二光學(xué)傳感器；(c)處理來自該至少兩個(gè)光學(xué)傳感器的輸出訊號；以及(d)比較該處理之至少一結(jié)果與對應(yīng)于至少一已知類型的至少一已知結(jié)果以測定該核酸所包括之至少一堿基的一身份?？梢粤私獾氖?，前方大體敘述與下列詳細(xì)敘述僅為示范與說明，不限制本發(fā)明主張。本說明書中并組成此說明書之部分的所附圖式說明一(一些)本發(fā)明實(shí)施例，并且連同說明，用來解釋本發(fā)明原理。


圖1為-圖2為-圖3為-圖4為-圖5為-圖6為
曲線圖其顯示硅之吸收系數(shù)(absorption coefficient)。
圖，其顯示與本發(fā)明實(shí)施例一致之一偵測裝置。
圖，其顯示與本發(fā)明實(shí)施例一致之一光偵測器。
圖，其顯示與本發(fā)明實(shí)施例一致之一光偵測器。
圖，其顯示使用于與本發(fā)明實(shí)施例一致之一偵測裝置中的-
-光柵。
曲線圖，其顯示兩個(gè)量子點(diǎn)(quantum dot)的發(fā)射光譜(emission
-致之兩個(gè)光二極管的響應(yīng)曲線
spectra)0圖7顯示一曲線圖，其顯示與與本發(fā)明實(shí)施例 (responsivity curve)0圖8顯示一曲線圖，其顯示兩個(gè)量子點(diǎn)的光 (responsivity curve)于一圖中。圖9為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例之一偵測方法。圖10為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例之一偵測方法。圖11為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明又另一實(shí)施例之一偵測方法。圖12為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明一另外實(shí)施例之一偵測方法。圖13為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施例之一偵測方法。
.極管的響應(yīng)曲線
圖14為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明再一另外實(shí)施例之一偵測方法。圖15為一流程圖，其說明根據(jù)本發(fā)明又一另外實(shí)施例之一偵測方法。圖16為一圖，其顯示與本發(fā)明實(shí)施例一致之一示范偵測裝置。圖17為一圖，其顯示一多接面光二極管作為與本發(fā)明實(shí)施例一致之光偵測器。圖18為一曲線圖，其顯示于圖11之多接面光二極管中之一光二極管的響應(yīng)曲線。圖19為一曲線圖，其顯示于圖11中多接面光二極管中之另一光二極管的響應(yīng)曲線。圖20為一曲線圖，其顯示于本發(fā)明一例子中之三個(gè)被測試目標(biāo)物的吸收光譜。圖21為一曲線圖，其顯示于本發(fā)明一例子中之三個(gè)被測試目標(biāo)物的發(fā)射光譜。主要組件符號說明11 光偵測器；12 計(jì)算機(jī)；111 第一光學(xué)傳感器；112 第二光學(xué)傳感器；Jl 第一訊號；J2 第二訊號；121 處理單元；122 輸出單元。601、603 ρ 型層；602、604 η 型層；201、202、203、204、205、303、304、305、403、404、405、504、505 步驟；PD-I 第一光學(xué)傳感器；PD-2 第二光學(xué)傳感器。實(shí)施方式與本發(fā)明一致之實(shí)施方案包括偵測及/或辨別一目標(biāo)物之一偵測裝置。偵測裝置具有偵測發(fā)射自一目標(biāo)物之弱光的能力。與本發(fā)明一致之實(shí)施方案將于以下伴隨參考圖式被詳細(xì)敘述。盡可能于全部圖式中使用相同之標(biāo)號代表相同或類似的部分。1.本發(fā)明一實(shí)施方案之裝置可使用與本發(fā)明實(shí)施方案一致之偵測裝置來偵測及/或辨別一具發(fā)光能力之目標(biāo)物。目標(biāo)物可為一發(fā)光(luminescence)來源，例如一熒光染料分子、一磷光染料分子、一量子點(diǎn)或生物發(fā)光(bioluminescent)或化學(xué)發(fā)光(chemiluminescent)系統(tǒng)之一發(fā)光產(chǎn)物 (例如一激發(fā)態(tài)反應(yīng)產(chǎn)物，如單態(tài)氧(singlet oxygen)或經(jīng)激發(fā)的腔腸熒光物質(zhì)(excited coelenteramide))。一本發(fā)明之裝置可或可不包括至少一激發(fā)光(excitatory light) 的來源，例如至少一雷射。例如，對于一可經(jīng)由生物發(fā)光(bioluminescent)或化學(xué)發(fā)光 (chemiluminescent)產(chǎn)生光的偵測目標(biāo)物而言，可不倚靠吸收激發(fā)光而產(chǎn)生發(fā)射光，所以不需要一激發(fā)光的來源。目標(biāo)物也可為一無光發(fā)射能力之標(biāo)的分子，但可附著至一具有發(fā)射光能力的標(biāo)記目標(biāo)物(例如，一熒光染料分子、一磷光染料分子或一量子點(diǎn))。一特定標(biāo)記目標(biāo)物可具有被附著至一專一標(biāo)的分子的能力。因此經(jīng)由標(biāo)記目標(biāo)物可確認(rèn)標(biāo)的分子?？蓪⒋笥谝粋€(gè)的標(biāo)記目標(biāo)物附著至一標(biāo)的分子。也可使用此裝置來監(jiān)測大量目標(biāo)物。與本發(fā)明實(shí)施方案一致之偵測裝置可包括一光偵測器偵測發(fā)射自目標(biāo)物的光。 光偵測器具有至少部分吸收入射于其上的光并產(chǎn)生響應(yīng)此光的輸出訊號。光偵測器可包括用以控制光偵測器之操作的控制電路?？刂齐娐房砂ㄒ挥嵦柗糯笃髦娐贰/D轉(zhuǎn)換器、積算器、比較器、邏輯電路、讀出電路、內(nèi)存、微處理器、時(shí)鐘震蕩器(clock)及/或地址 (address)0偵測裝置可包括用以處理來自光偵測器的輸出訊號及產(chǎn)生測定結(jié)果的計(jì)算機(jī)。偵測裝置可更包括具一針孔(pinhole)之遮蔽薄板(blind sheet)。偵測裝置也可包括一連結(jié)位(linker site)，而目標(biāo)物可附著至連結(jié)位。連結(jié)位可形成于針孔中或形成于外側(cè)但接近于針孔。裝置可更包括一激發(fā)光源。目標(biāo)物可吸收發(fā)射自激發(fā)光源的光且之后發(fā)射要被偵測裝置偵測之另一光。發(fā)射自目標(biāo)物的光與發(fā)射自激發(fā)光源的光相較可具有不同波長。1. 1光學(xué)傳感器與本發(fā)明實(shí)施方案一致之光偵測器可包括多數(shù)個(gè)光學(xué)傳感器。與本發(fā)明實(shí)施例一致之光學(xué)傳感器可為，例如一光二極管、一累崩光二極管(avalanche photodiode, APD)、一光敏晶體管(phototransistor)、一光閘(photogate)、一量子井紅外線光偵測器 (quantum-well infrared photodetector，QWIP)、一特定應(yīng)用集成電路上薄膜(thin-film on ASIC, TFA)、一金屬-半導(dǎo)體-金屬(metal-semiconductor-metal，MSM)光偵測器或其組合。在本發(fā)明一實(shí)施例中，光學(xué)傳感器可為一光二極管。光二極管為一固態(tài)裝置其將光轉(zhuǎn)變成電流或電壓。光二極管通常由半導(dǎo)體材料制成，例如硅。光二極管的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包括藉由連結(jié)一P型半導(dǎo)體與一η型半導(dǎo)體所形成的一 ρ-η接面。光二極管可僅具有一 ρ-η接面且僅提供一輸出訊號，因此被視為一個(gè)光學(xué)傳感器；一多接面光二極管具有大于一個(gè)的ρ-η接面且可提供大于一個(gè)的輸出訊號，其中每個(gè) Ρ-η接面可被視為一個(gè)光學(xué)傳感器?；蛘?，光二極管可為一 p-i-n光二極管。p-i-n 二極管為一 p_n接面光二極管的特別形式，其具有夾設(shè)于η型層與ρ型層間的一本質(zhì)層(intrinsic layer)、或一輕摻雜η型層、或一輕摻雜ρ型層。在一 p-i-n 二極管中，可修改幾乎為整個(gè)本質(zhì)層之空乏區(qū) (depletion region)的厚度以使量子效率(quantum efficiency)與頻率響應(yīng)(frequency response)最佳化(S. Μ. Sze, Physics of Semiconductor Devices, pp. 674-675, Wiley, 2007)。藉由將ρ型雜質(zhì)與η型雜質(zhì)分別摻雜進(jìn)入一半導(dǎo)體基底可形成ρ型半導(dǎo)體與η型半導(dǎo)體。例如，于硅中，磷或砷可作為η型雜質(zhì)，而硼與銦可作為ρ型雜質(zhì)。一般而言，可使用兩種方法來將雜質(zhì)引入一半導(dǎo)體基底中擴(kuò)散與離子植入。藉由將P型雜質(zhì)擴(kuò)散或植入于η型半導(dǎo)體中，可將η型半導(dǎo)體基底的部分轉(zhuǎn)變成ρ型半導(dǎo)體。因此，可形成一 ρ-η接面?；蛘撸逵蓪ⅵ切碗s質(zhì)擴(kuò)散或植入于ρ型半導(dǎo)體中，可將ρ型半導(dǎo)體基底的部分轉(zhuǎn)變成η型半導(dǎo)體，且因此形成一 ρ-η接面。除了擴(kuò)散與植入，也可使用磊晶成長(印itaxial growth)來制造η型半導(dǎo)體或ρ型半導(dǎo)體，磊晶成長為一制程，其將一薄的、單晶層(single crystal layer)成長于一單晶基底的表面上(D. A. Neamen, Semiconductor Physics & Devices,pp. 17_18，McGrawHill，1997)。當(dāng)光為入射于一光二極管上時(shí)，可產(chǎn)生電子-電洞對(electron-hole pair)于光二極管中。若一電子-電洞對被產(chǎn)生于光二極管之空乏區(qū)
7中時(shí)，于空乏區(qū)中之內(nèi)建電位(built-in potential)可將電子與電洞分離并因此產(chǎn)生光電流(photocurrent)或電壓。不同之光二極管可具有不同之吸收一入射光的能力。藉由構(gòu)成光二極管的材料的吸收系數(shù)α可描述此能力。圖1顯示硅于不同波長之吸收系數(shù)。入射光之光通量(photon flux) Φ隨著光穿透進(jìn)入光二極管的深度以指數(shù)方式減少。于光二極管內(nèi)一深度χ的光通量可被表示為Φ(λ，χ) = Φ0(λ ) · e-α χ ；其中λ為入射光之波長而Φ0為于光二極管之表面的光通量。因此，于空乏區(qū)中被吸收之光通量可被假定為Δ Φ (λ ) = Φ0(λ ) · (e-α xu-e-α χ )；其中XU與xl分別為空乏區(qū)之上與下邊界的深度?？蓪⒂诳辗^(qū)中被吸收之光通量轉(zhuǎn)變成一光電流作為光二極管的一輸出訊號。光電流可被表示為IPD(A)=L 98x10-16 · A · [Φ0(λ ) · R(A )/λ ]；其中A為光學(xué)窗(optical window)的面積，且R( λ )為一光二極管之響應(yīng) (responsivity)，其被定義為由入射光之一單位能量所產(chǎn)生之光電流的量。1. 2用于訊號處理之計(jì)算機(jī)與本發(fā)明實(shí)施方案一致，提供一計(jì)算機(jī)，其可處理由光偵測器產(chǎn)生之輸出訊號，藉由于輸出訊號上執(zhí)行一數(shù)學(xué)或邏輯操作，并測定目標(biāo)物之存在與確定目標(biāo)物之類型。用于處理來自一光學(xué)傳感器之輸出訊號的計(jì)算機(jī)可為，例如，一個(gè)人計(jì)算機(jī)、一微處理器或可程序化消費(fèi)電子(programmable consumer electronic)、一邏輯電路或其類似物。計(jì)算機(jī)可包括一或多個(gè)暫時(shí)或永久儲存數(shù)據(jù)的儲存裝置及含有表現(xiàn)一算法之軟件碼(software codes)的計(jì)算機(jī)程序。計(jì)算機(jī)可根據(jù)算法來執(zhí)行處理。儲存裝置可為一只讀存儲器(read-only memory, ROM)、隨機(jī)存取內(nèi)存(random access memory, RAM)、 或一具有其它存取選項(xiàng)(access option)的內(nèi)存。藉由計(jì)算機(jī)可讀媒體，如，例如(a)磁性媒體(magnetic media)，如一硬盤(hard disk)、一軟盤片(floppy disk)或其它磁性碟，一磁帶(tape)、一"_ 式磁帶(cassette tape) ； (b)光學(xué)媒體(optical media)，如光盤(optical disk) (CD-ROM、數(shù)字多功能光盤(digital versatile disk-DVD)) ； (c) 半導(dǎo)體媒體，如動(dòng)態(tài)隨機(jī)存取內(nèi)存(dynamic random access memory，DRAM)、靜態(tài)隨機(jī)存取內(nèi)存(static random access memory, SRAM)、可抹除可編程只讀存儲器(erasable programmable read only memory, EPR0M)、電子可抹除可編程只讀存儲器(electrically erasable, programmable, read-only memory, EEPR0M)、記憶卡(memory stick),或藉由任何其它媒體，如紙，可將儲存裝置實(shí)際植入。計(jì)算機(jī)可包括一或多個(gè)接口(interface)用以接收來自光偵測器的輸出訊號。計(jì)算機(jī)可包括一或多個(gè)用以處理這些訊號的處理器。此外，計(jì)算機(jī)可包括一或多個(gè)用以接收來自一使用者指示之輸入裝置，且可包括一或多個(gè)用以輸出處理結(jié)果的輸出裝置。輸入裝置可為，例如一鼠標(biāo)、一鍵盤或具有多數(shù)個(gè)按鈕的控制板。輸出裝置可為，例如一顯示器或一打印機(jī)。1. 3示范之偵測裝置
參見圖2，其顯示與本發(fā)明實(shí)施方案一致之偵測裝置1。偵測裝置1可包括一光偵測器11與一計(jì)算機(jī)12。光偵測器11可包括一第一光學(xué)傳感器111與一第二光學(xué)傳感器112。在一些實(shí)施例中，光偵測器11可包括大于兩個(gè)的光學(xué)傳感器。例如，在一些實(shí)施例中，光偵測器11可包括三個(gè)光學(xué)傳感器或四個(gè)光學(xué)傳感器。第一光學(xué)傳感器111與第二光學(xué)傳感器112可為被堆疊的。于堆疊之結(jié)構(gòu)中，發(fā)射自一目標(biāo)物的光通過第一光學(xué)傳感器111，且之后通過第二光學(xué)傳感器112。在一些實(shí)施例中，光學(xué)傳感器可為垂直或?qū)嵸|(zhì)上垂直堆疊。在其它實(shí)施例中，對于垂直方向而言，光學(xué)傳感器可以一方向于一特定角度(例如，10°、30°、45°、 60°等)被傾斜地堆疊。在一些實(shí)施例中，光偵測器11可為多接面光二極管，其包括多數(shù)個(gè)p-n接面形成于其中。于一多接面光二極管中，每個(gè)p-n接面可形成一個(gè)別之光學(xué)傳感器的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。第一光學(xué)傳感器111與第二光學(xué)傳感器112的各個(gè)可分別包括，例如于多接面光二極管中之一 P-n接面，如于圖3中所示。在一些實(shí)施例中，于光偵測器11中之不同的光學(xué)傳感器可由相同之半導(dǎo)體材料， 例如硅、鍺、GaAs、AlGaAs、InGaAs, InGaAsN, InGaP,CdTe 或 CdS 所制成。在一些實(shí)施例中， 于光偵測器11中之不同的光學(xué)傳感器可由不同之半導(dǎo)體材料所制成。例如，圖4顯示一光偵測器由兩個(gè)垂直堆疊之光學(xué)傳感器PD-I與PD-2所形成。光學(xué)傳感器PD-I由材料-1 與材料-2所制成，而光學(xué)傳感器PD-2由材料-2與材料-3所制成。材料-1、材料-2與材料-3可為上述半導(dǎo)體材料之組合。此外，這些光學(xué)傳感器的厚度也可為不同。如圖2所示，發(fā)射自一目標(biāo)物，例如一量子點(diǎn)(quantum dot, QD)而入射于光偵測器11上的光可被第一光學(xué)傳感器111部分吸收，而產(chǎn)生一第一訊號Jl。未被吸收之光通過第一光學(xué)傳感器111且之后可被第二光學(xué)傳感器112部分吸收，而產(chǎn)生一第二訊號J2。可將這些訊號送至計(jì)算機(jī)12來處理。在一些實(shí)施例中，發(fā)射自一目標(biāo)物的光可入射至光偵測器11上而不通過另一光學(xué)組件，例如一光學(xué)濾光片、一棱鏡或一透鏡(即，可直接入射至光偵測器上)。在一些實(shí)施例中，裝置可更包括一光收集光學(xué)結(jié)構(gòu)以收集發(fā)射自目標(biāo)物的光。在一些實(shí)施例中，光偵測器11可包括兩個(gè)或更多個(gè)光學(xué)傳感器水平排列(未顯示)。在這些實(shí)施例中，偵測裝置1可更包括一光學(xué)結(jié)構(gòu)置于目標(biāo)物與光偵測器11之間。 發(fā)射自目標(biāo)物的光可藉由光學(xué)結(jié)構(gòu)將其引導(dǎo)至一或多個(gè)光學(xué)傳感器并被一或多個(gè)光學(xué)傳感器所吸收。對于不同波長的光而言，在通過光學(xué)結(jié)構(gòu)后，光的方向可為不同。因此，以水平排列之于光偵測器中不同的光學(xué)傳感器可偵測具有不同波長的光。 在一些實(shí)施例中，光學(xué)結(jié)構(gòu)可包括一棱鏡。在一些實(shí)施例中，光學(xué)結(jié)構(gòu)可包括一透鏡。在一些實(shí)施例中，光學(xué)結(jié)構(gòu)可包括一棱鏡與一透鏡。棱鏡可為，例如一三角棱鏡、一阿貝棱鏡(Abbe prism)、一貝林-布洛卡棱鏡(Pellin-Broca prism)、一阿米其棱鏡(Amici prism)或其組合。透鏡可為，例如一會聚透鏡(converging lens)、一發(fā)散透鏡(diverging lens)或其組合。光學(xué)結(jié)構(gòu)可由，例如玻璃、塑料或?qū)τ谒信d趣之波長而言為可穿透的其它材料。光學(xué)結(jié)構(gòu)的穿透度可為夠高以允許大部分的光通過光學(xué)結(jié)構(gòu)。
或者，在一些實(shí)施例中，光學(xué)結(jié)構(gòu)可包括一光柵。光柵可為，例如一二元光柵 (binary grating)>一閃Jffijfeft (blaze grating)>一IE弓玄jfeft (sinusoidalgrating) >一多階式光柵(multi-level grating)、一體積光柵(volume grating)或其組合。圖5顯示為與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置。于此偵測裝置中，光偵測器包括多數(shù)個(gè)光學(xué)傳感器水平排列于不同位置?？墒褂霉鈻乓詫碜阅繕?biāo)物之不同波長的光引導(dǎo)至光偵測器的不同位置以便由不同光學(xué)傳感器所吸收。與本發(fā)明實(shí)施例一致，可提供一偵測系統(tǒng)，其包括與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置數(shù)組。與本發(fā)明實(shí)施例一致，也可提供一偵測系統(tǒng)，其包括與本發(fā)明實(shí)施例一致之光偵測器數(shù)組與一計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)用以處理來自光偵測器之?dāng)?shù)組的輸出訊號并根據(jù)處理結(jié)果執(zhí)行偵測及/或辨別。上述偵測系統(tǒng)可一次偵測及/或辨別多數(shù)個(gè)目標(biāo)物，且因此適合，例如核酸之大規(guī)模平行定序。計(jì)算機(jī)可包括一處理單元121與一輸出單元122。處理單元121處理來自光偵測器11的輸出訊號并測定目標(biāo)物之存在與確定目標(biāo)物之類型。輸出單元122輸出測定結(jié)果。 在一些實(shí)施例中，計(jì)算機(jī)12也可包括一儲存裝置(未顯示)，儲存一計(jì)算機(jī)程序。計(jì)算機(jī)程序可包含用以指示計(jì)算機(jī)以處理訊號之軟件碼。可將光偵測器11與計(jì)算機(jī)12整合成一單片的半導(dǎo)體芯片?？蓪⒐鈧蓽y器11與計(jì)算機(jī)12形成于分開的半導(dǎo)體芯片上。2.偵測方法發(fā)射自不同目標(biāo)物的光可具有不同光譜。例如，圖6顯示作為兩目標(biāo)物之兩個(gè)量子點(diǎn)(QDs) (QD-1與QD-2)的發(fā)射光譜。于此例子中，此兩發(fā)射光譜的波峰于不同之波長。 于其它例子中，不同目標(biāo)物之發(fā)射光譜也可具有不同的形狀。第一光學(xué)傳感器111與第二光學(xué)傳感器112可具有不同之響應(yīng)特性。圖7顯示，作為一例子之第一光學(xué)傳感器111與第二光學(xué)傳感器112的響應(yīng)曲線。第一光學(xué)傳感器111 與第二光學(xué)傳感器112的響應(yīng)率(responsivity)可彼此互相不同，其中它們具有不同的形狀及/或它們可在不同波長到達(dá)高峰。為了更清楚解釋，圖8顯示兩個(gè)光學(xué)傳感器的響應(yīng)曲線與兩個(gè)量子點(diǎn)的發(fā)射光譜于一個(gè)圖中。于此例子中，發(fā)射自QD-I的光可在兩個(gè)光學(xué)傳感器上產(chǎn)生相似強(qiáng)度的訊號。 另一方面，發(fā)射自QD-2的光在第二光學(xué)傳感器112上產(chǎn)生的訊號強(qiáng)于在第一光學(xué)傳感器 111上產(chǎn)生的訊號。在一些實(shí)施例中，如于圖2中所示，發(fā)射自一目標(biāo)物的光可入射至光偵測器11且被第一光學(xué)傳感器111與第二光學(xué)傳感器112所部分吸收，其依序分別產(chǎn)生訊號Jl與J2。 計(jì)算機(jī)12處理訊號Jl與J2，并辨別目標(biāo)物。圖9顯示根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施例之辨別一目標(biāo)物方法的流程圖。于步驟201，發(fā)射自一目標(biāo)物的光入射至光偵測器11上。于步驟202，分別由第一光學(xué)傳感器與第二光學(xué)傳感器產(chǎn)生兩個(gè)輸出訊號Jl與J2，并將訊號Jl與J2送至計(jì)算機(jī)12。于步驟203，計(jì)算機(jī)12 處理訊號Jl與J2。于步驟204，計(jì)算機(jī)12比較處理結(jié)果與對應(yīng)至一目標(biāo)物之已知類型的已知結(jié)果。于步驟205，計(jì)算機(jī)12確定是否目標(biāo)物屬于此已知類型。在一實(shí)施例中，處理訊號Jl與J2可包括計(jì)算Jl與J2的比值。若計(jì)算出之比值為在對應(yīng)至目標(biāo)物之已知類型的特定范圍中，則可確定被偵測之目標(biāo)物屬于此已知類型。例如，一量子點(diǎn)QD-I之已知類型可具有0. 7 < J2/J1 < 1. 2的對應(yīng)范圍。若一被偵測之目標(biāo)物計(jì)算出的比值為0. 9，則目標(biāo)物被確定為一 QD-I類型目標(biāo)物。圖10顯示根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施例之辨別一目標(biāo)物方法的流程圖。于此實(shí)施例中，可測定一目標(biāo)物屬于，例如三種目標(biāo)物的已知類型之一，即，類型1、類型2與類型3。此實(shí)施例之最先的兩個(gè)步驟可與上述實(shí)施例所述之那些相同。于步驟303，計(jì)算機(jī)12測定介于此兩訊號Jl與J2之間的關(guān)連性。于步驟304，計(jì)算機(jī)12比較此關(guān)連性與對應(yīng)至目標(biāo)物之已知類型的已知結(jié)果。于步驟305，計(jì)算機(jī)12根據(jù)比較結(jié)果確定出目標(biāo)物屬于何種類型。在此實(shí)施例中，例如，若Jl >J2，則于是可確定目標(biāo)物為一類型1目標(biāo)物。若 Jl J2，則于是可確定目標(biāo)物為一類型2目標(biāo)物。若Jl <J2，則于是可確定目標(biāo)物為一類型3目標(biāo)物。圖11顯示根據(jù)本發(fā)明又一實(shí)施例之辨別一目標(biāo)物方法的流程圖。在此實(shí)施例中， 可確定目標(biāo)物屬于多數(shù)個(gè)目標(biāo)物之已知類型之一，而多數(shù)個(gè)已知類型之目標(biāo)物，即類型1 至類型η。此實(shí)施例之最先的兩個(gè)步驟可與上述實(shí)施例中的那些相同。于步驟403，計(jì)算機(jī)計(jì)算Jl與J2之比值。于步驟404，計(jì)算機(jī)12比較計(jì)算出之比值與對應(yīng)至目標(biāo)物已知類型之已知比值。于步驟405，計(jì)算機(jī)12根據(jù)比較結(jié)果確定目標(biāo)物屬于何種類型。于此實(shí)施例中，例如，若在所有已知類型之已知比值中，類型i之已知比值 (1 ^ i ^ η)為最接近計(jì)算出之比值，則于是可確定目標(biāo)物屬于一類型i目標(biāo)物。圖12顯示根據(jù)本發(fā)明一另外實(shí)施例之辨別一目標(biāo)物方法的流程圖。于此實(shí)施例中，可確定一目標(biāo)物屬于多數(shù)個(gè)目標(biāo)物之已知類型之一，而多數(shù)個(gè)已知類型之目標(biāo)物，即類型1至類型η。此實(shí)施例之最先的兩個(gè)步驟可與上述實(shí)施例中的那些相同。于步驟504，計(jì)算機(jī)12比較計(jì)算出之比值與對應(yīng)至目標(biāo)物已知類型之已知比值范圍。于步驟505，計(jì)算機(jī) 12根據(jù)比較結(jié)果確定出目標(biāo)物屬于何種類型。于此實(shí)施例中，例如，若計(jì)算出之比值落入對應(yīng)至類型i的比值范圍(1 < i < η) 中，則于是可確定目標(biāo)物為一類型i目標(biāo)物。若計(jì)算出之比值不落入任何范圍中，則其可被報(bào)導(dǎo)為信心程度低且無法確定要被偵測之目標(biāo)物的類型。例如，假定類型1目標(biāo)物具有0. 7 < J2/J1 < 1.2之對應(yīng)比值范圍，而類型2目標(biāo)物具有J2/J1 >2之對應(yīng)比值范圍，若要被偵測之目標(biāo)物之計(jì)算出的比值為1，則可確定目標(biāo)物為一類型1目標(biāo)物。另一方面，若要被偵測之目標(biāo)物之計(jì)算出的比值為1. 5，其可被報(bào)導(dǎo)為信心程度低且無法確定要被偵測之目標(biāo)物的類型。在一實(shí)施例中，Jl與J2的比值可為J2/J1。于一實(shí)施例中，Jl與J2的比值可為 J1/J2。在一些實(shí)施例中，Jl與J2的比值可為J2/(c χ Jl)或Jl/(c χ J2)，其中“C”為一系數(shù)。于一些實(shí)施例中，在將訊號送至計(jì)算機(jī)12后，計(jì)算機(jī)12可額外執(zhí)行一測定是否一目標(biāo)物存在于一樣本中的步驟。在一些實(shí)施例中，藉由比較所有或一些訊號的總和與一臨界值可執(zhí)行此測定。在一些實(shí)施例中，例如，若總和等于或大于此臨界值，則可測定一目標(biāo)物為存在。另一方面，若總和小于此臨界值，則可測定一目標(biāo)物為不存在。在其它實(shí)施例中， 若總和小于此臨界值，則可測定一目標(biāo)物為存在。若總和等于或大于此臨界值，則可測定一目標(biāo)物為不存在。在一些實(shí)施例中，藉由直接比較訊號與臨界值可執(zhí)行此測定以測定一目標(biāo)物的存在。例如，若任何訊號為，或特定數(shù)目之訊號為等于或大于臨界值，則可測定一目標(biāo)物為存在。另一方面，若所有訊號小于此臨界值，則可測定一目標(biāo)物為不存在。 在一些實(shí)施例中，光偵測器11可包括三個(gè)或更多個(gè)光學(xué)傳感器，根據(jù)發(fā)射自一目標(biāo)物入設(shè)于光偵測器11上的光，各產(chǎn)生一輸出訊號。在一些實(shí)施例中，藉由計(jì)算機(jī)12可處
11理兩個(gè)所產(chǎn)生之輸出訊號以辨別目標(biāo)物。在其它實(shí)施例中，藉由計(jì)算機(jī)12可處理更多或所有產(chǎn)生之輸出訊號以辨別目標(biāo)物。圖13顯示根據(jù)本發(fā)明再一實(shí)施例之辨別一目標(biāo)物方法的流程圖。于此實(shí)施例中， 光偵測器11包括三個(gè)光學(xué)傳感器PD1、PD2與PD3?？蓚蓽y并確定于一樣本中之一目標(biāo)物屬于例如，四種類型之一，例如染料1、染料2、染料3與染料4。將由這三個(gè)光學(xué)傳感器所產(chǎn)生之輸出訊號分別以IPD1、IPD2與IPD3來表示，并將其送至計(jì)算機(jī)12以進(jìn)行處理。于以下描述此方法。首先，可使用一激發(fā)光源來激發(fā)樣本。之后光學(xué)傳感器PD1、PD2與PD3可產(chǎn)生輸出訊號IPD1、IPD2與IPD3。根據(jù)接收輸出訊號，計(jì)算機(jī)12可計(jì)算這些訊號的總和。若總和小于一臨界值Vth，則計(jì)算機(jī)12會產(chǎn)生一沒有熒光發(fā)生的報(bào)告。否則，計(jì)算機(jī)則會繼續(xù)進(jìn)行至下個(gè)步驟。當(dāng)測定出熒光的確發(fā)生而目標(biāo)物存在時(shí)，計(jì)算機(jī)12首先可執(zhí)行一原始辨別步驟。 于此步驟中，計(jì)算機(jī)12可計(jì)算于IPD3與所有訊號之總和間的一第一比值，并比較此比值與第一組臨界值，例如Vthl、Vth2、Vth3與Vth4以測定是否計(jì)算出之第一比值落入介于0 與Vthl、介于Vthl與Vth2、介于Vth2與Vth3或介于Vth3與Vth4之間的任何范圍中。然而，若計(jì)算出之第一比值不落入任何上述之范圍中，計(jì)算機(jī)12可產(chǎn)生一發(fā)生缺陷之發(fā)射的報(bào)告。之后，執(zhí)行一確認(rèn)步驟。在確認(rèn)步驟中，計(jì)算于IPD2與IPD3間的一第二比值，并比較此比值與第二組臨界值，例如￥讓1，、￥讓2，、￥讓3，與￥讓4，以測定是否計(jì)算出之第二比值落入介于0與Vthl，、介于Vthl，與Vth2，、介于Vth2，與Vth3，或介于Vth3，與Vth4， 之間的任何范圍中。例如，若于原始辨別步驟中，計(jì)算出之第一比值落入介于Vthl與Vth2之間的范圍中，則可確定目標(biāo)物可能屬于類型染料2。之后計(jì)算機(jī)12繼續(xù)進(jìn)行至確認(rèn)步驟以測定是否計(jì)算出之第二比值落入介于Vthl’與Vth2’之間的范圍中。若是，則可確定目標(biāo)物屬于類型染料2。否則，計(jì)算機(jī)會產(chǎn)生一發(fā)生缺陷之發(fā)射的報(bào)告。需注意的是，可獨(dú)立執(zhí)行上述原始辨別步驟與確認(rèn)步驟之任何一個(gè)以辨別一目標(biāo)物。然而，于一辨別程序中執(zhí)行兩個(gè)步驟可改善準(zhǔn)確性。圖14顯示根據(jù)本發(fā)明再一另外實(shí)施例之辨別一目標(biāo)物方法的流程圖。于此實(shí)施例中，光偵測器包括多數(shù)個(gè)光學(xué)傳感器PD1、PD2、. . . PDn，其中η為大于1且可等于或小于 6。此外，η可等于3。可使用此實(shí)施例之裝置與方法來偵測并辨別q個(gè)不同之目標(biāo)物，例如 q個(gè)不同之染料，表示為D1、D2、. . .Dq。于此實(shí)施例中使用的激發(fā)光源可具有k個(gè)不同之激發(fā)光波段，L1、L2、. . . Lk，其中 k可等于或大于1及等于或小于3。根據(jù)一組指令，激發(fā)光源可開啟及關(guān)閉，而產(chǎn)生一組m 個(gè)不同之激發(fā)狀態(tài)Cj，其中j<m。各激發(fā)狀態(tài)可為不同激發(fā)光波段的組合。在相同之激發(fā)狀態(tài)下，對于不同之染料由一特定光學(xué)傳感器所產(chǎn)生的輸出訊號可為不同。在一特定染料Ds之j-th激發(fā)狀態(tài)Cj下(其中1 < s < 0，在1 □ th光學(xué)傳感器PDi (其中，1彡i彡η)所產(chǎn)生之輸出訊號可表示為Ds {J {PDi Cj}}。PDi與Cj之不同組合可產(chǎn)生不同的Ds{J{PDi:Cj}}。因此，在使用此裝置以偵測并辨別一未知染料之前，在染料Ds之標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，藉由使用PDi與Cj之不同組合來執(zhí)行校正讀取，可獲得輸出訊號之矩陣。此矩陣可為一染料Ds所特有的，且可稱為染料Ds之標(biāo)準(zhǔn)讀取矩陣，M{dye Ds}，如下所示Ds{J{PDl:Cl}}，Ds{J{PD2:Cl}}，· · · Ds {J{PDn:Cl}}Ds{J{PDl:C2}}，Ds {J {PD2 C2}}，· · · Ds {J{PDn:C2}}Ds{J{PDl:Cm}}，Ds {J {PD2 Cm}}，· · · Ds {J{PDn:Cm}}對于各染料而言，可重復(fù)校正讀取，而產(chǎn)生q個(gè)標(biāo)準(zhǔn)讀取矩陣M{dyeDl}、M{dye D2}、...M{dye Dq}。為了使背景的影響最小化，當(dāng)沒有染料存在時(shí)，藉由記錄來自光學(xué)傳感器的輸出訊號，也可獲得一背景讀數(shù)，背景讀數(shù)可產(chǎn)生一背景讀取矩陣M{background}B{J{PD1:C1}}，B{J{PD2:C1}}，· · · B{J{PDn:Cl}}B{J{PD1:C2}}，B{J{PD2:C2}}，· · . B {J {PDn: C2}}B{J{PDl:Cm}}，B{J{PD2:Cm}}，. . . B {J {PDn: Cm}}當(dāng)將一未知樣本提供至偵測裝置時(shí)，測量在不同激發(fā)狀態(tài)下由光學(xué)傳感器產(chǎn)生之輸出訊號，并獲得一樣本讀取矩陣Mlsample}J{PD1:C1}，J{PD2:C1}，· · · J{PDn:Cl}J {PD1 C2}，J {PD2 C2}，· · · J {PDn C2}J {PD1 Cm}，J {PD2 Cm}, ... J {PDn Cm}之后可比較樣本讀取矩陣與標(biāo)準(zhǔn)讀取矩陣以確定樣本含有何種類型之染料。為了使背景對結(jié)果的影響最小化，在比較前可自標(biāo)準(zhǔn)讀取矩陣與樣本讀取矩陣兩者減去背景讀取矩陣。比較可藉由計(jì)算染料Ds之各種形式的排序(ranlORs來執(zhí)行。當(dāng)計(jì)算Rs時(shí)，可實(shí)施加權(quán)系數(shù)(weight factor)與統(tǒng)計(jì)方法。例如，可使用最小平方法(least squared method)或最大概似法(most likelihood method)以得到最佳配對?？蓪⒓訖?quán)系數(shù)應(yīng)用于各光學(xué)感測或激發(fā)光模式以增加分析準(zhǔn)確性。在計(jì)算出Rs之后，計(jì)算機(jī)12會根據(jù)排序(rank) Rs報(bào)導(dǎo)出最可能之染料、第二可能之染料及諸如此類。于合成方法之定序中，藉由鑒定對應(yīng)于模版新加入至合成中的股(strand)之核苷酸來測定DNA序列。藉由發(fā)射自附著于核苷酸的熒光團(tuán)來偵測核苷酸加入步驟?？蓪⒑塑账岷喜⒎磻?yīng)(nucleotide incorporation reaction)分成許多步驟核苷酸接至由聚合酶與模板形成之活化位，打斷磷酸鍵與形成對于糖的新鍵結(jié)。一些核苷酸只是擴(kuò)散于活化位而進(jìn)進(jìn)出出，并無實(shí)際的合并發(fā)生。為了于實(shí)時(shí)監(jiān)測合并反應(yīng)，偵測裝置需要可偵測熒光團(tuán)到達(dá)、反應(yīng)之時(shí)間與熒光團(tuán)之類型。測量保留時(shí)間的理由為與那些被合并之核苷酸相較， 擴(kuò)散之核苷酸會停留較短的時(shí)間。藉由設(shè)定保留時(shí)間臨界值，可偵測一實(shí)際合并的情況。可用于情況偵測之根據(jù)本發(fā)明又一另外實(shí)施例的方法的流程圖顯示于圖15中。此方法基本上與前述相似，而再多加入一步驟以測定是否可聲稱一狀態(tài)。因此，此方法之詳細(xì)敘述被省略。圖16顯示可用于此實(shí)施例之示范偵測裝置的塊狀圖。
在一些實(shí)施例中，光偵測器11可包括兩個(gè)或更多個(gè)水平排列之光學(xué)傳感器?？蓪⒂伤脚帕兄鈱W(xué)傳感器產(chǎn)生的訊號輸入至計(jì)算機(jī)12并以相似于前述方法之一的方式處理以測定目標(biāo)物的存在及/或辨別目標(biāo)物之類型。3.應(yīng)用可將與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置與系統(tǒng)及其使用方法應(yīng)用于，例如核酸偵測、DNA定序、生物標(biāo)記鑒定或流式細(xì)胞技術(shù)。偵測裝置可偵測并處理低強(qiáng)度光訊號，其使單一分子目標(biāo)物的辨別變?yōu)榭赡?。在本發(fā)明方法之一些實(shí)施例中，將標(biāo)簽附著于分析物(即，要被偵測之物質(zhì))、探針，例如引子、抗體或其它與分析物反應(yīng)之試劑，或其它試劑，例如核苷酸(包括核苷酸類似物)。可使用任何標(biāo)簽于分析物或探針上，其在訊號與分析物的量或存在的關(guān)系中為有用的。例如，可使用于本發(fā)明實(shí)施例之多種熒光分子包括小分子、熒光蛋白質(zhì)與量子點(diǎn)。有用的熒光分子(熒光團(tuán))包括，但不限于1、5 IAEDANS ；1、 8-ANS ；4-甲基傘形酮 G-Methylumbelliferone) ；5-羧基-2，7- 二氯熒光黃 (5-carboxy-2, 7-dichlorofluorescein) ；5-幾基焚 光素(5-CarboxyfIuorescein ，5-FAM) ；5-羧基萘基熒光素(5-Carboxynapthofluorescein) ；5-羧基四甲基羅丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine、5-TAMRA) ；5-FAM(5-羧基熒光素 (5-Carboxyfluorescein)) ；5-HAT(輕色 胺(Hydroxy Tryptamine)) ；5_ 輕色 胺 (5-Hydroxy Tryptamine, HAT) ；5-R0X( M 基 _X_ 羅丹明(carboxy-X-rhodamine)) ；5-TAMRA(5-羧基四甲基羅丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine)) ；6-羧基羅丹明(6-Carboxyrhodamine) 6G ；6-CR 6G ;6_J0E ;7_ 胺基 _4_ 甲基香豆素 (7-Amino-4-methylcoumarin) ；7- ^ ^ D (7-Aminoactinomycin D,7-AAD) ；7- 基-4-甲基香豆素(7-Hydroxy-4-methylcoumarin) ；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine) ；ABQ ；Acid Fuchsin ；ACMA (9-氨基-6-氯 ~2~ 甲氧基口丫唆(9-Amino-6-chloro-2-methoxyacridine)) ； 口丫唆橘(Acridine Orange) ；口丫啶紅(Acridine Red)；吖啶黃(Acridine Yellow)；吖啶黃(Acriflavin)；吖啶黃佛爾根 SITSA (Acriflavin Feulgen SITSA)；自發(fā)熒光蛋白質(zhì)(AFPs-AutoFluorescent Protein-) (Quantum Biotechnologies) ；Texas Red ；Texas Red-X conjugate ； Thiadicarbocyanine (DiSC3)；噻嗪紅 R(Thiazine Red R)；噻唑橘(Thiazole Orange)；硫代黃素 5(Thioflavin 5)；硫代黃素 S (Thioflavin S)；硫代黃素 TCN(Thioflavin TCN)； Thiolyte ；噻唑橘(Thiozole Orange) ；Tinopol CBS (CalcofIuor White) ；TMR ；TO-PRO-1 ；T0-PR0-3；T0-PR0-5 ；T0T0-1 ；T0T0-3 ；TriColor(PE-Cy5) ；TRITC (TetramethylRodami neIsoThioCyanate) ；True Blue ；TruRed ；Ultralite ；Uranine B ；Uvitex SFC ；Wff 781 ； X-Rhodamine ；XRITC ；Xylene Orange ；Y66F ；Y66H ；Y66W ；Y0-PR0-1 ；Y0-PR0-3 ；Y0Y0-1 ；螯合染料(interchelating dyes),例如 Y0Y0-3、Sybr Green、Thiazole orange ；Alexa Fluor 染料系列(來自Molecular Probes/Invitrogen)之成員，其覆蓋廣泛的光譜且并符合一般激發(fā)源的主要輸出波長，例如 Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、430、488、500、514、 532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700 與 750 ；Cy 染料熒光團(tuán)系列(GE Healthcare)的成員，也覆蓋一寬的光譜，例如 Cy3、Cy;3B、Cy3. 5、Cy5、Cy5. 5、Cy7 ；Oyster 染
14料熒光團(tuán)(Denovo Biolabels)的成員，例如 0yster_500、-550、-556、645、650、656 ；DY-標(biāo)記系列(Dyomics)的成員，例如，具有自(DY-415)至844nm(DY-831)的最大吸收范圍，例
如 DY-415、--495、--505、--547、-548、-549、-550、--554、--555、--556、--560、-590、-610、-615、-630、-631,-632,-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680,-681,-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780
、-781、-782、-831、-480XL、-481XL、-485XL、-510XL、-520XL、-521XL ；ATTO 系列之熒光標(biāo)記 (ATTO-TEC GmbH)的成員，例如ATT0390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610 、611X、620、633、635、637、647、647N、655、680、700、725、740 ；CAL Fluor 系列或 Quasar 系列之染料(Biosearch Technologies)的成員，例如 CAL Fluor Gold 540XAL Fluor Orange 560>Quasar 570>CAL Fluor Red 590XALFluor Red 610、CAL Fluor Red 635>Quasar 670 ；量子點(diǎn)，例如 EviTags 系列(Evident Technologies)之量子點(diǎn)或 Qdot 系列(Invitrogen) 之量子點(diǎn)，例如 Qdot5^、Qdot565、Qdot585、Qdot605、Qdot655、Qdot705、Qdot 800 ；熒光素 (fluorescein)；羅丹明(rhodamine)；及 / 或藻紅蛋白(phycoerythrin)；或其組合。在一些實(shí)施例中，提供至少一個(gè)生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，而生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)于一實(shí)體，例如分析物、試劑或反應(yīng)產(chǎn)物存在下產(chǎn)生光。例如，可使用生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來偵測產(chǎn)生于使用合成反應(yīng)之定序中的焦磷酸鹽(pyrophosphate)(于下方更詳細(xì)討論)；來偵測金屬例如鐵或銅，藉由它們之光產(chǎn)生反應(yīng)的催化；或來測量結(jié)合至分析物之試劑的量，其中試劑包括至少一個(gè)生物或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的組成。本技術(shù)領(lǐng)域中已知之生物發(fā)光系統(tǒng)的例子包括含有至少一個(gè)冷光酵素 (Iuciferase)的系統(tǒng)，例如螢火蟲冷光酵素，包括北美螢火蟲(Photinus pyralis)冷光酵素?？墒褂蒙锇l(fā)光系統(tǒng)，例如藉由提供冷光酵素、ATP硫化酶、冷光素(Iuciferin)與腺苷-5'-磷酸硫酸酐(adenosine 5'phosphosulfate)連同合成反應(yīng)之定序的成分(于其中可以類似物，如dATP α S來取代dATP以避免起因于冷光酵素消耗dATP之非專一的光) 來偵測焦磷酸鹽。當(dāng)焦磷酸鹽系藉由核苷酸合并狀況產(chǎn)生時(shí)，ATP硫化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐依賴方式下產(chǎn)生ATP。藉由冷光酵素，ATP驅(qū)動(dòng)冷光素轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸涔馑丶由瞎狻?其它發(fā)光系統(tǒng)包括根據(jù)發(fā)光蛋白質(zhì)(photoprotein)，例如埃奎林(aequorin)的系統(tǒng)，發(fā)光蛋白質(zhì)使coelenterazine氧化成激發(fā)態(tài)之coelenteramide，而使其發(fā)射光線?；瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)的例子包括魯米諾(luminol)加上過氧化氫，其可在金屬催化劑或輔助氧化劑存在下經(jīng)歷一光發(fā)射反應(yīng)；草酸二苯酯(diphenyl oxalate)加上過氧化氫與一適合之染料，其可在產(chǎn)生二氧化碳的多步驟反應(yīng)中經(jīng)歷激發(fā)與光放射(適合之染料的例子包括,苯代蒽衍生物(phenylated anthracene derivatives)，例如 9，10-二苯基蒽(9， 10-diphenylanthracene)、9，10-雙苯乙塊基惠(9, IO-Bis (phenylethynyl) anthracene) 與 1-氯 _9，10-二苯乙炔基蒽(l-Chloro-9，10-bis (phenylethynyl) anthracene)，與羅丹明(rhodamines)，例如羅丹明6G與羅丹明B)；單態(tài)氧(singlet oxygen)產(chǎn)生系統(tǒng)，例如過氧化氫加上次氯酸鈉(sodium hypochlorite)；以及包含酵素，例如山葵過氧化酵素 (horseradish peroxidase)的系統(tǒng)，酵素作用于魯米諾或其它市售可得受質(zhì)。在本發(fā)明之一些實(shí)施例中，其方法包括，例如在試劑或分析物與表面或標(biāo)簽之間形成共價(jià)附著。例如，在單一分子定序程序中，可將一核酸分子或一酵素，例如聚合酶附著至一表面，例如一玻璃載片。此種附著可允許在多復(fù)位序循環(huán)期間之?dāng)?shù)據(jù)的獲得。在一些實(shí)施例中，形成例如，試劑至表面或標(biāo)簽之共價(jià)附著的許多方法，為本技術(shù)領(lǐng)域所已知。也可使用非共價(jià)附著方法。也可使用一些不同的化學(xué)修飾劑(chemical modifier)以促進(jìn)附著形成?；瘜W(xué)修飾劑的例子包括N-羥基丁二硫亞氨(N-hydroxy succinimide, NHS)基團(tuán)、胺(amine)、醛類(aldehyde)、環(huán)氧樹脂化合物(印oxide)、羧基(carboxyl)基團(tuán)、羥基 (hydroxyl)基團(tuán)、酉f 月井(hydrazides)、疏水(hydrophobic)基團(tuán)、薄月莫(membranes)、馬林醯亞胺(maleimide)、生物素(biotin)、鏈抗生物素蛋白(str印tavidin)、硫醇(thiol)基團(tuán)、鎳螫合物(nickel chelate)、光反應(yīng)性(photoreactive)基團(tuán)、硼(boron)基團(tuán)、硫酯 (thioester)、半胱氨酸(cysteine)、雙硫(disulfide)基團(tuán)、烷基(alkyl)與?；?acyl) 鹵化物(halide)基團(tuán)、麩胱甘肽(glutathione)、麥芽糖(maltose)、疊氮化物(azide)、磷酸鹽(phosphate)與磷化氫(phosphines)。一些具有修飾的表面，例如具有化學(xué)修飾表面之玻璃載片為市售可得。具有其它修飾的表面可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法來制備(Microarray Biochip Technologies, Mark Schena, Editor, March 2000, Biotechniques Books)。在一些實(shí)施例中，藉由使用一適合之修飾劑的組合(例如，親電子修飾劑(electrophilic modifier)與親核修飾劑(nucleophilic modifier))可于兩個(gè)實(shí)體間形成附著，其中各實(shí)體包括至少一個(gè)修飾劑。在一實(shí)施例中，藉由使用存在于實(shí)體與其它實(shí)體之自然發(fā)生基團(tuán)之一上的化學(xué)修飾劑，于兩實(shí)體間形成附著，自然發(fā)生基團(tuán)，例如胺或硫氫基(sulfhydryl)。在一些實(shí)施例中，使用與胺反應(yīng)的修飾劑。此反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)為其可為快速并避免毒性副產(chǎn)品的產(chǎn)生。此類修飾劑的例子包括NHS-酯(NHS-ester)、醛類、環(huán)氧樹脂化合物、鹵化?；c硫酯。大多數(shù)蛋白質(zhì)、勝肽、糖肽(glycop印tides)等具有自由胺基團(tuán)，其可與此類修飾劑反應(yīng)以將它們共價(jià)連結(jié)至這些修飾劑。也可合成具有內(nèi)部或末端胺基團(tuán)的核酸探針，且其為市售可得(例如來自IDT或Operon)。因此，使用相似之化學(xué)成分，可將生物分子結(jié)合(例如共價(jià)或非共價(jià))至標(biāo)簽、表面或其它的試劑?？墒褂靡恍┢渌喙倌芑宦?lián)試劑來將一種修飾劑的化學(xué)反應(yīng)性轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N。 這些基團(tuán)可為雙官能基、三官能基、四官能基等。它們也可為同官能基(homo-functional) 或異官能基(hetero-fimctional)。一雙官能基交聯(lián)劑為X-Y-Z，其中X與Z為兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，且Y為一連接器(linker)。此外，若X與Z為相同基團(tuán)，例如NHS-酯，所產(chǎn)生之交聯(lián)劑，NHS-Y-NHS，為一同-雙-官能基交聯(lián)劑，且可連結(jié)各包括一胺的兩個(gè)實(shí)體。若X 為NHS-酯且Z為馬來酰亞胺(maleimide)基團(tuán)，所產(chǎn)生之交聯(lián)劑，NHS-Y-馬來酰亞胺， 為一異-雙-官能基交聯(lián)劑且可連結(jié)一包括一胺的實(shí)體及一包括一硫基的實(shí)體。具有一些不同官能基的交聯(lián)劑為廣泛可得。此類官能基的例子包括NHS-酯、硫酯、烷基鹵化物、?；u化物(例如，碘乙酰胺(iodoacetamide))、硫醇、胺、半胱氨酸、組胺酸、雙硫、 馬來酰亞胺、順二醇(cis-diols)、硼酸(boronic acid)、氫氧胺酸(hydroxamic acid)、 疊氮化物、聯(lián)氨(hydrazine)、磷化氫、光反應(yīng)性基團(tuán)(例如，蒽醌(anthraquinone)、二苯甲酮(benzophenone))、丙烯酰胺(acrylamide)(例如，acrydite)、親合基團(tuán)(例如， 生物素、鏈抗生物素蛋白、麥芽糖、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、麩胱甘肽、麩胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (glutathione-S-transferase))(carboxylic acid)
(例如，苯基(phenyl)、膽固醇(cholesterol))等。其它修飾劑的選擇(例如光交聯(lián)與熱交聯(lián))為本技術(shù)領(lǐng)域人士所知。市售可得的技術(shù)包括，例如來自 Mosiac Technologies (ffaltham, MA), EXIQONTM(Vedbaek, Denmark), Schleicher and Schuell(Keene, N. H.),Surmodics TM(St. Paul, MN),XENOPORE TM(Hawthorne, N. J. ), Pamgene(Netherlands)，Eppendorf(Germany), Prolinx(Bothell, WA)，Spectral Genomics (Houston, TX)，and COMBIMATRIXTM(Bothel 1, WA)的那些。在一些實(shí)施例中，提供除了玻璃以外之表面。例如，也可使用金屬表面，如金、硅、 銅、鈦、鋁、金屬氧化物(如氧化硅、氧化鈦、氧化鐵)或塑料(如聚苯乙烯(polystyrene) 與聚乙烯(polyethylene))、沸石(zeolite)或其它材料。在一些實(shí)施例中，為了允許光的傳送，這些材料層可以是薄的，例如小于約lOOnm。3. 1核酸偵測可使用與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置成為一部份系統(tǒng)用在分子偵測或分子偵測之方法或制程中，而分子偵測，例如核酸定序。此裝置及利用其之方法與制程對于，例如分析與診斷應(yīng)用為有用的。這些應(yīng)用可為個(gè)人的、公眾的、商業(yè)的或工業(yè)的。可以廣泛變化之定序形式來使用與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置，且與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置可適合將單一分子進(jìn)行定序。另外，與現(xiàn)行生物芯片組件相較，與本發(fā)明一致之偵測裝置具有經(jīng)簡化之設(shè)計(jì)、裝配及制造。例如，可將要被定序之核酸附著于數(shù)組上之隨機(jī)的連結(jié)位，避免對于在預(yù)定位置沈積或合成核酸之時(shí)間消耗與昂貴機(jī)器的使用。可使用與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置為在生物分子偵測之方法與程序中之一系統(tǒng)的部分，包括核酸雜合或?qū)τ?，例如整個(gè)基因體定序之定序、轉(zhuǎn)錄表現(xiàn) (transcriptional profiling)、競爭轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)或基因鑒定。生物分子偵測也可包括結(jié)合相互作用，例如蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、抗體/抗原、受器/配體及核酸/蛋白質(zhì)之偵測及/或測量。 這些應(yīng)用對于分析與診斷程序與方法為有用的。適合于本發(fā)明實(shí)施例提供之裝置所偵測之核酸，于一些實(shí)施例中，為連結(jié)分子之一部分，其將一適合于分析結(jié)合相互作用之分子，例如蛋白質(zhì)、其它核酸、碳水化合物部分或小分子附著至本發(fā)明實(shí)施例所提供之組件上的連結(jié)位。在一些實(shí)施例中，連結(jié)分子可更包括一捕獲分子，其由于結(jié)合之相互作用與要被分析之分子結(jié)合。在一連結(jié)分子中之核酸， 藉由，例如直接定序或雜合，作為連結(jié)分子之捕獲分子的一鑒定標(biāo)簽。本發(fā)明實(shí)施例所提供之方法可包括將要被偵測之分子附著于本發(fā)明實(shí)施例所提供之偵測系統(tǒng)一地址數(shù)組(address array)的一步驟。在一些實(shí)施例中，地址數(shù)組可包括具有多數(shù)個(gè)針孔之遮蔽薄板，與可形成在針孔中或環(huán)繞針孔之連接位。若各片段為，例如 1000堿基長，一單一組件可獲得數(shù)千兆位(bit)之序列資料，而使整個(gè)基因體之定序與再定序(resequencing)成為可能。3. 1. 1要被偵測之分子適合以本發(fā)明實(shí)施例所提供之方法來偵測之核酸可包括任何核酸，包括，例如 DNA、RNA或PNA (ρ印tide nucleic acid (勝肽核酸))，且可含有任何序列-已知與未知， 包括自然發(fā)生或人工序列。核酸可被自然取得、重組產(chǎn)生或化學(xué)合成。核酸可包括自然發(fā)生核苷酸、不存在于自然之核苷酸類似物或經(jīng)修飾之核苷酸?；趯?shí)際應(yīng)用，被偵測之核酸長度可多樣化。在一些實(shí)施例中，核酸包括至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、 10000、20000個(gè)堿基或更多。在一些實(shí)施例中，核酸可為自10至20、自10至50、自10至 100、自 50 至 100、自 50 至 500、自 50 至 1000、自 50 至 5000、自 500 至 2000、自 500 至 5000，或自1000至5000個(gè)堿基。用以偵測之核酸可為單股。單股核酸模板可來自一雙股核酸模板，藉由本技術(shù)領(lǐng)域所知的方法，例如加熱或堿或其它化學(xué)處理。藉由例如化學(xué)或irwitro合成，也可產(chǎn)生單股核酸模板。在一些實(shí)施例中，要被偵測之核酸于其5’或3’端附著一連結(jié)位。在一些實(shí)施例中，核酸可更包括一或多個(gè)與核酸之5’端、3’端或5’端與3’端兩者結(jié)合之末端連結(jié)引子。 在特別的實(shí)施例中，一末端連結(jié)引子附著至核酸之3’端?？墒褂媚┒诉B結(jié)引子來將要被偵測之核酸附著于在組件上之連結(jié)位，并提供一對于一或多個(gè)偵測之引子之互補(bǔ)序列，例如一定序引子。3. 1. 1. 1末端連結(jié)引子末端連結(jié)引子為短的核酸分子，通常由少于100個(gè)核苷酸所組成。在一些實(shí)施例中，末端連結(jié)引子之長度為至少5、10、15、20、25、30、50、75、90個(gè)核苷酸或更多。在特定實(shí)施例中，末端連結(jié)引子之長度為自8至25、自10至20、自10至30，或自10至50個(gè)核苷酸。 在一些實(shí)施例中，末端連結(jié)引子為未經(jīng)分支的，然而，在其它實(shí)施例中，其可為經(jīng)分支的?？墒褂媚┒诉B結(jié)引子來將要被偵測之核酸附著至于位置數(shù)組上之連結(jié)位。在一些實(shí)施例中，末端連結(jié)引子可將核酸直接地連結(jié)至數(shù)組表面，例如藉由共價(jià)連結(jié)(例如酯 (ester)或硫醇(thiol)連結(jié))或非共價(jià)連結(jié)，例如抗原/抗體或生物素(biotin)/抗生物素蛋白(avidin)結(jié)合。在一些實(shí)施例中，末端連結(jié)引子可將核酸非直接地連結(jié)至數(shù)組表面，例如藉由與一居中分子(intermediate molecule)結(jié)合，而居中分子，例如一聚合酶。 因此，末端連結(jié)引子可包含經(jīng)修飾之核酸或以其它方式修飾以協(xié)助附著至一連結(jié)位，藉由本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，例如，雙硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯或酯連結(jié)；或藉由，例如抗體/抗原，或生物素/抗生物素蛋白結(jié)合，例如末端連結(jié)引子可包含一包括一抗原區(qū)域之核苷酸或一經(jīng)生物素化(biotinylated)之核苷酸。在特別的實(shí)施例中，一經(jīng)修飾之核苷酸可位于一末端連結(jié)引子之3’端上。在一些實(shí)施例中，一末端連結(jié)引子之5’端可包含一經(jīng)修飾之核苷酸。末端連結(jié)引子也可做為一用以偵測核酸之一或多個(gè)引子的互補(bǔ)物(complement)， 例如，一定序序列。在一些實(shí)施例中，引子系可藉由雜合來偵測核酸，例如，弓丨子包含一可偵測之標(biāo)記，例如一熒光標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，末端連結(jié)引子的5’端可包括與一定序引子互補(bǔ)之序列。在一些實(shí)施例中，與定序引子互補(bǔ)之末端連結(jié)引子系可被定位以使定序弓I子之3’端直接與要被定序之核酸中的第一個(gè)核苷酸鄰接。在一些實(shí)施例中，藉由一連接酶(Iigase)，例如一 DNA連接酶可將末端連結(jié)引子加至要被偵測之核酸的末端。在一些實(shí)施例中，在連接(ligation)前，末端連結(jié)引子與要被偵測之核酸兩者皆為單股。在其它實(shí)施例中，兩者皆為雙股。在另外其它實(shí)施例中，一者可為單股，而另一者可為雙股。連接為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知。例如，在聚合群落定序方法 (polony sequencing method)中，Shendure et al. (Science, 309 :1728-1732(2005))以新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(New England Biolab', NEB)快速連接套組(Quick Ligation kit)將一 T30末端連結(jié)引子(32bp)連結(jié)至一樣本DNA片段。其中，連結(jié)反應(yīng)溶液包括0. ^pMole 之DNA、0.8pMole之T30末端連結(jié)引子、4.0μ 1 Τ4 DNA連接酶于1 X快速連接緩沖溶液 (Quick Ligation buffer)中。于混合后，于室溫培養(yǎng)反應(yīng)溶液約10分鐘，且之后置于冰上。藉由將樣本加熱至65°C，10分鐘來停止連接反應(yīng)。在其它實(shí)施例中，可將末端連結(jié)引子合成于要被偵測之核酸上。例如，末端連結(jié)引子可為一藉由例如末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)所加入之均聚物(homopolymer)。 例如，Harris et al. (Science, 320 :106-109(2008))將一多腺嘌呤尾巴(poly A tail)加至DNA模板，其做為于一病毒基因體之單一分子定序中之一多胸腺嘧啶(poly Τ)定序引子的互補(bǔ)物。3. 1.1. 2 定序引子一定序引子為一與要被偵測之核酸片段或其連結(jié)的末端連結(jié)引子互補(bǔ)之單股寡核苷酸。在一些實(shí)施例中，定序引子的長度為至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50個(gè)核苷酸或更多。在特定實(shí)施例中，定序引子之長度可為自8至25、自10至20、自10至30，或自 10至50個(gè)核苷酸。定序引子可由任何形式之核苷酸所形成，包括自然發(fā)生核苷酸、不存在于自然之核苷酸類似物或經(jīng)修飾之核苷酸。在特定實(shí)施例中，在一定序引子與包括一或多個(gè)末端連結(jié)分子之要被定序的核酸雜合后，可修飾定序引子之5’端，以促進(jìn)其與位置數(shù)組上之一連結(jié)位結(jié)合。在一些實(shí)施例中，一定序引子可包含經(jīng)修飾之核苷酸，例如鎖核酸(locked nucleic acid, LNA)(經(jīng)修飾之核糖核甘酸，其在一聚核酸(polynucleic acid)中提供增強(qiáng)之堿基堆疊相互作用(base stacking interaction)) 0如鎖核酸之效用解說，Levin et al. (Nucleic Acid Research 34(20) :142(2006))顯示一含鎖核酸之引子具有經(jīng)改善之專一性及顯示較強(qiáng)之結(jié)合相對于對應(yīng)之未鎖引子(unlocked primer)。制造MCPl引子 (5，-cttaaattttcttgaat-3')之三種變化，包含3個(gè)鎖核酸核苷酸(于蓋(cap)中)于引子中之不同位置MCPl-LAN-3，(5，-cttaaattttCtTgaAt-3，) ；MCP1-LAN-5，(5，-CtTaAatt ttcttgaat-3')；與 MCPl-LAN_even(5，-ctTaaatTttctTgaat-3，)。所有經(jīng)鎖核酸取代之引子具有提高之熔解溫度(melting temperature，Tm)，而MCP1-LNA-5，引子顯示特別提高之定序準(zhǔn)確度(Phred Q30 counts)。因此，在特別的實(shí)施例中，定序引子可包含至少一鎖核苷酸于其5’端區(qū)域，即，定序引子之5’端一半、三分之一或四分之一。在被提供至與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測裝置前，可將定序引子與單股樣本核酸 (即，一包括至少一末端連結(jié)引子之要被偵測的核酸)雜合。可將定序引子與樣本核酸雜合，藉由將樣本核酸與一莫耳過剩(molar excess)之定序引子混合于一含鹽溶液中，例如 5 X SSC (或 5 X SSPE) ,0. 1% Tween 20 (或 0. 1 % SDS)與 0. 1 % BSA 緩沖溶液?？蓪⒒旌衔锛訜?5°C至少5分鐘且緩慢冷卻至室溫以允許引子/模板黏合。藉由適合之方法可將殘余之引子去除，例如一分子篩(molecular sieve)。藉由適合的方法，包括序列之視覺檢閱或計(jì)算機(jī)協(xié)助之引子設(shè)計(jì)，可設(shè)計(jì)引子，包括末端連結(jié)與定序引子兩者。許多軟件套組為可用來協(xié)助引子設(shè)計(jì)，包括 DNAStarTM(DNAstar, Inc. ， Madison, WI) 、 0LIG0 4. 0(National Biosciences, Inc.)> Vectoe NTI (Invitrogen) >Primer Premier 5 (Premierbiosoft)與 Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。引子設(shè)計(jì),考慮到例如,要被定序之分子、專一性、長度、所需的熔解溫度、二級結(jié)構(gòu)、引子二聚體、GC含量、緩沖溶液的pH與離子強(qiáng)度及所使用之酵素(即，聚合酶或連接酶)。參見，例如Jos印h Sambrook and David Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory
19Press,3rd edition(2001)。3. 1. 1. 3結(jié)合至數(shù)組表面在將定序弓I子與包括一或多個(gè)末端連結(jié)引子之要被定序的核酸黏合后，制備此復(fù)合物于一合適的緩沖溶液中、將其提供至一位置數(shù)組的表面并允許其結(jié)合。在一些實(shí)施例中，可將樣本核酸(要被偵測之核酸與一或多個(gè)末端連結(jié)引子)附著至連結(jié)位，且之后可提供定序或偵測引子。在其它實(shí)施例中，在被提供至一組件之前，可先將復(fù)合物進(jìn)行雜合。只有一個(gè)核酸樣本結(jié)合之連結(jié)位被了解為有效位置。在特定實(shí)施例中，提供復(fù)合物至偵測系統(tǒng)且樣本核酸附著至在位置數(shù)組上之隨機(jī)的連結(jié)位。在其它實(shí)施例中，可提供樣本核酸至在位置數(shù)組上之預(yù)定的連結(jié)位，藉由適合的方法，例如藉由機(jī)器或液體處理系統(tǒng)。將核酸附著至一固體支持物之適合的方法為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知。在一些實(shí)施例中，可將樣本核酸直接附著至一連結(jié)位，藉由共價(jià)連結(jié)，例如雙硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯或酯連結(jié)；或藉由非共價(jià)連結(jié)，例如抗體/抗原，或生物素/抗生物素蛋白結(jié)合。在一些實(shí)施例中，藉由一介于中間的分子可將樣本核酸附著至一連結(jié)位。在一些實(shí)施例中，介于中間的分子可為一聚合酶，例如一 DNA聚合酶。如一直接、共價(jià)之核酸附著的說明例子，Adeesi et al. (Nucleic Acid Research, 28 :87(2000))修飾一引子的5，端以包括一 SH官能基。根據(jù)Adeesi et al.之方法，可制備一核酸于 50 μ M磷酸緩沖鹽(PBS) (NaPi :0. IM NaH2P04pH 6. 5,0. IM NaCl)中。之后可將 1-5 μ 1之引子溶液提供至一經(jīng)鹽化之玻璃載片，且將其培養(yǎng)于一濕度控制盒于室溫中約5 小時(shí)以使引子結(jié)合至芯片表面。在結(jié)合反應(yīng)完成后，以PBS溶液于室溫震動(dòng)清洗兩次，每次 5分鐘，以移除未結(jié)合之DNA。在清潔后，將IOmM β -硫氫乙醇(β -mercaptoethanol)加至一 PBS溶液且于室溫下用來沖洗位置數(shù)組，以將未結(jié)合之DNA的硫醇基去活化。再來，清洗數(shù)組表面，例如一次以5XSSC、0. Tween與一次以5XSSC緩沖溶液。因此，在一些實(shí)施例中，Adeesi et al.所使用之方法可使用于本發(fā)明所提供之方法中以將樣本核酸復(fù)合物， 例如經(jīng)由一定序引子或樣本核酸之5’端附著至一連結(jié)位。在一替代實(shí)施例中，樣本核酸可包括，例如一經(jīng)生物素化之核苷酸，且可與在連結(jié)位表面上之抗生物素蛋白結(jié)合。在另一實(shí)施例中，樣本核酸可包括一抗原部分，例如BrdU 或洋地黃毒(digoxigenin)，其藉由一抗體(或其片段)被結(jié)合于連結(jié)位上。藉由“抗體”， 可以了解的是，此措辭包括免疫球蛋白分子之片段，包括，例如一或多個(gè)CDR區(qū)；或可變之重或可變之輕片段?？贵w可為自然發(fā)生、重組或合成?？贵w也可包括，例如多株(polyclone) 與單株(monoclone)變形。在一些實(shí)施例中，抗體以至少106、107、108、109M或更高之結(jié)合常數(shù)(association constant)結(jié)合至其抗原?？贵w之結(jié)構(gòu)、功能與產(chǎn)生為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知。參見，例如 Gary Howard and Matthew Kasser, Making and Using Antibodies :A Practical Handbook CRC Press ；1st edition(2006)。在又另一實(shí)施例中，藉由一聚合酶，例如DNA聚合酶，可將樣本核酸附著至連結(jié)位。熟悉此技藝人士可理解，為了保留酵素功能，可得之信息，例如酵素之一級、二級與三級結(jié)構(gòu)應(yīng)被考慮。例如，Taq與拖口9聚合酶之結(jié)構(gòu)為本技術(shù)領(lǐng)域所知，分別參見Kim et al. ,Nature, 376 :612-616(1995)與 Kamtekar et al.，Mol. Cell，16 :609-618 Q004)。將一聚合酶固定至一表面，而保持活性之方法為本技術(shù)領(lǐng)域所知，且敘述于，例如美國專利公開號 2008/0199932，公開于 2008 年 8 月 21 日與 Korlach et al. PNAS105 :1176-1181 (2008)。
在一些實(shí)施例中，一連結(jié)位之經(jīng)乙醛(aldehyde)修飾之表面系以含乙醛之硅烷 (silane)試劑處理。乙醛很快地與在蛋白質(zhì)上之一級胺反應(yīng)以形成一 khiff’ s堿基連結(jié)。由于除了一般于NH2端之更加反應(yīng)性的α-胺外，很多蛋白質(zhì)顯露離胺酸于其表面上， 所以其可以各種之方向附著至載片，以允許蛋白質(zhì)之不同側(cè)與于溶液中之其它蛋白質(zhì)或小分子反應(yīng)。在另一實(shí)施例中，藉由UV光活化(photoactivation)，一光NHS(photoNHS) (一 N-羥基琥珀酰亞胺羧酸鹽分子(N-hydroxy succimido carboxylate)以一碳鏈連結(jié)器(linker)，連結(jié)至一疊氮硝基苯(azidonitrobenzene))可附著至一于組件上之經(jīng)胺修飾之表面。在這些實(shí)施例中，藉由消除氮，UV光激起一疊氮硝基苯部分以產(chǎn)生高反應(yīng)性氮烯(nitrene)。氮烯立即與組件表面上之NH2反應(yīng)以形成一聯(lián)氨(hydrazine)鍵。連結(jié)器之另一端為NHS羧酸鹽，其與聚合酶表面上之離胺酸反應(yīng)以產(chǎn)生一酰胺共價(jià)鍵。在另一實(shí)施例中，于緩沖環(huán)境下，NHS羧酸鹽部分可與組件表面上之一級胺反應(yīng)。UV光用來活化一疊氮硝基苯部分且形成一高反應(yīng)性氮烯為一電子不足基團(tuán)(electron deficient group)且立即與聚合酶表面上之離胺酸殘基的一級胺反應(yīng)。3. 1.2定序形式本發(fā)明一實(shí)施例所提供之偵測裝置與方法可用來偵測與定序核酸，藉由本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，如回顧于，例如美國專利號6，946,249與Siendure et al.，Nat. Rev. Genet. 5 :335-44(2004).定序形式可選自本技術(shù)領(lǐng)域已知之單一分子定序方法。在一些實(shí)施例中，定序方法可依靠DNA聚合酶或DNA連接酶的專一性，且包括，例如堿基延伸定序(base extension sequencing)(單一喊基逐步延伸(single base stepwise extension))、藉由合成之多堿基定序(包括，例如以經(jīng)末端標(biāo)記之核苷酸來定序)與擺動(dòng)定序(wobble sequencing)，其為根據(jù)連結(jié)。此方法一般包括提供一樣本核酸，其可包括至少一末端連結(jié)引子?？蓪⒑怂岣街烈换|(zhì)(substrate)(直接或間接)，例如于一連結(jié)位。 核酸可被以單股形式提供，或藉由例如化學(xué)或熱變性使其成為單股。之后定序開始實(shí)施于一定序引子(連接酶定序一般指錨定引子(anchor primer)，其對定序引子提供類似物用途)。對于單一分子定序形式而言，可提供再定序單一分子的優(yōu)點(diǎn)。例如，于定序讀取完成后，可將定序引子與經(jīng)延伸之核苷酸自樣本核酸刪除、清洗組件并重復(fù)定序。在各種實(shí)施例中，藉由相同或不同方法可重新執(zhí)行再定序。藉由將相同分子再定序，預(yù)期定序錯(cuò)誤會下降成定序讀取次數(shù)之次方。例如，若單次讀取每個(gè)堿基之錯(cuò)誤為10-3，之后在兩次讀取后， 其下降成(10-3)2，即，10-6。此為單一分子定序之特別的優(yōu)點(diǎn)，由于用以定序之經(jīng)修飾的核苷酸可失去其標(biāo)記或阻礙基團(tuán)產(chǎn)生，例如假的刪除?！愣裕趩我环肿佣ㄐ蛑?，將要被定序之附著至一基板，且與引子接觸。例如， 藉由執(zhí)行至少一酵素催化聚合或連接反應(yīng)來修飾引子。至少一反應(yīng)引起光的發(fā)射，光的發(fā)射與核酸所包括之至少一堿基之特性相關(guān)?？衫斫狻耙稹惫獾陌l(fā)射系指至少一反應(yīng)導(dǎo)致至少一情況，于此情況下，發(fā)生了與核酸所包括之至少一堿基之特性相關(guān)的光發(fā)射；此發(fā)生可經(jīng)由與激發(fā)光、一化學(xué)或生物發(fā)光系統(tǒng)等交互作用。至少一情況可為，例如，熒光團(tuán)與至少一反應(yīng)的產(chǎn)物的合并，或焦磷酸鹽的釋放。因此，光可藉由或不藉由外部激發(fā)來產(chǎn)生。例如， 可藉由包括共價(jià)連結(jié)偵測標(biāo)簽與一阻礙基團(tuán)之可逆終止物堿基類似物來執(zhí)行單分子定序， 以避免任何二次延伸，其中在已將類似物加至引子后，激發(fā)類似物，且在加入后移除標(biāo)簽與
21阻礙基團(tuán)以允許另一循環(huán)之延伸，而共價(jià)連結(jié)偵測卷標(biāo)，例如一熒光卷標(biāo)?；蛘?，可藉由提供一化學(xué)或生物發(fā)光系統(tǒng)而不以外部激發(fā)來偵測一延伸步驟之產(chǎn)物，例如焦磷酸鹽，而化學(xué)或生物發(fā)光系統(tǒng)以焦磷酸鹽依賴方式發(fā)射光。這些與其它形式于以下被更詳細(xì)討論。發(fā)射之光與核酸所包括之至少一堿基的特性相關(guān)。在一些實(shí)施例中，關(guān)連性可為暫時(shí)的，例如光的發(fā)射時(shí)間指出至少一堿基的特性，例如為當(dāng)提供不同堿基類似物于在不同次之聚合反應(yīng)中使用的例子。在一些實(shí)施例中，關(guān)連性可為光譜的，例如發(fā)射光之光譜指至少一堿基的特性，例如為當(dāng)提供包括不同熒光團(tuán)之不同的堿基類似物在一聚合反應(yīng)中使用的例子。在一些實(shí)施例中，單一分子核酸定序包括多復(fù)位序循環(huán)?？梢岳斫庖欢ㄐ蜓h(huán)意指，為了在第一堿基被鑒定后鑒定核酸所包括之至少一第二個(gè)堿基，將引起與至少一堿基特性相關(guān)之光的發(fā)射的狀況重復(fù)。因此，在根據(jù)本發(fā)明之包括單一分子核酸定序的方法中， 單一分子核酸定序可包括至少一特定數(shù)目之定序循環(huán)，其引起至少一特定數(shù)目之光的發(fā)射，光共同關(guān)于核酸所包括之至少特定數(shù)目的堿基的特性，且方法包括鑒定由核酸所包括之至少一特定數(shù)目之堿基。在一些實(shí)施例中，特定數(shù)目可為，例如2、3、4、5、10、20、50、100、 200 或 500。定序方法可包括測定由核酸所包括之一或多個(gè)堿基的特性。在根據(jù)本發(fā)明之一些實(shí)施例中，于其中執(zhí)行單一分子核酸定序引起光之發(fā)射，光系以包括至少一第一光學(xué)傳感器與一第二光學(xué)傳感器的至少一個(gè)光偵測器來偵測，且來自至少兩個(gè)光學(xué)傳感器的輸出訊號被處理，可藉由比較該處理之至少一結(jié)果與對應(yīng)至至少一已知類型之至少一已知結(jié)果來測定由一核酸所包括之至少一堿基的特性。例如，處理之一結(jié)果可指出一反應(yīng)所發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)；當(dāng)發(fā)射之光暫時(shí)與由核酸所包括之至少一堿基的特性相關(guān)時(shí)，可使用此時(shí)間點(diǎn)來鑒定由核酸所包括之至少一堿基。在另一實(shí)施例中，處理之結(jié)果可為一熒光團(tuán)與一反應(yīng)之產(chǎn)物合并的測定；當(dāng)發(fā)射之光與核酸所包括之至少一堿基的特性光譜相關(guān)時(shí)，可使用此測定以鑒定核酸所包括之至
少一堿基。3. 1. 2. 1堿基延伸定序逐步延伸在一些實(shí)施例中所提供之偵測裝置可用來偵測在堿基延伸定序時(shí)所產(chǎn)生的。在一些實(shí)施例中，藉由將包括一要被定序之單股核酸、一與要被定序之單股核酸之3’端結(jié)合之末端連結(jié)引子與黏合至其之一定序引子的一部份雙重復(fù)樣本核酸附著至一連結(jié)位來開始堿基延伸定序，如圖6中所示。在一些實(shí)施例中，聚合酶與經(jīng)修飾之核苷酸之后可被提供至光偵測組件于適合之緩沖溶液中。在一些實(shí)施例中，藉由在連結(jié)位之聚合酶，可將樣本核酸復(fù)合物附著至連結(jié)位。在一些實(shí)施例中，核苷酸可包括一共價(jià)連結(jié)之可偵測標(biāo)記，例如一熒光標(biāo)記，與一阻礙基團(tuán)以避免任何二次延伸。因此，在一單一核苷酸加入至定序引子之3’ 端之后，定序中斷。一堿基延伸反應(yīng)之一實(shí)施例的第一步驟中，可將具有熒光阻礙基團(tuán)之核苷酸藉由 DNA聚合酶加至定序引子之3’端。在一些實(shí)施例中，熒光標(biāo)記可扮演阻礙基團(tuán)。在其它實(shí)施例中，它們可為分開之部分。一單一核苷酸可合并于定序引子之3’端，且藉由其之標(biāo)記以對應(yīng)之光偵測器來鑒定。之后移除熒光標(biāo)記與阻礙基團(tuán)，例如，藉由化學(xué)或酵素分解，以允許堿基延伸之額外循環(huán)。在特定實(shí)施例中，可同時(shí)或連續(xù)地與在任何順序中移除標(biāo)記與阻礙基團(tuán)。藉由編輯堿基加入順序，于3’至5’方向，一次一個(gè)堿基推論出樣本核酸之序列。一般而言，在逐步延伸時(shí)有兩個(gè)方式來辨認(rèn)所加入之核苷酸。于一第一例子中，四種核苷酸可皆具有相同之可偵測標(biāo)記，但以一預(yù)定之順序一次加入一個(gè)。經(jīng)延伸之核苷酸的鑒定藉由于延伸反應(yīng)中所加入之核苷酸的順序來確認(rèn)。在于延伸時(shí)辨認(rèn)經(jīng)整合之堿基的第二模式中，四種不同之核苷酸同時(shí)加入，且各與一有區(qū)別可偵測之標(biāo)記結(jié)合。在不同實(shí)施例中，標(biāo)記之激發(fā)或散發(fā)光譜及/或強(qiáng)度可不同。藉由可偵測標(biāo)記之強(qiáng)度及/或波長(即， 激發(fā)或散發(fā)光譜)來確認(rèn)于延伸中加入之核苷酸強(qiáng)度。3. 1. 2. 2藉由合成之定序多步驟延伸(multi-step extension)在一些實(shí)施例中，藉由合成之定序可藉由多重不中斷延伸(multiple uninterrupted extension)，例如沒有使用阻礙基團(tuán)來執(zhí)行。在這些實(shí)施例中，可藉由偵測在核三磷酸(nucleoside triphosphates)水解后之焦磷酸(pyrophosphate)釋放，S卩，β 與Y磷酸鹽復(fù)合物之釋放，來監(jiān)測聚合反應(yīng)。如上述，可直接偵測復(fù)合物，例如藉由在復(fù)合物上之熒光部分，或間接偵測復(fù)合物，例如，藉由將焦磷酸與一化學(xué)或生物冷光偵測系統(tǒng)結(jié)
I=I ο在一些實(shí)施例中，可藉由使用經(jīng)末端-磷酸鹽標(biāo)記之核苷酸 (terminal-phosphate-labeled nucleotide)將核酸樣本實(shí)際連續(xù)定序。經(jīng)末端-磷酸鹽標(biāo)記之核苷酸與其使用方法之示范實(shí)施例敘述于，例如美國專利號7，361，466與美國專利公開號2007/0141598，公開于2007年6月21日。簡單地說，將核苷酸提供至本發(fā)明實(shí)施例所提供之系統(tǒng)，當(dāng)于聚合期間水解時(shí)，藉由對應(yīng)之光偵測器可偵測經(jīng)標(biāo)記之磷酸鹽。在一些實(shí)施例中，所有之四種核苷酸包括有區(qū)別之標(biāo)記且可被同時(shí)加入。在一些實(shí)施例中，核苷酸可包括無法區(qū)別，即，相同之標(biāo)記，且被以預(yù)定之順序連續(xù)地加入。連續(xù)、循環(huán)的加入具有無法區(qū)別之標(biāo)記之核苷酸，依然允許多重、不中斷聚合步驟，例如于均聚體序列中。3. 1. 2. 3 連接Bl定序(Ligase-Based Sequencing)在其它實(shí)施例中，藉由連接酶定序，可將一樣本核酸于本發(fā)明實(shí)施例所提供之裝置上進(jìn)行定序。連接酶定序方法敘述于，例如美國專利號5，750，341、PCT公開WO 06/073504 與 Shendure et al. Science, 309 :1728-1732(2005)中。在 Shendure et al.的方法中，例如，一未知單股DNA樣本可位于兩個(gè)末端連結(jié)引子的側(cè)面，且固定于一固體支持物上。于未知序列之一特定位置(即，接近于一特定末端連結(jié)引子之nth堿基)，可藉由將一所謂錨定引子(其為一定序引子之類似物)與末端連結(jié)引子黏合，且之后將4個(gè)退化之九聚體的聯(lián)合提供至混合物來檢視。四個(gè)九聚體皆具有可區(qū)別之熒光標(biāo)記，且除了質(zhì)問位置 (query position)其在所有位置皆為退化的，在質(zhì)問位置各九聚體以一可區(qū)別之堿基_A、 C、G或T來質(zhì)問。將樣本清洗、熒光掃瞄且鑒定質(zhì)問之堿基。之后自樣本核酸去除錨定引子與經(jīng)連結(jié)之九聚體、清洗組件且重復(fù)步驟，以質(zhì)問一不同位置。有利地，此方法為非漸次的，g卩，堿基不需依次被質(zhì)問。因此，錯(cuò)誤不會累計(jì)。此外，此方法可自不是5’就是3’方向來質(zhì)問核苷酸，即，不需標(biāo)準(zhǔn)之5’ 一3’ DNA合成。藉由此方法，可通常將總共約13個(gè)堿基之一樣本核酸進(jìn)行定序。3. 1.2. 4 第三代定序(Third-generation sequencing)在一些實(shí)施例中，使用第三代定序，可將一樣本核酸于本發(fā)明實(shí)施例所提供之裝置上進(jìn)行定序。于第三代定序中，將一具有含有許多小( 50nm)孔洞之鋁涂膜的載片作為零模式波導(dǎo)(waveguide)(參見，例如Levene et al.，Science 299, 682-686(2003))。藉由聚磷酸酯化學(xué)(polyphosphonate chemistry)，例如聚乙烯基磷酸酯化學(xué)(polyvinylphosphonate chemistry)來使鋁表面免于DNA聚合酶的附著(參見， 例如 Korlach et al. , Proc Natl Acad Sci USA 105，1176-1181 (2008))。此導(dǎo)致 DNA 聚合酶分子優(yōu)先附著至于鋁涂層之孔洞中露出的硅。此設(shè)置允許將衰減波現(xiàn)象(evanescent wave phenomenon)用來減少熒光背景，允許較高濃度之熒光標(biāo)記dNTP的使用。熒光團(tuán)系附著至dNTP之末端磷酸鹽，以使熒光在dNTP合并時(shí)釋放，但熒光團(tuán)不維持附著于新被合并之核苷酸，意指復(fù)合物立即準(zhǔn)備好至另一循環(huán)之合并。藉由此方法，可偵測到dNTP合并至存在于鋁涂膜之孔洞中的獨(dú)立引子-模板復(fù)合物。參見，例如Eid et al. , Science 323， 133-138(2009)。與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測系統(tǒng)的使用可提供高靈敏度、允許經(jīng)合并之 dNTP可更有效的偵測，產(chǎn)生相對低的錯(cuò)誤率及/或較長之可解釋序列數(shù)據(jù)的讀取。3. 1.3額外應(yīng)用與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測系統(tǒng)可同時(shí)偵測數(shù)百萬之核酸片段。若各片段為，例如1000個(gè)堿基長，一單一組件一次可獲得超過數(shù)十億個(gè)堿基序列。此處所提供之裝置的額外應(yīng)用與方法將于以下討論。3. 1. 3. 1整個(gè)基因體定序與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測系統(tǒng)可用來執(zhí)行，例如病毒、細(xì)菌、真菌、真核生物或脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，例如人類，之整個(gè)或部分基因體定序。為了定序，可將基因體DNA 切割成至少 20、50、100、200、300、500、800、1200、1500
個(gè)核苷酸或更長之片段。在一些實(shí)施例中，經(jīng)切割之基因體DNA可為自20至50、自20至 100、自20至500、自20至1000、自500至1200或自500至1500個(gè)核苷酸長。在一些實(shí)施例中，為了如上述之定序，具有經(jīng)結(jié)合之末端連結(jié)引子之要被定序的核酸，可被制成單股， 其與定序引子黏合且被提供至本發(fā)明實(shí)施例所提供之系統(tǒng)。3. 1. 3. 2 基因表現(xiàn)研究(Gene Expression Profiling)在其它實(shí)施例中，為了基因表現(xiàn)研究，與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測系統(tǒng)可用來將 cDNA定序。例如，藉由測量于組件上被偵測之特定序列的相關(guān)頻率，可將mRNA程度進(jìn)行定量?？蓪?shù)百萬cDNA分子平行定序于實(shí)施例所提供之一組件上。若一細(xì)胞平均包含 350，000個(gè)mRNA分子，于一百萬個(gè)定序反應(yīng)中，預(yù)期將存在于正好每個(gè)細(xì)胞一復(fù)制的一轉(zhuǎn)錄物(transcript)定序三次。因此，本發(fā)明實(shí)施例所提供之組件適合具有單一數(shù)目靈敏度之單一分子定序。cDNA合成為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知，且一般包括總RNA萃取與視需要而定之mRNA豐富。藉由步驟，包括，例如為了第一股合成之反轉(zhuǎn)錄；RNAse處理以移除殘余RNA ；第一股之隨機(jī)六聚體起始(priming)與藉由DNA聚合酶之第二股合成，來由mRNA產(chǎn)生cDNA。合成之cDNA適合在本發(fā)明所提供之組件上進(jìn)行定序。分離與制備DNA與RNA兩者之方法為本技術(shù)領(lǐng)域所熟知° 參見，Joseph Sambrook and David Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition(2001)。在一些實(shí)施例中，可將cDNA與接合物(adapter)聚核酸，以專一限制酵素來處理接合物，且最后經(jīng)處理之核酸與附著于本發(fā)明實(shí)施例所提供裝置之連結(jié)位的互補(bǔ)寡核苷酸結(jié)合。在特別的實(shí)施例中，接合物分子可為末端連結(jié)引子。
在與本發(fā)明一致之一些實(shí)施例中，mRNA之多腺嘌呤尾巴(poly A tail)可做為一適合之末端連結(jié)引子，其與一多胸腺嘧啶(poly T tail)定序引子互補(bǔ)。3. 1. 3. 3偵測及/或測量結(jié)合之相互作用在其它實(shí)施例中，偵測裝置可用來偵測各種結(jié)合相互作用，包括，例如DNA/DNA、 RNA/RNA或DNA/RNA堿基配對、核酸/蛋白質(zhì)相互作用、抗原/抗體、受器/配體結(jié)合與酵素/受質(zhì)結(jié)合。一般而言，一樣本分子附著于包括一鑒定核酸標(biāo)簽(identifying nucleic acid tag, ID)之連結(jié)分子。在一些實(shí)施例中，連結(jié)分子可更包括一與樣本分子結(jié)合之捕獲分子。連結(jié)分子也包括用以與連結(jié)位結(jié)合之工具，例如一促進(jìn)共價(jià)化學(xué)連結(jié)之部份，例如， 雙硫、硫酯、酰胺、磷酸二酯或酯連結(jié)；或藉由非共價(jià)連結(jié)，例如抗體/抗原或生物素/抗生物素蛋白結(jié)合。在一些實(shí)施例中，可藉由ID標(biāo)簽將連結(jié)分子附著至數(shù)組?？蓪⒁粯颖痉肿犹峁┲僚c本發(fā)明實(shí)施例一致之一系統(tǒng)，且藉由其之連結(jié)分子將其附著于一隨機(jī)連結(jié)位，例如藉由與一位于連結(jié)分子上之捕獲分子結(jié)合。在一些實(shí)施例中，將樣本分子與連結(jié)分子混合、允許其結(jié)合、且之后提供至本發(fā)明實(shí)施例所提供之一組件。在一些實(shí)施例中，連結(jié)分子先被提供至組件，允許其附著至一連結(jié)位，而之后可提供樣本分子。 再來，藉由鑒定經(jīng)結(jié)合之樣本分子的方法來偵測ID(例如，藉由雜合或定序)。多數(shù)個(gè)樣本分子種類可附著至相同之?dāng)?shù)組，且可藉由其之標(biāo)記來區(qū)分，而使用與其結(jié)合之捕獲分子獨(dú)特的ID，可以其之結(jié)合相互作用為特征。因此，在一些實(shí)施例中，偵測一經(jīng)標(biāo)記之樣本分子的方法可包括，藉由包括一核酸標(biāo)簽(ID)之連結(jié)分子，來連結(jié)一樣本分子至與本發(fā)明實(shí)施例一致之系統(tǒng)的連結(jié)位、執(zhí)行ID之核酸定序與偵測經(jīng)標(biāo)記之樣本分子的步驟。在特別的實(shí)施例中，核酸定序可為堿基延伸定序。在一些實(shí)施例中，核酸定序系可擇自連接酶定序或經(jīng)末端-磷酸鹽標(biāo)記之核苷酸定序。藉由使用核苷酸“小段(bits) ”，上至如個(gè)具區(qū)別之捕獲分子可被附著及鑒定于與本發(fā)明實(shí)施例一致之偵測系統(tǒng)上，其中η為一自然數(shù)字顯示被定序之ID的長度。例如，5 個(gè)核苷酸可提供超過一千個(gè)獨(dú)特ID，而12個(gè)核苷酸提供超過一千六百萬個(gè)組合。例如，連結(jié)分子可附著至與本發(fā)明實(shí)施例一致之系統(tǒng)而其位置藉由偵測其對應(yīng)之ID標(biāo)簽來確認(rèn)。 之后連結(jié)分子作為探針以，例如調(diào)查與一或多個(gè)經(jīng)標(biāo)記之樣本分子的結(jié)合相互作用。即，具有一或多個(gè)連結(jié)分子附著至其的一組件可作為一探針數(shù)組。在特定實(shí)施例中，一經(jīng)標(biāo)記之樣本分子可為熒光標(biāo)記的。當(dāng)與連結(jié)分子之捕獲分子結(jié)合時(shí)，可藉由對應(yīng)于被連結(jié)分子附著之連結(jié)位的光偵測器，來偵測經(jīng)標(biāo)記之樣本分子。 因此，在一些與本發(fā)明實(shí)施例一致之方法，可更包括提供一經(jīng)標(biāo)記之樣本分子至與本發(fā)明實(shí)施例一致之系統(tǒng)及偵測經(jīng)標(biāo)記之樣本分子的步驟。在特別的實(shí)施例中，系統(tǒng)可具有附著至連結(jié)位之連結(jié)分子，而連結(jié)分子包括一附著至連結(jié)位之核酸標(biāo)簽(ID)?？蓪⒍嘀貥?biāo)記樣本分子同時(shí)提供至一探針數(shù)組且可藉由其標(biāo)記來區(qū)分，例如藉由其熒光標(biāo)記之強(qiáng)度及/或波長。在一經(jīng)標(biāo)記質(zhì)問分子之所給予的濃度下，基于動(dòng)力學(xué)(例如，接合(docking)/與未接合(imdocking))與統(tǒng)計(jì)學(xué)(例如，在任何給予之時(shí)間，樣本分子之部分為結(jié)合或?yàn)榻Y(jié)合之狀態(tài))兩者可干擾介于樣本分子與經(jīng)標(biāo)記質(zhì)問分子之間的結(jié)合相互作用的分離常數(shù)。在一些實(shí)施例中，一連結(jié)分子之ID 為至少 5、10、15、20、25、30、40、50、75、90、100、 150,200或更多個(gè)核苷酸長。在一些實(shí)施例中，ID為自5至10、20、40、80或160 ；或自10 至20或50 ；或自20至35個(gè)核苷酸長。ID包含一獨(dú)特之核酸序列，S卩，一要被偵測之核酸。獨(dú)特之核酸序列可為至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、20、24、30或更多個(gè)核苷酸長。在一些實(shí)施例中，獨(dú)特之核酸序列為自4至10、12、15或20 ；或自10至20個(gè)核苷酸長。ID包括至少一末端連結(jié)引子，S卩，ID可包含一序列其與一定序引子互補(bǔ)，此序列在一些實(shí)施例中，可為經(jīng)修飾的，以附著至一連結(jié)位，例如藉由包含一經(jīng)生物素化之核苷酸。在一些實(shí)施例中，ID之末端連結(jié)引子部分為3’端至獨(dú)特核酸序列。在一些實(shí)施例中， 其可為5’端至獨(dú)特核酸序列。在又另一實(shí)施例中，末端連結(jié)引子可出現(xiàn)于獨(dú)特之核酸列的 3’與5’端兩者。在特定實(shí)施例中，樣本分子與捕獲分子可包括系擇自一碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、勝肽、抗原、核酸、荷爾蒙、小有機(jī)分子(例如藥學(xué)上的)或維他命部分或其組合之部分。 這些部分可為自然發(fā)生(例如經(jīng)生物化學(xué)純化)或合成(例如經(jīng)化學(xué)合成或重組產(chǎn)生)。 此外，這些基質(zhì)可沒有包含、包含一些或全部非天然成分(例如非天然胺基酸、阻礙或保護(hù)基團(tuán)等)。在特別的實(shí)施例中，一樣本分子或捕獲分子為蛋白質(zhì)，例如生長因子、勝肽抗原、 抗體或受器。許多結(jié)合核酸至連結(jié)分子或連結(jié)位的方法為本技術(shù)領(lǐng)域所知，如回顧于，例如美國專利公開號2004/0038331中?！?31公開揭露形成蛋白質(zhì)寡核苷酸結(jié)合物于一固態(tài)支持物上。美國專利號4，748，111提供結(jié)合蛋白質(zhì)至一核酸之3’端的一實(shí)施例。其中，末端轉(zhuǎn)移酶首先用來將核糖殘基加至一分子之3’部分。一過碘酸氧化(periodate oxidation) 反應(yīng)之后產(chǎn)生一 3’乙醛基團(tuán)于一核酸上，3’乙醛基團(tuán)之后與蛋白質(zhì)之酰胺基團(tuán)形成共價(jià)鍵結(jié)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)合至ID之3’端時(shí)，系經(jīng)由ID之5’端附著至連結(jié)位。在一些實(shí)施例中，一捕獲分子，例如一蛋白質(zhì)，連結(jié)至一 ID之5’端。在這些實(shí)施例中，ID之3’端或一定序引子之5’端系可用來將捕獲分子附著至一連結(jié)位。美國專利號 6，013，434，例如揭露寡核苷酸-聚酰胺結(jié)合物，其中連接系藉由寡核苷酸之5’端。美國專利號6，197，513揭露PNA與DNA兩者經(jīng)由核酸之5’端結(jié)合至一具有羧酸部分之分子，例如蛋白質(zhì)。PNA與DNA分子包含芳香胺(arylamine)或氮氧乙酰(aminooxyacetyl)部分。 美國專利號6，153，737揭露包含至少一 2’經(jīng)官能化之核苷的寡核苷酸，適合與多種分子結(jié)
I=I ο3. 1. 3. 4額外之偵測方法(a) FRET在一些于本發(fā)明實(shí)施例所提供之偵測裝置上偵測一分子，藉由Forster共振能量轉(zhuǎn)移(Forster resonance energy transfer, FRET)，有時(shí)亦可為焚光共振能量轉(zhuǎn)移 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET)。如本技術(shù)領(lǐng)域所知，當(dāng)——經(jīng)激發(fā)之提供者分子非放射性轉(zhuǎn)移能量至一接受者分子時(shí)，其散發(fā)能量，一般為光時(shí)，F(xiàn)RET發(fā)生。 FRET可幫助減低背景光線，藉由，例如提供對于要偵測分子之介于有效激發(fā)與散發(fā)波長之間的較大光譜間隔。FRET常用來偵測接近之分子相互作用，由于其功效衰敗隨著介于提供者與接受者分子間之距離的第六能量。例如，^iang et al. (Nature Materials,4 826-31(2005))藉由FRET偵測核酸雜合。其中，一經(jīng)生物素化之核酸標(biāo)的與一覆蓋抗生物素蛋白之量子點(diǎn)(quantum dot)提供者結(jié)合，其之后激發(fā)一經(jīng)Cy5結(jié)合之DNA探針。在本發(fā)明一些實(shí)施例中，一經(jīng)標(biāo)記之捕獲分子與經(jīng)標(biāo)記之樣本分子可形成一用以藉由FRET來偵測之提供者/接受者(或反之亦然)配對。
在本發(fā)明所提供之核酸定序的一些實(shí)施例中，對于一附著至一聚合酶或連接酶之提供者帶色團(tuán)(chromophore)，熒光標(biāo)記核苷酸扮演一接受者帶色團(tuán)。因此，于這些實(shí)施例中，位于聚合酶或連接酶上之提供者帶色團(tuán)激發(fā)一核酸上之的接受者帶色團(tuán)，而核酸要被聚合于或連接至樣本核酸上。由于在FRET功效中之快速下降，不接近聚合酶之核苷酸可不被激發(fā)。在一些實(shí)施例中，提供者分子為，例如另一熒光團(tuán)，例如一量子點(diǎn)。量子點(diǎn)，例如，半導(dǎo)體量子點(diǎn)為本技術(shù)領(lǐng)域所知且敘述于，例如國際公開號WO 03/003015。結(jié)合量子點(diǎn)至，例如生物分子的方法為本技術(shù)領(lǐng)所知，如回顧于，例如Mednitz et al. (Nature Materials, 4 :235-46(2005))與美國專利公開號2006/0068506與2008/0087843分別公開于2006年 3月20日與2008年4月17日。在一些實(shí)施例中，量子點(diǎn)與一 DNA聚合酶分子結(jié)合。如先前所討論，為了將酵素與連結(jié)位結(jié)合，熟悉此技藝人士可毫無疑問地理解，當(dāng)將熒光團(tuán)結(jié)合至，例如一 DNA聚合酶或連接酶時(shí)必需小心，以藉由減輕結(jié)合熒光團(tuán)至酵素之一級、二級與三級結(jié)構(gòu)上的任何影響來保持酵素功能。(b)多光子激發(fā)在一些實(shí)施例中，可由兩個(gè)或更多之光子激發(fā)一帶色團(tuán)。例如，在一些實(shí)施例中， 于FRET中，不是提供者就是接受者帶色團(tuán)之激發(fā)系經(jīng)由兩個(gè)或更多之光子。兩個(gè)光子與多光子激發(fā)更進(jìn)一步敘述于，例如美國專利號6，344，653與5，034，613中。(c)時(shí)間解析偵測(Time Resolved Detection)可調(diào)整本發(fā)明實(shí)施例所提供之裝置的激發(fā)光源與光偵測器以具有一特征相移 (characteristic phase shift)。使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，例如，如于美國專利公開號 2008/0037008公開于2008年2月14日，揭露了，散發(fā)自本發(fā)明實(shí)施例所提供之裝置上被偵測分子的光，可藉由一對應(yīng)光偵測器來測量，而無來自激發(fā)光源的干擾。(d)流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry)可使用本發(fā)明實(shí)施例所提供之裝置的激發(fā)光源與光偵測器來獲得流式細(xì)胞技術(shù)數(shù)據(jù)。流式細(xì)胞技術(shù)一般包括在一液體懸浮液中之一群體目標(biāo)物的光學(xué)分析?？墒箲腋∫毫鹘?jīng)一偵測器，藉此允許來自群體中許多目標(biāo)物的光之連續(xù)偵測。目標(biāo)物系可擇自，例如細(xì)胞、微珠或其它相似尺寸的顆粒，例如顆粒于至少一尺寸中(長度、寬度、高度、直徑等，隨著適合之顆粒形狀)大于0. 14 111、0.2 4 111、0.5 4 111、14 111、2 4 111或5 4 111及/或于至少一尺寸或所有尺寸中小于 5mm、2mm、lmm、500 μ m、200 μ m、100 μ m、50 μ m、20 μ m或 10 μ m?？蓡我粰n案(single-file)傳遞目標(biāo)物于一或多個(gè)激發(fā)光源與偵測器之間，并可獲得熒光及/或光散射(light scattering)數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施例中，目標(biāo)物可包括至少一、至少二、至少三或至少四種熒光團(tuán)。在一些實(shí)施例中，由目標(biāo)物之至少一子群所發(fā)射的光被偵測。熒光團(tuán)系可擇自，例如由細(xì)胞所內(nèi)生表現(xiàn)之熒光團(tuán)，例如熒光蛋白質(zhì)(GFP、BFP、 CFP、YFP、RFP等)，除了上方所討論之熒光團(tuán)外，還有包括對于一類生物分子或細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有專一活性之熒光團(tuán)(例如，DAPI，其專一于DNA，或伊凡氏藍(lán)(Evans Blue)，其將質(zhì)膜 (plasma membrane)染色)、與核苷酸類似物結(jié)合之熒光團(tuán)，例如花青染料(cyanine-dye) 結(jié)合之dUTP、與一專一結(jié)合對(specific binding partner)結(jié)合之合成熒光團(tuán)，例如一抗體、卵白素(avidin)或一核酸探針。存在于顆粒中及/或結(jié)合至顆粒之熒光團(tuán)的量，及當(dāng)由適合之波長的光激發(fā)時(shí)因而產(chǎn)生熒光團(tuán)發(fā)射的量，可與一生物分子之存在及/或量相關(guān)，此生物分子，可以是DNA、質(zhì)膜，或一特定核酸、蛋白質(zhì)、其它生物分子或于顆粒中或上的
2代謝物。流式細(xì)胞技術(shù)可包括分析一群組織顆粒以產(chǎn)生一熒光強(qiáng)度之頻率分布，例如一頻率的分布圖(histogram)。當(dāng)使用大于一個(gè)之熒光團(tuán)及/或并獲得光散射數(shù)據(jù)時(shí)，或數(shù)據(jù)獲得為時(shí)間解析時(shí)，頻率分布可為多面的。例如，藉由允許以高靈敏度及/或高訊號對噪聲比獲得數(shù)據(jù)，使用本發(fā)明實(shí)施例所提供之裝置之激發(fā)光源與光偵測裝置可產(chǎn)生高品質(zhì)的數(shù)據(jù)。在一些實(shí)施例中，包括執(zhí)行流式細(xì)胞技術(shù)之方法可更包括經(jīng)活化熒光之分類。在此類實(shí)施例中，顆粒藉由流式細(xì)胞技術(shù)來實(shí)時(shí)分析并根據(jù)使用者所定義之參數(shù)來分類。例如，具有來自一特定熒光團(tuán)之可偵測熒光的顆粒，或具有于此類特定范圍中之熒光的顆粒， 可與不符合此標(biāo)準(zhǔn)的顆粒分離。為了更進(jìn)一步之分析可收集這些顆粒。在一些實(shí)施例中， 以此方式被分類的顆粒為活細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明之偵測裝置的靈敏度可允許將具低程度活性之細(xì)胞，除了與具無偵測活性之細(xì)胞分離外，也與具高活性的細(xì)胞分離，程度活性例如一酵素活性或啟動(dòng)子活性。因此，本發(fā)明實(shí)施例之方法與裝置可允許對于先前不易增強(qiáng)之具特別低啟動(dòng)子或酵素活性之細(xì)胞群組的存取。(e)其它熒光偵測裝置與方法在一些實(shí)施例之方法，關(guān)于由一生物細(xì)胞所包括之至少一目標(biāo)物所發(fā)射之光的偵測，生物細(xì)胞可為活細(xì)胞或經(jīng)固定之細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，至少一目標(biāo)物系擇自包括至少一量子點(diǎn)的至少一目標(biāo)物、包括至少一熒光蛋白質(zhì)之至少一目標(biāo)物與包括一至少一熒光的小的化學(xué)官能基(moiety)的至少一目標(biāo)物。在一些實(shí)施例中，至少一目標(biāo)物為經(jīng)熒光標(biāo)記且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡勝肽、多勝肽、寡糖、多糖或脂質(zhì)。在一些實(shí)施例中，至少一目標(biāo)物包括一經(jīng)固定與限制數(shù)目之熒光團(tuán)，例如最多20、 10、5或2個(gè)熒光團(tuán)，其可擇自量子點(diǎn)、熒光蛋白質(zhì)與熒光的小的化學(xué)官能基。在一些實(shí)施例中，至少一目標(biāo)物包括擇自量子點(diǎn)、熒光蛋白質(zhì)與熒光的小的化學(xué)官能基之一單一熒光團(tuán)。 熒光的小的化學(xué)官能基的許多例子為前述所討論。在一些實(shí)施例中，熒光的小的化學(xué)官能基可具有介于300與800nm之間的發(fā)射波峰及/或至少0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7、 0. 8或0. 9的量子效率(quantum yield)(發(fā)射光子數(shù)與吸收波長為吸收光譜波峰之波長光子數(shù)的比值)。3. 2生物分子分析服務(wù)本發(fā)明實(shí)施例也提供一藉由使用與本發(fā)明一致之實(shí)施例的偵測裝置來提供生物分子分析服務(wù)的方法。在一些實(shí)施例中，方法包括自一服務(wù)請求者提供一包括一要被分析之生物分子的樣本至一服務(wù)提供者，與服務(wù)請求者接受來自服務(wù)提供者之分析結(jié)果的步驟，其中藉由使用本發(fā)明所提供之裝置可產(chǎn)生結(jié)果。在一些實(shí)施例中，可為了報(bào)酬之考量來執(zhí)行方法，例如服務(wù)費(fèi)用或契約服務(wù)協(xié)議。此外，樣本可被直接運(yùn)送于服務(wù)請求者與服務(wù)提供者之間，或藉由一賣主(vendor)居中運(yùn)送。在一些實(shí)施例中，服務(wù)提供者或賣主可地理性位于美國之外的領(lǐng)土，例如于另一國家。4.實(shí)施例實(shí)施例1于此實(shí)施例中，使用如圖1中所示之裝置來偵測并辨別目標(biāo)物之三種類型。于此實(shí)施例中使用之光偵測器可為如圖17所示具有一 P-N-P-N-P結(jié)構(gòu)之多接面光二極管。ρ型
28層601與η型層602構(gòu)成第一光學(xué)傳感器。ρ型層603與η型層604構(gòu)成第二光學(xué)傳感器。 所有三個(gè)P型層為連接至接地。為了輸出訊號Jl與J2，n型層602與604為分別連接至電極。將具有407nm之中央波長的6. 5mW雷射二極管使用為激發(fā)源用以激發(fā)要被偵測之目標(biāo)物。發(fā)射自目標(biāo)物的光為入射至光偵測器上且連續(xù)地被第一光學(xué)傳感器與第二光學(xué)傳感器所部分吸收。第18與19圖分別顯示第一光學(xué)傳感器與第二光學(xué)傳感器之響應(yīng)曲線。將多接面二極管封入一黑色盒子內(nèi)以使來自環(huán)境之光的影響最小化。于光二極管上之盒子表面開啟一個(gè)小洞。將要被偵測之目標(biāo)物經(jīng)由孔洞插入至偵測區(qū)，其中將目標(biāo)物暴露于發(fā)射自激發(fā)源的激發(fā)光?？蓪⒁婚L通(long-pass)接口薄膜光學(xué)濾光片置于偵測區(qū)與光二極管之間以部分阻絕散射之激發(fā)光。使用三個(gè)目標(biāo)物來測試此偵測系統(tǒng)。目標(biāo)物1為一第一染料溶液，其包括以5. 0 X 10-5M的濃度溶于去離子水中之Pyranine，目標(biāo)物2為一第二染料溶液，其包括以5. 0 χ 10-5Μ的濃度溶于去離子水中之羅丹明6G(I h0damine 6G，R6G)，及目標(biāo)物3為一第三量子點(diǎn)溶液，其包括具有以6. 25 χ 10-4M的濃度溶于甲苯中之0(1以1111%成分的量子點(diǎn)。第 20與21圖分別顯示三個(gè)目標(biāo)物的吸收光譜與發(fā)射光譜。于此實(shí)施例中，也測試一包括水而無染料或量子點(diǎn)的參考樣本。每次測試一個(gè)目標(biāo)物與參考樣本。每5. 12毫-秒記錄來自第一光學(xué)傳感器的輸出訊號Jl與來自第二光學(xué)傳感器的輸出訊號J2。來自各目標(biāo)物之10個(gè)結(jié)果讀取的記錄與來自參考樣本之10個(gè)結(jié)果讀取的記錄為顯示于表1中。表1、來自光偵測器的輸出訊號
權(quán)利要求
1.一種偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，包括(a)一光偵測器，包括至少一第一光學(xué)傳感器與一第二光學(xué)傳感器，其具有測定光強(qiáng)度之能力，該第一光學(xué)傳感器與該第二光學(xué)傳感器為堆疊的；以及(b)一計(jì)算機(jī)，其處理由該等光學(xué)傳感器所產(chǎn)生之輸出訊號，并比較該處理之一結(jié)果與對應(yīng)至一已知類型的一已知結(jié)果以確定是否該目標(biāo)物屬于該已知類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，更包括(c)一光學(xué)結(jié)構(gòu)，其收集與引導(dǎo)一發(fā)射自該目標(biāo)物的光至光學(xué)傳感器。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該光學(xué)結(jié)構(gòu)包括一透^Mi ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該光學(xué)傳感器為光二極管。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該至少兩個(gè)光學(xué)傳感器系藉由于一裝置中之至少兩個(gè)堆疊的p-n接面來形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該光偵測器包括一訊號放大器之電路、A/D轉(zhuǎn)換器、積算器、比較器、邏輯電路、讀出電路、內(nèi)存、微處理器、時(shí)鐘震蕩器及/或地址。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中處理該訊號包括 計(jì)算該等訊號之一總和；比較該總和與一臨界值以測定一目標(biāo)物的存在，其中當(dāng)該總和等于或大于該臨界值時(shí)，測定一目標(biāo)物為存在，以及當(dāng)該總和小于該臨界值時(shí)，測定一目標(biāo)物為不存在。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中處理該訊號包括 計(jì)算該等訊號之一總和；比較該總和與一臨界值以測定一目標(biāo)物的存在，其中當(dāng)該總和小于該臨界值時(shí)，測定一目標(biāo)物為不存在，以及當(dāng)該總和等于或大于該臨界值時(shí)，測定一目標(biāo)物為存在。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中 處理該等訊號包括計(jì)算該等訊號之一比值；比較該結(jié)果與該已知結(jié)果包括比較該計(jì)算出之比值與對應(yīng)至一已知類型之一已知比值，以及當(dāng)介于該計(jì)算出之比值與該已知比值的差異為于一特定范圍中時(shí)，確定該目標(biāo)物為屬于該已知類型。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該計(jì)算機(jī)更比較該處理之結(jié)果與對應(yīng)至多數(shù)個(gè)已知類型的多數(shù)個(gè)已知結(jié)果以確定該目標(biāo)物屬于何種類型。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中處理該等訊號更比較該計(jì)算出之比值與對應(yīng)至多數(shù)個(gè)已知類型的多數(shù)個(gè)已知比值以確定該目標(biāo)物屬于何種類型。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中一已知類型，其具有在該多數(shù)個(gè)已知比值中對該計(jì)算出之比值具有最小差異的一已知比值，被確定為該目標(biāo)物所屬于的類型。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該目標(biāo)物包括至少一量子點(diǎn)、至少一熒光蛋白質(zhì)或至少一熒光的小的化學(xué)官能基。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該目標(biāo)物為被熒光標(biāo)記且包括至少一寡核苷酸、多核苷酸、寡勝肽、多勝肽、寡醣、多糖或脂質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該目標(biāo)物包括一無光發(fā)射能力之標(biāo)的目標(biāo)物或一具有光發(fā)射能力之標(biāo)記目標(biāo)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該目標(biāo)物包括無光發(fā)射能力之標(biāo)的目標(biāo)物或一具有光發(fā)射能力之標(biāo)記目標(biāo)物群組。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述之偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置，其中該光偵測器為至少一用以偵測多數(shù)個(gè)目標(biāo)物之光偵測器之一，該多數(shù)個(gè)目標(biāo)物被一液體懸浮液所包括，且該懸浮液流經(jīng)該至少一光偵測器。
18.一種偵測多數(shù)個(gè)目標(biāo)物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括根據(jù)權(quán)利要求1所述之裝置的一數(shù)組。
全文摘要
一種偵測一具發(fā)光能力目標(biāo)物之裝置。該裝置包括一光偵測器，其包括至少兩個(gè)具有測定光強(qiáng)度能力之光學(xué)傳感器；以及一計(jì)算機(jī)，其處理由該等光學(xué)傳感器所產(chǎn)生之輸出訊號，并比較該處理之一結(jié)果與對應(yīng)至(之)一已知類型的一已知結(jié)果以確定是否該目標(biāo)物屬于該已知類型。
文檔編號G01N21/64GK102435591SQ201110265130
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月11日
發(fā)明者曲昌盛, 李明家, 邱創(chuàng)汎, 陳鴻鈞, 黎育騰 申請人:財(cái)團(tuán)法人工業(yè)技術(shù)研究院