專利名稱：一種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于液相色譜分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters，簡稱PAEs，別名酞酸酯)是一類重要的有機化合物質(zhì)，由于可增加塑料的可塑性及強度，被廣泛應(yīng)用于玩具、食品包裝材料、醫(yī)用血袋和膠管、乙烯地板和壁紙、清潔劑、潤滑油、個人護理用品(如指甲油、頭發(fā)噴霧劑、香皂和洗發(fā)液)等數(shù)百種產(chǎn)品中。在塑料中PAEs與聚烯烴類塑料分子之間由氫鍵或范德華力連接，彼此保留各自相對獨立的化學(xué)性質(zhì)，隨著時間、溫度等條件的變化逐漸從塑料向食品中遷移，從而導(dǎo)致食品的污染，尤其是油脂類食品。鄰苯二甲酸酯可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進進人體，經(jīng)過體內(nèi)代謝，其代謝產(chǎn)物包括鄰苯二甲酸單酯、羥基化產(chǎn)物和氧化產(chǎn)物，在尿苷 5’ - 二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下生成親水的葡糖苷酸結(jié)合物而排出，代謝物總類繁多，已在人的尿液、乳汁、血液和精液等體液中檢測出鄰苯二甲酸酯，該類化合物已被確認(rèn)為環(huán)境雌激素，對人的生殖系統(tǒng)有損害。目前已經(jīng)有氣相、液相、氣-質(zhì)聯(lián)用、液-質(zhì)聯(lián)用等方法對鄰苯二甲酸酯類化合物進行檢測，這些方法由于靈敏度高、分離效果好以及定量分析緊密度高的優(yōu)點而被廣泛使用，但這些方法均是對某種或某幾種鄰苯二甲酸酯類進行檢測，但因鄰苯二甲酸酯是一類物質(zhì)，包括的種類數(shù)量很多，國內(nèi)外明確規(guī)定一些產(chǎn)品是不能含的，而且即使使用，種類也不一樣，很難將鄰苯二甲酸酯類化合物一一檢測出來，而且代謝物成分復(fù)雜，因此建立一種方法可以檢測鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量不僅可以有效評估食品尤其是油類食品是否受到鄰苯二甲酸酯增塑劑的污染，而且可以為鄰苯二甲酸酯人體的內(nèi)暴露評價提供技術(shù)支持，目前，國內(nèi)外并沒有相關(guān)的研究報道，因此，建立一種測定鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的方法將填補這一領(lǐng)域的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)方法的不足，提供一種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法。該方法將鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)全部轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸， 通過檢測鄰苯二甲酸的量進而計算鄰苯二甲酸酯總量，操作簡單可靠。本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案予以實現(xiàn)一種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，包括如下步驟(1)前處理將樣品制成溶液后在堿的存在下，進行堿解；堿解后以用酸進行酸化，往酸化后的溶液采用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干后以甲醇復(fù)溶，有機濾膜過濾，得到樣品液；(2)含量測定以高效液相色譜對樣品液中鄰苯二甲酸的含量進行測定；(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程制備鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過高效液相分析得到鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，將步驟( 所測定的含量按照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算，即可計算樣品中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的總量。作為一種優(yōu)選方案，步驟(1)中，所述堿解為將樣品溶于甲醇中，以氫氧化鉀溶液為堿，在80 100°C下進行堿解。作為一種最優(yōu)選方案，步驟(1)中，所述堿解為將樣品與甲醇混勻，加入氫氧化鉀溶液，在85°C水浴加熱2.證，最后將甲醇蒸干，取出冷卻至室溫。作為一種優(yōu)選方案，步驟(1)中，所述酸化優(yōu)選將體系的PH值調(diào)至1 2。作為一種最優(yōu)選方案，步驟(1)中，所述酸化優(yōu)選為以體積比為1 1的鹽酸水溶液為酸，將體系的PH值調(diào)至1 2，漩渦震蕩3分鐘后，超聲波震蕩20分鐘。作為一種優(yōu)選方案，步驟(1)中，所述乙酸乙酯萃取優(yōu)選為先采用正己烷進行萃取，除去正己烷層，再往余液中加入乙酸乙酯進行萃取，得到乙酸乙酯的萃取液。作為一種更優(yōu)選方案，所述有機溶液萃取更優(yōu)選為往酸化后的溶液中，加入3倍體積的正己烷，漩渦震蕩3分鐘，靜置，除去正己烷層，余液中加入3倍體積的乙酸乙酯，漩渦震蕩3分鐘，靜置，分離出乙酸乙酯層，重復(fù)乙酸乙酯提取步驟2次，合并三次所得的乙酸乙酯萃取液，除去乙酸乙酯，得到鄰苯二甲酸。正己烷的作用是可以除去水解后生成的脂肪酸以及一些弱極性和非極性的物質(zhì)。作為一種優(yōu)選方案，步驟O)中，高效液相色譜條件優(yōu)選為紫外檢測器，檢測波長為230nm ；XB-C18型色譜柱；甲醇與25mmol/L磷酸氫二鉀組成的緩沖溶液作為流動相； 進行梯度洗脫；流速1. Oml/min ；柱溫40°C，進樣量IOy L。作為一種優(yōu)選方案，所述樣品優(yōu)選為油類或富脂樣品。作為一種更優(yōu)選方案，所述樣品更優(yōu)選為食用油、方便面調(diào)味醬料或黃油。作為一種優(yōu)選方案，當(dāng)樣品為油類或富脂樣品時，步驟O)的梯度洗脫優(yōu)選為， O 15分鐘，甲醇在緩沖溶液中的比例由30體積％上升為40體積％ ；15 20分鐘，甲醇比例由40體積％上升為70體積％，保持5分鐘。作為一種優(yōu)選方案，所述樣品為尿液樣品時，步驟(1)中，優(yōu)選為先采用葡糖苷酸水解酶進行酶解和高溫滅菌再進行堿解。作為一種優(yōu)選方案，當(dāng)所述樣品為尿液時，步驟O)的梯度洗脫優(yōu)選為，O 5分鐘，甲醇在緩沖溶液中的比例由10體積％上升為25體積 20分鐘，甲醇比例由25體積％上升為30體積％，20 25分鐘，甲醇比例由30體積％升至80體積％，25 30分鐘， 甲醇比例由80體積％降至10體積％。步驟(3)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程按照如下步驟制備用鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成鄰苯二甲酸濃度分別為0.05、0. 1、1、10、25、50、 100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μ L注入高效液相色譜進行分析，由相應(yīng)濃度得到的高效液相色譜峰面積，得到鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，并得到最低檢測限?，F(xiàn)有的鄰苯二甲酸類物質(zhì)含量的檢測，都是直接測定樣品中某一特定種類的鄰苯二甲酸酯的含量，由于樣品中的鄰苯二甲酸酯種類難以確定，往往需要同時制備多種常用的鄰苯二甲酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此操作較麻煩，難以在短時間內(nèi)判斷樣品是否受到鄰苯二甲酸類物質(zhì)的污染。本發(fā)明通過堿解再酸化的前處理，將樣品中各種不同類型的鄰苯二甲酸酯統(tǒng)一轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸，因此，僅需要根據(jù)鄰苯二甲酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可換算出鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的總含量?？梢钥焖俚貦z測樣品是否受到鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的污染。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明所述方法的前處理操作簡單，無需對樣品進行提取純化等預(yù)處理，可以直接進行水解；(2)靈敏度高，鄰苯二甲酸在230nm有很強的吸收，檢測限為0. 02mg/L ；(3)取樣少，液體樣品取Iml即可，固體及半固體狀態(tài)樣品取樣為2g ；(4)適用于大批量樣品測定，由于可同時進行水解，提取等步驟，單個樣品高效液相測定時間在20分鐘以內(nèi)，因此適用于大批量樣品測定；(5)穩(wěn)定性好；24h內(nèi)鄰苯二甲酸的峰面積穩(wěn)定，RSD < 2.8% ；(6)本方法應(yīng)用于食品安全風(fēng)險評估領(lǐng)域，一方面能夠初步判定食品是否污染鄰苯二甲酸酯以及污染程度，同時也可以作為人群鄰苯二甲酸酯暴露量的估計分析，對企業(yè)還是監(jiān)管部門均具有廣泛的市場應(yīng)用前景。


圖1是鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；圖2是鄰苯二甲酸高效液相色譜圖標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3是食用油樣品處理后鄰苯二甲酸高效液相色譜圖；圖4是尿液樣品處理后鄰苯二甲酸高效液相色譜圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明作任何形式的限定。實施例1油類樣品中鄰苯二甲酸類物質(zhì)總量的測定(1)用鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成鄰苯二甲酸濃度分別為0.05、0. 1、1、10、25、 50、100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取各濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液IOyL注入高效液相色譜進行分析， 由相應(yīng)濃度得到的高效液相色譜峰面積，得到鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程Y = 63331X+47465，R2 = 0. 9995，并得到最低檢測限為0. 02mg/L。(2)將樣品混勻后，稱取2. 0g，放于回流瓶中，加入IOml甲醇混勻，再加IOmL濃度為2mol/L的KOH溶液，于85°C水浴回流加熱2.證，最后裝置拆除，將甲醇在水浴中蒸干，取出冷卻至室溫。(3)用1 1鹽酸將水解液pH調(diào)為1 2，漩渦震蕩;3min后，超聲波震蕩20min， 轉(zhuǎn)移至250ml分液漏斗中。(4)在分液漏斗中加入3倍體積的正己烷，漩渦震蕩;3min，靜置20min，棄去正己烷層，加入3倍體積的乙酸乙酯，漩渦震蕩3min，靜置20min，取乙酸乙酯層，剩余液體中再加入3倍體積的乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，將三次萃取液合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至盡干， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的水浴溫度為40°C。(5)用2mL色譜級甲醇復(fù)溶，超聲5min使其更好溶解，用0. 22 μ m有機濾膜過濾，進行高效液相色譜分析。(6)高效液相色譜條件色譜柱XB-C18(5ym，4. 6X250mm)；流動相甲醇和磷酸鹽緩沖溶液Q5mmol/L， PH = 2. 5)；總流量:lml/min ；紫外吸收波長:230nm ；梯度洗脫:0-15min,甲醇比例由30% 升至40%，15-20min，甲醇比例由40%升至70%，保持5min ；柱溫40°C ；進樣量JOyL。(7)含量計算以鄰苯二甲酸的峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出待測液中鄰苯二甲酸的含量；通過鄰苯二甲酸的摩爾量計算樣品中鄰苯二甲酸酯總摩爾量。據(jù)下列公式計算出食用油中PAEs的總含量。X = ~-~χΓχΙΟ—3
166.13m式中X——食用油中PAEs的總含量，mol/gC——HPLC檢測得到的鄰苯二甲酸的濃度，μ g/mLm——食用油的質(zhì)量，gV——復(fù)溶用甲醇體積，mL166. 13——鄰苯二甲酸的相對分子質(zhì)量，g/mol采用上述方法，我們測定了 6個油類樣品中鄰苯二甲酸酯總量，結(jié)果如表1所示表 權(quán)利要求
1.一種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，包括如下步驟(1)前處理將樣品制成溶液后在堿的存在下，進行堿解；堿解后以用酸進行酸化，往酸化后的溶液采用乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干后以甲醇復(fù)溶，有機濾膜過濾，得到樣品液；(2)含量測定以高效液相色譜對樣品液中鄰苯二甲酸的含量進行測定；(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程制備鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過高效液相分析得到鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，將步驟(2)所測定的含量按照標(biāo)準(zhǔn)曲線換算，即可計算樣品中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的總量。
2.如權(quán)利要求1所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，步驟(1)中， 所述堿解為將樣品溶于甲醇中，以氫氧化鉀溶液為堿，在8(T10(TC下進行堿解。
3.如權(quán)利要求1所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，步驟(1)中， 所述酸化為用酸將體系的PH值調(diào)至廣2。
4.如權(quán)利要求3所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，所述酸化為以體積比為1:1的鹽酸水溶液為酸。
5.如權(quán)利要求1所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，所述乙酸乙酯萃取為先采用正己烷進行萃取，除去正己烷層，再往余液中加入乙酸乙酯進行萃取，得到乙酸乙酯的萃取液。
6.如權(quán)利要求1所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，步驟(2)中， 高效液相色譜條件為紫外檢測器，檢測波長為230nm ；XB-C18型色譜柱；甲醇與25mmol/ L磷酸氫二鉀組成的緩沖溶液作為流動相；進行梯度洗脫；流速1. Oml/min ；柱溫40°C，進樣量10 μ L0
7.如權(quán)利要求7所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，所述樣品為油類或富脂樣品時，步驟(2)中，梯度洗脫的條件為，(Γ15分鐘，甲醇在緩沖溶液中的比例由30體積％上升為40體積％ ； 15^20分鐘，甲醇比例由40體積％上升為70體積％，保持5 分鐘。
8.如權(quán)利要求1所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，所述樣品為尿液樣品時，步驟(1)中，先采用β-葡糖苷酸水解酶進行酶解和高溫滅菌再進行堿解。
9.如權(quán)利要求6所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法，其特征在于，所述樣品為尿液樣品時，步驟(2)中，梯度洗脫的條件為(Γ5分鐘，甲醇在緩沖溶液中的比例由10體積％上升為25體積％ ；5 20分鐘，甲醇比例由25體積％上升為30體積％，20^25分鐘，甲醇比例由30體積％升至80體積％，25 30分鐘，甲醇比例由80體積％降至10體積％。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的測定方法。所述測定方法包括如下步驟對樣品依次進行堿解；酸化，使樣品中所有鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)全部轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸，然后采用乙酸乙酯萃取，蒸干、甲醇復(fù)溶，有機濾膜過濾，得到樣品液；以高效液相色譜對樣品液中鄰苯二甲酸的含量進行測定；根據(jù)鄰苯二甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，進行換算，即可計算樣品中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的總量。本發(fā)明測定鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)總量的方法具有前處理方式簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點，有利于大批量樣品的測定，適用食用油、方便面調(diào)味醬料及方便米線調(diào)味醬料等多種油類食品以及尿液等生物樣本中鄰苯二甲酸酯總量的測定。
文檔編號G01N30/06GK102419352SQ20111025345
公開日2012年4月18日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者孫遠(yuǎn)明, 張明明, 徐小艷, 楊藝超, 楊金易, 柳春紅, 王弘 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)