專利名稱：結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐藥蛋白的篩選領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)簡稱為結(jié)核桿菌(tubercle bacilli)。早在 1882年，德國細(xì)菌學(xué)家郭霍(Robert Koch, 1843-1910)就已證明結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的病原菌。本菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。隨著抗結(jié)核藥物的不斷發(fā)展和衛(wèi)生生活狀況的改善，結(jié)核的發(fā)病率和死亡率曾一度大幅下降。20世紀(jì)80年代后，由于艾滋病和結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)、免疫抑制劑的應(yīng)用、吸毒、貧困及人口流動(dòng)等因素，全球范圍內(nèi)結(jié)核病的疫情驟然惡化。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界約每3個(gè)人中就有1個(gè)人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80%，其中約5% 10%攜帶者可發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了 HIV的結(jié)核分枝桿菌攜帶者，由于病毒破壞了機(jī)體的免疫功能，發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病的可能性比未感染HIV 者高30 50倍，且結(jié)核的病程發(fā)展更快。此外，在HIV感染的發(fā)展進(jìn)程中，結(jié)核是最早發(fā)生的一種機(jī)會(huì)性感染，結(jié)核病加重了 HIV感染者或艾滋病人的疾病負(fù)擔(dān)，使其更易死亡。目前全球每年約出現(xiàn)8百萬結(jié)核新病例，并導(dǎo)致約3百萬人死亡。我國每年死于結(jié)核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。因此，結(jié)核病又成為了威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題，并成為某些發(fā)展中國家和地區(qū)，特別是艾滋病高發(fā)區(qū)人群的首要死因。在固體培養(yǎng)基中對常用的含異煙胼lg、鏈霉素10g、利福平50g能生長的結(jié)核桿菌為結(jié)核桿菌耐藥菌，不能生長的結(jié)核桿菌為結(jié)核桿菌敏感菌。耐藥菌株毒力有所減弱。異煙胼可影響細(xì)胞壁中分枝菌酸的合成，誘導(dǎo)結(jié)核桿菌成為L型，此可能是其耐異煙胼的一種原因。藥物敏感試驗(yàn)表明對異煙胼耐藥，而對利福平和鏈霉素大多仍敏感。故目前治療多主張異煙胼和利福平或吡嗪酰胺聯(lián)合用藥，以減少耐藥性的產(chǎn)生，增強(qiáng)療效。如能篩選出對目前治療肺炎和結(jié)核病的常用藥物異煙胼(INH)、鏈霉素(SM)、利福平(RFP)和乙胺丁醇(EMB)具有耐藥性的結(jié)核桿菌耐藥菌株的耐藥蛋白，將能迅速尋找病原菌的致病因子，研究相應(yīng)的新型藥物，降低藥物的耐藥性，提高病人的痊愈率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，能夠全面篩選對目前常用結(jié)核病用藥具有耐藥性的結(jié)核桿菌耐藥蛋白。一種結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，包括以下步驟(1)選取對藥物具有耐藥性和/或敏感性的結(jié)核桿菌菌株；所述的藥物為異煙胼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇中的一種或多種；(2)將結(jié)核桿菌菌株于100°C沸水煮10分鐘，滅活，收集菌液，凍于_80°C備用；(3)從菌液中提取蛋白，采用凝膠電泳法分離蛋白，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，對蛋白測序后提取肽段；
(4)將肽段采用液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜結(jié)果與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，篩選出結(jié)核桿菌耐藥蛋白。步驟(1)中，選取對藥物具有耐藥性和/或敏感性的結(jié)核桿菌菌株的方法，可采用現(xiàn)有的加藥培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)得到。為了達(dá)到更好的發(fā)明效果，優(yōu)選步驟(3)中，所述的凝膠電泳法為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法 (SDS-PAGE凝膠電泳法)。步驟(3)中，所述的膠內(nèi)酶解的方法包括步驟將凝膠電泳法所得的蛋白膠帶從上到下根據(jù)蛋白情況切成若干個(gè)條帶，再剪成膠粒，200ml脫色液完全脫至無色，分離所得膠粒使用終濃度為50mmol/L的三羧乙基磷水溶液在60°C水浴還原10分鐘，再進(jìn)行半胱氨酸烷基化使用吲哚-3-乙酸避光條件室溫孵育1 小時(shí)，分離所得膠粒加200ul脫色液洗兩次，每次15分鐘，然后往膠粒中加入50ul乙腈，室溫放置15分鐘，棄去乙腈，離心旋干，旋干后的膠粒加入IOul測序級胰蛋白酶溶液，膠粒在測序級胰蛋白酶溶液中室溫孵育15分鐘，加入20ul的25mmol/LNH4HC03緩沖液，37°C水浴中振蕩過夜，酶解18小時(shí)以上，胰酶酶解后的膠粒每次加入50ul肽段提取液，室溫孵育30 分鐘，提取肽段，重復(fù)3次，將提取的肽段溶液合并，離心旋干，干粉在-80°C保存?zhèn)溆?。所述的脫色液為乙?碳酸氫銨水溶液，其中乙腈體積百分濃度為50 %，碳酸氫銨濃度為25mmol/L。所述的測序級胰蛋白酶溶液的配制方法為胰蛋白酶用25mmol/LNH4HC03緩沖液溶解，配制成胰蛋白酶濃度為lug/ul的母液，使用時(shí)按照胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比為1 50， 用25mmol/L NH4HCO3緩沖液稀釋至所需的濃度。所述的肽段提取液為乙腈體積百分濃度為50%和甲酸體積百分濃度為5%的乙腈-甲酸水溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明方法能夠全面篩選對目前常用結(jié)核病用藥具有耐藥性的結(jié)核桿菌耐藥蛋白，對研究治療肺炎、結(jié)核病等因結(jié)核桿菌導(dǎo)致的疾病的新型藥物具有重要的意義。


圖1為理想的蛋白SDS-PAGE圖；圖2為本發(fā)明結(jié)核桿菌樣品的蛋白SDS-PAGE圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.儀器與試劑Ettan多維液相色譜儀(Ettan MDLC System)購自美國通用公司(GE Healthcare, Pittsburgh, PA USA)。液相色譜iTrap柱和納升級反向色譜柱(Nanocolumn)是實(shí)驗(yàn)室自行填充的，trap柱填料C18AQ為Michrom Bioresouces, Inc公司產(chǎn)品(貨號為 PM5/61200/00)，5 μ m，200A，先用5um硅填充至柱頭，火燒使硅熔化堵住，再將填料填充成 15X0. Imm I. D.柱。納升級反向色譜柱填料C18AQ為Michrom Bioresouces, he公司產(chǎn)品(貨號為PM5/61100/00)，5 μ m，200人，先將石英毛細(xì)管頭燒拉成尖狀，然后將頭部切平， 再將填料填充成15X0. 075mm I. D.柱。LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀為美國熱電公司產(chǎn)品(Thermo Finnigan，Bremen，Germany)， 配有納升級電噴霧電離源。S peedvac Labconco Centrivap Concentrator 貞空離^已、干!^l系 充為 Lab conco 產(chǎn)品(Labconco, Kansas City, MO USA)。裝有Ultracel-3超濾膜的Amicon Ultra-15超濾管購自Millipore公司 (Millipore Inc. , USA) 實(shí)驗(yàn)用水均為電阻率為18. 2MQ. cm的超純水，由ELGA Labffater純化系統(tǒng)(High Wycombe, UK)純化得到。HPLC 級乙腈購自 Burdick&Jackson 公司(SK Chemie, Ulson, Korea) 碳酸氫銨購自 FLUKA 公司(Sigma-Aaldrich Chemic GmbH，Japan)。蛋白酶抑制劑混合物(Protease inhibitors cocktail)購自羅氏公司(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)。三羧乙基磷(TCEP)、考馬斯亮藍(lán)G-250和碘乙酰胺(IAA)購自Sigma公司(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO, USA) ο SDS、超純級丙烯酰胺及雙丙烯酰胺均購自Bio Basic公司(Canada)。 測序級胰蛋白酶購自于!Iomega公司(Madison，WI, USA)。2.提取菌株中蛋白取如表1所示的1-8號結(jié)核桿菌菌株樣品，100°C沸水煮10分鐘，滅活，菌液收集在離心管中，凍于-80°C冰箱，用于質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)表 權(quán)利要求
1.一種結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，包括以下步驟(1)選取對藥物具有耐藥性和/或敏感性的結(jié)核桿菌菌株；所述的藥物為異煙胼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇中的一種或多種；(2)將結(jié)核桿菌菌株于100°C沸水煮10分鐘，滅活，收集菌液，凍于-80°C備用；(3)從菌液中提取蛋白，采用凝膠電泳法分離蛋白，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，對蛋白測序后提取肽段；(4)將肽段采用液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜結(jié)果與現(xiàn)有的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析，篩選出結(jié)核桿菌耐藥蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的凝膠電泳法為十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的膠內(nèi)酶解的方法包括步驟將凝膠電泳法所得的蛋白膠帶從上到下根據(jù)蛋白情況切成若干個(gè)條帶，再剪成膠粒， 200ml脫色液完全脫至無色，分離所得膠粒使用終濃度為50mmol/L的三羧乙基磷水溶液在 60°C水浴還原10分鐘，再進(jìn)行半胱氨酸烷基化使用吲哚-3-乙酸避光條件室溫孵育1小時(shí)，分離所得膠粒加200ul脫色液洗兩次，每次15分鐘，然后往膠粒中加入50ul乙腈，室溫放置15分鐘，棄去乙腈，離心旋干，旋干后的膠粒加入IOul測序級胰蛋白酶溶液，膠粒在測序級胰蛋白酶溶液中室溫孵育15分鐘，加入20ul的25mmol/LNH4HC03緩沖液，37°C水浴中振蕩過夜，酶解18小時(shí)以上，胰酶酶解后的膠粒每次加入50ul肽段提取液，室溫孵育30分鐘，提取肽段，重復(fù)3次，將提取的肽段溶液合并，離心旋干，干粉在_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，其特征在于，所述的脫色液為乙腈-碳酸氫銨水溶液，其中乙腈體積百分濃度為50%，碳酸氫銨濃度為25mmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，其特征在于，所述的測序級胰蛋白酶溶液的配制方法為胰蛋白酶用25mmol/L NH4HCO3緩沖液溶解，配制成胰蛋白酶濃度為lug/ul的母液，使用時(shí)按照胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比為1 50，用25mmol/L NH4HCO3 緩沖液稀釋至所需的濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，其特征在于，所述的肽段提取液為乙腈體積百分濃度為50%和甲酸體積百分濃度為5%的乙腈-甲酸水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)核桿菌耐藥蛋白的篩選方法，包括以下步驟(1)選取對藥物具有耐藥性和/或敏感性的結(jié)核桿菌菌株；所述的藥物為異煙肼、鏈霉素、利福平、乙胺丁醇中的一種或多種；(2)將結(jié)核桿菌菌株于100℃沸水煮10分鐘，滅活，收集菌液，凍于-80℃?zhèn)溆茫?3)從菌液中提取蛋白，采用凝膠電泳法分離蛋白，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，對蛋白測序后提取肽段；(4)將肽段采用液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析，將質(zhì)譜結(jié)果與現(xiàn)有的蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，篩選出結(jié)核桿菌耐藥蛋白。本發(fā)明方法能夠全面篩選對目前常用結(jié)核病用藥具有耐藥性的結(jié)核桿菌耐藥蛋白，對研究治療肺炎、結(jié)核病等因結(jié)核桿菌導(dǎo)致的疾病的新型藥物具有重要的意義。
文檔編號G01N30/06GK102359988SQ20111017841
公開日2012年2月22日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者張華蓉, 林標(biāo)揚(yáng) 申請人:浙江大學(xué)