專利名稱：Ev71病毒單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體、分泌該抗體的細胞株及其應用。具體涉及一種可中和EV71病毒A、B、C三種基因型病毒的廣譜性單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的細胞株及該單克隆抗體的用途。
背景技術：
手足口病(hand，foot and mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的一種急性傳染病。該病自1957年首次報道以來，曾多次流行，世界衛(wèi)生組織于2006年曾將本病列為第四位引起死亡的的疾病。美國、澳大利亞、意大利、法國、荷蘭、西班牙、羅馬尼亞、巴西、加拿大、德國等國家經常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《竞湍c道病毒71型(EV71)引起的手足口病。20世紀90年代后期，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢。1998年，臺灣地區(qū)暴發(fā)EV71的大流行，約有12萬以上的人被感染，死亡78人。1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007年該病在中國發(fā)生了大規(guī)模的疾病暴發(fā)。手足口病是全球性傳染病，近年來手足口病已經成為越來越威脅國內外兒童健康的廣泛流行性疾病之一。為指導全國各地做好手足口病的預防控制，2008年衛(wèi)生部發(fā)布《手足口病預防控制指南》；規(guī)定自2008年5 月2日起，手足口病納入丙類傳染病管理。研究發(fā)現，引發(fā)手足口病的病毒有一個共同特點，均為腸道病毒科，為單股正鏈小 RNA病毒。這些病毒有20多種(型)，包括腸道病毒71型(EV 71)、柯薩奇病毒A組的16 型(Cox A16)、?？刹《疽约捌渌滤_奇病毒。目前國內爆發(fā)的手足口病主要是由EV71和 Cox A16引起的。由柯薩奇病毒引起的手足口病一般癥狀較輕，而EV71則相對較重，20%的患者可以伴有引起無菌性或病毒性腦炎，心肌炎和腦麻痹后遺癥的患者。因此，有關EV71 的病毒生物學特性、致病機理、診斷和預防等的研究日益受到人們的重視。腸道病毒71型(EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬 (Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒A。EV71病毒的基因組為7408核苷酸的單股正鏈RNA。該基因組僅含有一個開放閱讀框(編碼含有約2194個氨基酸的多聚蛋白)。所編碼的多聚蛋白可進一步水解成PI、P2和P3三個前體蛋白，Pl前體蛋白被進一步活化為 IA (多肽VP1)、1B (多肽VP2)、1C (多肽VP3)和ID (多肽VP4)四個病毒結構蛋白；四種結構蛋白拼接成五聚體結構；五聚體形成亞單位結構，60個亞單位構成病毒粒子。P2和卩3前體蛋白主要編碼7個非結構蛋白，編碼蛋白水解酶及RNA聚合酶，P3區(qū)在進化過程中高度保守。VPl作為主要的衣殼蛋白，具有最多的型特異性中和位點，其基因序列與病毒血清型具有較高的相關性。EV71病毒衣殼蛋白VPl是該病毒主要的中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性。VPl基因具有與病毒血清型完全對應的遺傳多樣性，VPl基因序列不僅可作為腸道病毒屬內不同血清型分類的依據。并可作為小RNA病毒科內不同屬的分類參考，因此VPl基因成了 EV71基因分型和遺傳進化分析的最重要的對象。目前基于VPl核苷酸序列的差異，可將EV71分為A、B、C等三個基因型，A型僅包括原型株BrCr-CA-70 ；B型和C型又可進一步分為B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亞型。Brown等曾對113株世界各地的EV71分離株的VPl基因的核苷酸序列進行同源性分析，顯示同一型內毒株間序列同源性大于92%， 而不同型間毒株的同源性為78% 83%。自1997-2001年期間在馬來西亞、新加坡、中國臺灣和澳大利亞西部等地流行期間分離到2個新亞型，即B3和B4亞型，其中B3亞型為東南亞地區(qū)的流行株。B4亞型曾在新加坡(1997-1998年)和中國臺灣(1998年)小規(guī)模流行，但2000年在馬來西亞和新加坡大規(guī)模流行，成為流行株。B基因型主要包括美國、澳大利亞、哥倫比亞、新加坡、部分中國大陸與中國臺灣地區(qū)、部分馬來西亞的毒株；而C基因型主要包括美國、澳大利亞、中國大陸與中國臺灣、加拿大和部分馬來西亞的毒株。B和C基因型在系統發(fā)生樹上遺傳距離較遠。中國臺灣1998年EV71大爆發(fā)是由2個基因型，即B和 C2同時引起的，但Siih等比較了其流行期間從死亡病例中分離的18株毒株。結果表明， 有17株分離毒株為C2亞型，僅1株為B型。近年來在中國上海、重慶、浙江和深圳等多個地區(qū)分離的EV71病毒有較高的同源性，均屬于C4亞型，提示該C4亞型EV71病毒在中國大陸可能有較廣泛的分布和傳播。EV71病毒衣殼蛋白VP2和VP4是腸道病毒外殼蛋白的主要組成部分，它們與病毒的抗原性密切相關，基于VPl與VP4的基因分型具有很高的相關性。目前針對EV71引起疾病的疫苗、特異性治療藥物等防控手段尚在研制中。EV71病毒疫苗的抗原含量檢測、保護性表位研究、治療性單克隆抗體的制備，具有廣泛的應用范圍和社會需求。高質量的EV71單克隆抗體(mAb)有可能用于研制治療性mAb、EV71患者血清學診斷以及EV71病毒疫苗的抗原含量的檢測，因此具有重要的應用價值。鑒于EV71的危害性以及國內血清型的特點，本實驗室以EV71病毒的C4亞型為基礎，選取與其他亞型保守的序列制備重組抗原用于免疫小鼠。當然篩選單克隆抗體時，同時用A、B、C三類病毒亞型進行篩選，得到能同時與A、B、C三類病毒亞型結合的單克隆抗體。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供EV71病毒單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用。為此，本發(fā)明的解決方案是提出一種EV71病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏名稱為雜交瘤細胞A7-E3，保藏號為CCTCC No:C201123。保藏日期為2011年4月12 日，經檢測為存活。(中國典型培養(yǎng)物保藏中心地址中國湖北省武漢市武昌珞珈山，郵編 430072)。本發(fā)明所述EV71病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，其保藏名稱為雜交瘤細胞 A7-E3，名稱有所不同的原因是前者為通用名，后者是根據保藏中心的要求命名的。其中雜交瘤細胞為細胞類別，A7-E3為篩選時產生的特定的克隆編號。進一步地，本發(fā)明提出由前述雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體或其保守性突變體或其活性片段。進一步地，本發(fā)明提出用于檢測EV71抗原或EV71的IgG或IgM的試劑盒、試劑或藥劑，包含前述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段。本發(fā)明的試劑盒、試劑或藥劑中，EV71病毒選自A、B、C三種基因型的EV71病毒； 優(yōu)選地，所述B型EV71病毒選自Bi、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒選自 Cl、C2、C3、C4 和 C5 型 EV71 病毒。
本發(fā)明的試劑盒、試劑或藥劑中，其所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段是生物標記或化學標記的。本發(fā)明的試劑盒、試劑或藥劑中，其中所述的標記是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標記，或是熒光標記，例如熒光素標記。進一步地，本發(fā)明提出了前述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段在制備用于預防或治療EV71感染的人源化抗體中的用途。進一步地，本發(fā)明提出了檢測EV71病毒抗原的方法，是采用雙抗體夾心法進行 EV71病毒抗原的檢測，其中使用了權利要求2所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體，或標記的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體(例如酶標記(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或熒光標記的，例如熒光素標記的)。進一步地，本發(fā)明提出了檢測EV71相關抗體的方法，是采用捕獲法進行抗EV71病毒IgG、IgM的檢測，其中使用了權利要求2所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體或標記的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體(例如酶標記(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或熒光標記的，例如熒光素標記的)。相對于現有技術，本發(fā)明的有益效果是給EV71病毒抗原檢測以及捕獲法進行抗 EV71病毒IgG、IgM的檢測提供一種高特異性、高靈敏度的優(yōu)質的抗體。


圖1為EV71抗原檢測標準曲線。
具體實施例方式本發(fā)明采用重組EV71 VPl抗原，利用雜交瘤技術制備單克隆抗體，然后通過EV71 病毒A、B、C三種基因型的間接ELISA法篩選，獲得了能分泌中和EV71三種基因型病毒并能特異性結合EV71病毒的細胞系及由所屬細胞系產生的單克隆抗體。因此，本發(fā)明一方面提供了一種對EV71病毒各種基因型均有高結合效價的雜交瘤細胞株。對于本發(fā)明的上述雜交瘤細胞株，申請人于2010年12月31日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，簡稱CCTCC)(湖北省武漢市武昌珞珈山，武漢大學，保藏中心) 對其進行了保藏，保藏號為CCTCC No :C201123。本發(fā)明另一方面提供了由上述的雜交瘤細胞系所產生的單克隆抗體，或其活性片段或其保守性突變體。進一步地，本發(fā)明的抗體可根據其抗原結合區(qū)域(例如重鏈和輕鏈可變區(qū))發(fā)展出的各種衍生抗體，可以用于被動免疫治療或者預防EV71病毒感染，如人源化抗體。由于本發(fā)明的單克隆抗體對于EV71病毒A、B、C三種基因型均有高水平的中和效果，所以本發(fā)明提供了本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合在制備用于檢測EV71病毒A、B、C三種基因型的抗原的試劑、藥劑或試劑盒中的應用。本發(fā)明的再一方面提供了試劑或試劑盒，其包括本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或保守性變異體，或其任意組合。所述試劑或試劑盒可用于檢測EV71病毒抗原或 EV71的IgG、IgM，從而可進一步用于診斷EV71病毒感染。
在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的試劑或試劑盒，優(yōu)選的，包括標記的本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。對于本發(fā)明所述的標記，其是指生物標記或化學標記。例如酶標記的或熒光標記的(例如熒光素標記)。優(yōu)選的，所述酶標記為辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標記。本發(fā)明還提供了用于檢測EV71病毒抗原的方法，其中使用了本發(fā)明所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體，或標記的本發(fā)明的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。優(yōu)選的，采用雙抗體夾心法進行檢測EV71病毒抗原。本發(fā)明還提供了 EV71相關抗體的檢測方法，檢測EV71相關抗體的方法，優(yōu)選的， 采用捕獲法進行抗EV71病毒IgG、IgM的檢測。即以抗人IgG或IgM抗體作為固相抗體，當加入血清標本時，其中的IgG或IgM類抗體(特異的和非特異的)即可被固相抗體捕獲，再加入EV71特異性抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結合后，加入酶標(或熒光標記)的抗 EV71單克隆抗體，最后加入底物顯色。為更清楚地說明本發(fā)明，現結合如下實施例進行詳細說明，但這些實施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本申請的限制。實施例1 雜交瘤細胞系的獲得、單克隆抗體的制備1、免疫原的制備選取了當前流行的腸道病毒71型C4亞型，采用人工化學合成的方法合成了編碼腸道病毒71型VPl蛋白的核苷酸序列，具體是根據基因片段人工合成的需要，將設計的基因分段合成，體外拼接成完整的序列，構建了重組表達質粒。然后由工程菌大腸桿菌進行發(fā)酵生產，發(fā)酵結束后發(fā)酵液離心收集菌體，破碎菌體，離心收集包涵體，包涵體蛋白經過稀釋復性后，經過親和層析純化。2、動物免疫采用重組VPl蛋白進行BALB/c小鼠免疫。免疫程序首次免疫取重組VPl蛋白與弗氏完全佐劑混合乳化，免疫BALB/c小鼠，50 μ g/只，腹腔注射；間隔14天后進行第二次免疚取重組VPl蛋白與弗氏不完全佐劑混合乳化，50 μ g/只，腹腔注射；7 天后采血，采用間接ELISA法測定抗體的抗EV71活性。對檢測抗體效價最高的小鼠不加佐劑，用重組VPl蛋白進行靜脈注射加強免疫。3、細胞融合取免疫鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤按比例融合，鋪96孔細胞培養(yǎng)板， 采用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞，第七天采用間接ELISA法檢測細胞上清以篩選陽性細胞。間接法采用A、B、C三種基因型病毒純化液分別單獨包被，篩選同時呈陽性的細胞孔。 間接ELISA法如下將A、B、C三種基因型EV71病毒純化液包被酶標板，加入陽性血清對照、陰性血清對照，同時設置空白對照孔，37°C反應后洗滌酶標板，加入羊抗小鼠IgG-HRP ； 反應45分鐘后洗滌酶標板，加入TMB顯色液37°C顯色5分鐘，用2M硫酸終止反應，儀器上讀取0D450的吸光度。結果，陽性血清對照的OD值為1. 2以上，陰性血清對照的OD值為0. 05以下。經過篩選，所獲得的目的細胞株所對應的OD值如表1所示。表1初篩所得5細胞株所對應的OD值
權利要求
1.一種EV71病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏名稱為雜交瘤細胞A7-E3，保藏號為CCTCC No :C201123。
2.一種由權利要求1所述雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體、或其保守性突變體、或其活性片段。
3.一種用于檢測EV71抗原或EV71的IgG或IgM的試劑盒、試劑或藥劑，包含權利要求 2所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段。
4.根據權利要求3所述的試劑盒、試劑或藥劑，其中所述的EV71選自A、B、C三種基因型的EV71病毒；其中，所述B型EV71病毒選自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型 EV71病毒選自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。
5.根據權利要求3或4所述的試劑盒、試劑或藥劑，其所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段是生物標記或化學標記的。
6.根據權利要求5所述的試劑盒、試劑或藥劑，其中所述的標記是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶標記，或是熒光標記。
7.權利要求2所述的單克隆抗體、其保守性突變體或其活性片段在制備用于預防或治療EV71感染的人源化抗體中的用途，其中EV71是指A、B、C三種基因型的EV71病毒；其中， B型EV71病毒選自Bi、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，C型EV71病毒選自Cl、C2、C3、C4和 C5型EV71病毒。
8.—種檢測EV71病毒抗原的方法，是采用雙抗體夾心法進行EV71病毒抗原的檢測，其中使用了權利要求2所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體，或標記的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。
9.一種檢測EV71相關抗體的方法，是采用捕獲法進行抗EV71病毒IgG、IgM的檢測， 其中使用了權利要求2所述的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體或標記的單克隆抗體或其活性片段或其保守性突變體。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術領域，旨在提供一種EV71病毒單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用。該雜交瘤細胞株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏名稱為雜交瘤細胞A7-E3，保藏號為CCTCC No.C201123。本發(fā)明給EV71病毒抗原檢測以及捕獲法進行抗EV71病毒IgG、IgM的檢測提供一種高特異性、高靈敏度的優(yōu)質的抗體。
文檔編號G01N33/577GK102229915SQ20111017025
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權日2011年6月22日
發(fā)明者呂棠山, 吳志軍, 周林福, 徐芝勇 申請人:浙江大學