專利名稱：原發(fā)性肝細胞肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險評估的組合抗體試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個用于評估肝細胞肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細胞肝癌(簡稱肝癌)是一種常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分居第六和第三位，而中國是肝癌高發(fā)區(qū)。近年來肝癌發(fā)病率有明顯上升的趨勢，嚴(yán)重危害人類的健康與生命安全。肝癌易發(fā)生血管侵犯和轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率高和預(yù)后差的主要原因。因此，有效預(yù)測患者術(shù)后復(fù)發(fā)將可以幫助選擇合適的治療人群和方式，為有效診治提供有力的支持。由于傳統(tǒng)臨床病理診斷或單一的分子標(biāo)記物對患者術(shù)后預(yù)后判斷的效力較低，因此多分子標(biāo)記物聯(lián)合使用的試劑盒將是新的研發(fā)方向。免疫組化利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使顯色劑顯色來檢測組織標(biāo)本中抗原的存在，并可以進行定位、定量分析。目前免疫組化已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床病理診斷，是一種直觀、可靠的檢測手段。不僅如此，隨著數(shù)字圖像分析技術(shù)的飛速發(fā)展，計算機輔助的病理診斷和分析逐漸受到重視和應(yīng)用，并具有高效、客觀、準(zhǔn)確等優(yōu)點。由于肝癌組織具有很大程度的異質(zhì)性，而且臨近癌旁組織中活躍的免疫反應(yīng)也與疾病進展密切相關(guān)。因此，分子標(biāo)記物檢測所采用組織的取材位置是非常重要的。傳統(tǒng)方法往往僅檢測腫瘤組織本身，大樣本量的研究結(jié)果表明癌旁組織中的免疫相關(guān)分子標(biāo)記物也具有重要的預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的效力。因此，將取材部位確定為腫瘤組織與癌旁組織交界部位將具有以下優(yōu)點1)對取材的位置標(biāo)準(zhǔn)化，避免所檢測的組織由于腫瘤大小不同等原因而產(chǎn)生取材深度的差異；幻可以同時檢測腫瘤組織和癌旁良性組織中相關(guān)標(biāo)記物的表達水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于，提供一種用于評估肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的多抗體組合試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測肝細胞肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的多抗體試劑盒，所述試劑盒具有8個可分別單獨用于免疫組化檢測的第一抗體，所述的8個第一抗體所檢測的蛋白分子分別為CD80(細胞分化抗原80 ；或淋巴細胞活化抗原 B7-1)，B7-DC (或PD-L2，程序性死亡因子配體2、，HLA-DR (人白細胞DR抗原)，F(xiàn)asL (凋亡相關(guān)因子配體；或CD95L)，Bcl-2 (B細胞淋巴瘤_2)，CK19 (細胞角蛋白19)，Ki-67 (增殖細胞核抗原)和Cyclin Dl (細胞周期蛋白Dl)。優(yōu)選的，所述的試劑盒還具有辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。其次，為了達到上述目的，本發(fā)明還提供了一種針對上述檢測試劑盒的結(jié)果分析方法，通過綜合分析上述8種第一抗體所特異性標(biāo)記的抗原在肝癌標(biāo)本中的表達水平，達到評估患者接受手術(shù)切除腫瘤后復(fù)發(fā)風(fēng)險的目的。
本發(fā)明所采用的原理如下首先，利用免疫組化的方法檢測32種分子標(biāo)記物在151例接受根治性切除的肝癌石蠟切片(同時包括癌巢和臨近癌旁組織)中的表達，并利用專業(yè)圖像軟件分析不同分子分別在癌組織和癌旁實質(zhì)中的陽性比率。利用支持向量機和交叉驗證的方法對獲得49個分子指標(biāo)進行分類器的建立。由于肝癌的預(yù)后均較差，所以將分類器的金標(biāo)準(zhǔn)定義為是否在1年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)。最終獲得一個由8個分子指標(biāo)組成的分類器，其交叉驗證的敏感性為 0. 768，特異性為0. 866，ROC曲線下面積為0. 844。生存分析表明利用分類器獲得的兩組患者的無瘤生存率和總體生存率均有顯著差異(P <0.001)。多因素分析中，該分類器可以作為獨立預(yù)測早期復(fù)發(fā)、無瘤生存、總體生存的因素(P <0.001)。所以上述8個分子指標(biāo) (CD80、B7-DC、HLA-DR、FasL, Bcl_2、CK19、Ki-67 和 Cyclin Dl)可以有效用于肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的預(yù)測。其次，為了簡化試劑盒的使用，利用上述8個分子指標(biāo)進行患者術(shù)后復(fù)發(fā)的 COX比例風(fēng)險模型分析，并獲得用于計算患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值的計算式即患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值 =-0. 118XB7-DC(T)-0. 130XCD80(T)-0. 347XHLA-DR(P)+0. 472XFasL(P)-0. 780XBcl-2 (T) +0. 566XCK19 ⑴-0. 362XCyclinDl (T) +0. 722XKi67(T)；其中 T 代表部位是癌巢，P 代表部位是癌旁。根據(jù)ROC曲線選取分界值為0. 1530，將患者分為復(fù)發(fā)風(fēng)險高和低兩組。 預(yù)測1年內(nèi)復(fù)發(fā)的敏感性為0. 696，特異性為0. 854，AUC為0. 775(如圖2所示)。生存分析表明兩組患者的無瘤生存率和總體生存率均有顯著差異(P < 0. 001 ；如圖3所示)。多因素COX分析中，患者復(fù)發(fā)風(fēng)險值可以作為獨立預(yù)測早期復(fù)發(fā)(如表1所示)、無復(fù)發(fā)生存、 總體生存的因素(P<0. 001)。表1多因素分析與復(fù)發(fā)相關(guān)的因素(訓(xùn)練組N= 151)
權(quán)利要求
1.一種檢測肝細胞肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的多抗體試劑盒，其特征在于，所述試劑盒具有8個可分別單獨用于免疫組化檢測的第一抗體，所述的8個第一抗體所檢測的蛋白分子分別為CD80，B7-DC, HLA-DR, FasL, Bcl-2, CK19, Ki-67 和 Cyclin Dl。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肝細胞肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的多抗體試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還具有辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于評估肝細胞肝癌患者接受切除術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的多抗體檢測試劑盒，包括8種用于石蠟切片的免疫組化抗體。本發(fā)明還公開了一種利用此試劑盒判斷肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險的方法。本發(fā)明的預(yù)測效果優(yōu)于現(xiàn)有臨床指標(biāo)，并具有客觀準(zhǔn)確、簡便、直觀、易于重復(fù)等特點。本發(fā)明可用于臨床肝癌手術(shù)切除后復(fù)發(fā)和死亡的預(yù)測。本發(fā)明旨在篩選術(shù)后具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險的肝癌患者，從而幫助指導(dǎo)恰當(dāng)?shù)妮o助治療并有效降低復(fù)發(fā)率和延長患者生存時間。
文檔編號G01N33/68GK102298053SQ20111013254
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者丁童, 何琪, 余杏娟, 石明, 許靜, 賈衛(wèi)華, 鄭利民 申請人:中山大學(xué)腫瘤防治中心