專(zhuān)利名稱(chēng)：結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白、其制備方法及用途，具體涉及結(jié)核分枝桿菌H37Rv早期培養(yǎng)濾液蛋白的提取方法，以及所制備的早期培養(yǎng)濾液蛋白在診斷結(jié)核病或結(jié)核桿菌潛伏感染人群的用途。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染引起的多器官感染性疾病，主要為肺結(jié)核。全球結(jié)核感染者高達(dá)20億人，每年新發(fā)病例約800萬(wàn) 1000萬(wàn)，其中我國(guó)每年新發(fā)患者高達(dá)150萬(wàn)。結(jié)核桿菌流行病學(xué)的一個(gè)重要特征是結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染。結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染是一種亞臨床狀態(tài)，無(wú)放射檢查征象，細(xì)菌呈休眠狀態(tài)，約有10%的結(jié)核分枝桿 菌潛伏性感染人群一生中會(huì)發(fā)展成為結(jié)核病患者。結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染人群，也稱(chēng)為結(jié)核病聞危人群，或稱(chēng)為結(jié)核桿菌潛伏感染人群，通常將PPD(結(jié)核菌素純蛋白衍生物)皮試試驗(yàn)72小時(shí)后呈強(qiáng)陽(yáng)性，即硬結(jié)直徑^ 15mm和/或伴有水皰、壞死者稱(chēng)為結(jié)核病聞危人群，也稱(chēng)為結(jié)核分枝桿菌聞危人群或結(jié)核桿菌潛伏感染人群，為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，本申請(qǐng)將其統(tǒng)稱(chēng)為結(jié)核桿菌潛伏感染人群。我國(guó)屬于世界上結(jié)核病嚴(yán)重流行的國(guó)家之一，全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)三分之一左右的人口已經(jīng)感染了結(jié)核桿菌，受感染人數(shù)超過(guò)4億，其中一部分人將會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。因此必須采取措施進(jìn)行有效控制，預(yù)防潛伏感染人群發(fā)展為結(jié)核病患者，而如何有效的、全面的篩查出潛伏感染人群，則是首要解決的問(wèn)題。目前結(jié)核桿菌潛伏感染人群尚無(wú)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，pro皮試試驗(yàn)是診斷結(jié)核桿菌潛伏感染人群的常用方法，但這一方法有一定的缺陷性，因?yàn)樵囼?yàn)所用pro抗原為結(jié)核分枝桿菌、非致病性分枝桿菌和卡介苗(即BCG)所共有，具有交叉反應(yīng)，診斷特異性差。我國(guó)是普遍接種卡介苗的國(guó)家，而由于卡介苗接種者和結(jié)核桿菌自然感染者對(duì)pro試驗(yàn)的反應(yīng)在表現(xiàn)上很難區(qū)分，即使采用上述的pro皮試試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，仍然會(huì)有一部分卡介苗接種者以及非致病性分枝桿菌的感染者被納入結(jié)核桿菌潛伏感染人群中，因此導(dǎo)致pro試驗(yàn)在結(jié)核桿菌潛伏感染人群診斷中的實(shí)際作用十分有限。我國(guó)結(jié)核病疫情嚴(yán)重，而潛伏性感染人群大、范圍廣又是目前導(dǎo)致結(jié)核病暴發(fā)的一個(gè)重要因素，如果能全面有效的診斷出結(jié)核桿菌潛伏感染人群并能在感染的早期進(jìn)行治療和干預(yù)，就可以有效預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生。因此尋找合適的結(jié)核桿菌特異性抗原及新的診斷技術(shù)，對(duì)象中國(guó)這樣普遍接種卡介苗的國(guó)家或地區(qū)將十分必要，也尤為重要。y 干擾素釋放分析技術(shù)(interferon gamma release assays, IGRA),是一種用于結(jié)核桿菌感染的體外診斷方法，其原理為機(jī)體感染結(jié)核桿菌以后，存于血液中的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞會(huì)在再次接觸結(jié)核桿菌特異性抗原時(shí)，產(chǎn)生和分泌細(xì)胞因子Y干擾素，通過(guò)對(duì)Y干擾素或產(chǎn)生Y干擾素的特異性效應(yīng)細(xì)胞的定量檢測(cè)，可以對(duì)結(jié)核病或結(jié)核感染進(jìn)行診斷。對(duì)Y干擾素的檢測(cè)通常應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，現(xiàn)有的商品化試劑盒QuantiFERON-TB(簡(jiǎn)稱(chēng)TB Gold)是應(yīng)用此方法定量分析特異性IFN_Y的水平。對(duì)產(chǎn)生、干擾素的特異性效應(yīng)細(xì)胞的定量檢測(cè)則應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)，現(xiàn)有商品化試劑盒TB-SP0T. TB即應(yīng)用此方法，在單細(xì)胞水平定量檢測(cè)分泌Y干擾素的效應(yīng)性T細(xì)胞。上述兩種診斷產(chǎn)品都選用了只存在于結(jié)核分枝桿菌基因組，但在卡介苗和非致病性分枝桿菌中普遍缺失的RDl區(qū)編碼蛋白作為特異性的T細(xì)胞抗原?？乖捎玫氖莻鹘y(tǒng)的合成肽加載刺激的方法，即使用來(lái)源于特異性抗原的相互重疊的合成肽混合物作為檢測(cè)樣本的刺激源，所用的特異性抗原主要是結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白中的ESAT-6和CFP-IO0但此方法也有其局限性，即混合多肽池并不能包括結(jié)核分枝桿菌全部的表位肽，在全人類(lèi)群的檢測(cè)中仍存在缺失現(xiàn)象，會(huì)造成檢測(cè)遺漏產(chǎn)生假陰性，特別對(duì)于我國(guó)這樣一個(gè)疫情嚴(yán)重、潛伏性感染范圍大的情況，能夠盡可能全面的檢出潛伏性感染者有其重要的現(xiàn)實(shí)意義，而上述試劑盒在這一方面存在局限。結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液中的分泌性蛋白抗原是記憶性免疫CD4+T細(xì)胞的靶分子。通常將培養(yǎng)不超過(guò)7天的濾液蛋白稱(chēng)為早期培養(yǎng)濾液蛋白，所述早期培養(yǎng)濾液蛋白 包括多種抗原蛋白，例如可能存在已經(jīng)被鑒別出的ESAT6、MPT64和Ag85b等蛋白。在結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，濾液蛋白中的蛋白濃度和/或組成也在變化，本申請(qǐng)的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)5天的濾液蛋白在區(qū)分卡介苗接種和結(jié)核桿菌感染方面比培養(yǎng)7天及以上的濾液蛋白具有更加優(yōu)異的效果，這一效果沒(méi)有任何報(bào)道予以揭示或啟示。并且發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明培養(yǎng)5天的濾液蛋白與PH)皮試強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果一致性高，表明其能夠比市售產(chǎn)品更廣泛的檢測(cè)出結(jié)核桿菌潛伏感染人群，因此以培養(yǎng)5天的早期培養(yǎng)濾液蛋白作為刺激源，優(yōu)選結(jié)合ELISPOT診斷技術(shù)，更適合于結(jié)核桿菌潛伏感染人群的篩查，其同時(shí)具有較高檢測(cè)靈敏度和特異性將能夠保證更多的感染人群被檢出，并且有效降低卡介苗接種者的干擾，在我國(guó)這樣高感染、高發(fā)病且普遍接種卡介苗的國(guó)家或地區(qū)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有較好的靈敏度和特異性、與pro皮試強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果一致性高、適于結(jié)核病或結(jié)核桿菌潛伏感染人群篩查的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白。該早期培養(yǎng)濾液蛋白是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)5天獲得的濾液蛋白，所述結(jié)核分枝桿菌優(yōu)選H37Rv分枝桿菌(可商購(gòu))，所述培養(yǎng)條件優(yōu)選振蕩培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基優(yōu)選液體蘇通培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)優(yōu)選于活化培養(yǎng)后進(jìn)行，所述活化培養(yǎng)優(yōu)選于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行，所述斜面培養(yǎng)基優(yōu)選羅氏雞蛋培養(yǎng)基，所述濾液蛋白優(yōu)選由培養(yǎng)5天后的菌液經(jīng)離心、過(guò)濾、超濾離心濃縮后獲得，所述超濾離心濃縮優(yōu)選包括培養(yǎng)基置換的步驟。本發(fā)明提到的結(jié)核分枝桿菌早期濾液蛋白特指培養(yǎng)5天獲得的濾液蛋白。進(jìn)一步的，本發(fā)明提供結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白，其制備方法包括如下步驟I)菌種活化培養(yǎng)取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)好的菌體；2)用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體，接種于液體蘇通培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)5天；3)取培養(yǎng)5天的菌液進(jìn)行離心分離，收集培養(yǎng)上清,將培養(yǎng)上清過(guò)濾除菌；4)將無(wú)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮，得到本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白。本發(fā)明的上述早期培養(yǎng)濾液蛋白，其中第I)步菌種活化培養(yǎng)溫度優(yōu)選35_37°C，更優(yōu)選37°C，培養(yǎng)21天，本領(lǐng)域的普通實(shí)驗(yàn)人員能夠判斷生長(zhǎng)良好、無(wú)污染的菌體；培養(yǎng)基優(yōu)選羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基；菌體收集方法優(yōu)選用生理鹽水洗下，離心收集菌體；在用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體前，優(yōu)選用液體蘇通培養(yǎng)基洗滌收集到的菌體，洗滌方法為補(bǔ)充液體蘇通培養(yǎng)基到離心前的體積，再離心收集菌體，優(yōu)選進(jìn)行3次洗滌；步驟2)接種濃度優(yōu)選I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml I X IO8個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選I X IO7個(gè)細(xì)胞/ml ;振蕩培養(yǎng)的優(yōu)選條件為100-200rpm ;優(yōu)選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養(yǎng)基的三角瓶中；步驟3)離心分離的優(yōu)選條件為0_8°C, 4000-10000rpm,離心時(shí)間為10-60min,更優(yōu)選為4°C, 8000rpm,離心時(shí)間30min ;過(guò)濾除菌可用常規(guī)的蛋白質(zhì)過(guò)濾除菌的方法，優(yōu)選使用0. 22 y m的濾膜；步驟4)超濾離心濃縮的優(yōu)選條件為0-8°C, 2000-6000rpm,更優(yōu)選為4°C, 4000rpm ;步驟4)優(yōu)選將無(wú)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮至5-15倍，優(yōu)選為10倍，然后補(bǔ)加pH6. 5-7. 5，優(yōu)選PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進(jìn)行超濾離心濃縮，再重復(fù)補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮步驟1-4次，優(yōu)選3次，得到早期培養(yǎng)濾液蛋白。本發(fā)明還提供了結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法，包括以下步驟I)菌種活化培養(yǎng)取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)好的菌體； 2)用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體，接種于液體蘇通培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)5天；3)取培養(yǎng)5天的菌液進(jìn)行離心分離，收集培養(yǎng)上清,將培養(yǎng)上清過(guò)濾除菌；4)將無(wú)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮，得到本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白。本發(fā)明提供的上述制備方法，其中第I)步菌種活化培養(yǎng)溫度優(yōu)選35_37°C，優(yōu)選37°C，培養(yǎng)21天，本領(lǐng)域的普通實(shí)驗(yàn)人員能夠判斷生長(zhǎng)良好、無(wú)污染的菌體；培養(yǎng)基優(yōu)選羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基；菌體收集方法優(yōu)選用生理鹽水洗下，離心收集菌體；在用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體前，優(yōu)選用液體蘇通培養(yǎng)基洗滌收集到的菌體，洗滌方法為補(bǔ)充液體蘇通培養(yǎng)基到離心前的體積，再離心收集菌體，優(yōu)選進(jìn)行3次洗滌；步驟2)接種濃度優(yōu)選I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml I X IO8個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選I X IO7個(gè)細(xì)胞/ml ;振蕩培養(yǎng)的優(yōu)選條件為100-200rpm ;優(yōu)選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養(yǎng)基的三角瓶中；步驟3)離心分離的優(yōu)選條件為0_8°C, 4000-10000rpm,離心時(shí)間為10-60min,更優(yōu)選為4°C, 8000rpm,離心時(shí)間30min ;過(guò)濾除菌可用常規(guī)的蛋白質(zhì)過(guò)濾除菌的方法，優(yōu)選使用0. 22 y m的濾膜；步驟4)超濾離心濃縮的優(yōu)選條件為0-8°C, 2000-6000rpm,更優(yōu)選為4°C, 4000rpm,步驟4)優(yōu)選將無(wú)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮至5-15倍，優(yōu)選為10倍，然后補(bǔ)加pH6. 5-7. 5，優(yōu)選PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進(jìn)行超濾離心濃縮，再重復(fù)補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮步驟1-4次，優(yōu)選3次，得到早期培養(yǎng)濾液蛋白。本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法中，優(yōu)選的培養(yǎng)基置換步驟，即在第4)步中的重復(fù)補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液、超濾濃縮的步驟，這樣能夠用磷酸鹽緩沖液置換掉培養(yǎng)上清中的大部分培養(yǎng)基成分，使獲得的早期培養(yǎng)濾液蛋白成分簡(jiǎn)單、純度更高。本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法優(yōu)選包括接種液體培養(yǎng)基前對(duì)菌體進(jìn)行洗滌，隨著清洗次數(shù)的增多，菌種接種液中含有的蛋白量逐漸減少，能夠去除菌體本身殘余的分泌蛋白和菌體膜蛋白，有助于提高目標(biāo)濾液蛋白的純度。本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)5天的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白在制備結(jié)核病或結(jié)核桿菌潛伏性感染的診斷試劑或試劑盒中的用途及包括所述濾液蛋白的診斷試劑盒。所述診斷試劑或試劑盒優(yōu)選為以所述早期培養(yǎng)濾液蛋白為刺激源的IFN-Y-ELISP0T診斷試劑及試劑盒，所述診斷試劑或試劑盒中早期培養(yǎng)濾液蛋白的劑量?jī)?yōu)選5 i! g/ml。目前結(jié)核桿菌潛伏感染人群尚無(wú)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，而本發(fā)明通過(guò)研究驚奇的發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)5天的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白相比于培養(yǎng)7天的早期培養(yǎng)濾液蛋白以及現(xiàn)有的市售試劑盒更適于結(jié)核桿菌潛伏感染人群的篩查，培養(yǎng)5天的早期濾液蛋白比培養(yǎng)7天的早期濾液蛋白能夠更好的區(qū)分BCG接種和結(jié)核桿菌感染，從而克服PH)試驗(yàn)診斷特異性差的缺陷，同時(shí)培養(yǎng)5天的早期濾液蛋白-INF-Y-ELISPOT方法與PTO皮試強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果具有很高的一致性(93. 7% )，而現(xiàn)有的T-SP0T. TB試劑盒一致性?xún)H為50%，表明培養(yǎng)5天的早期濾液蛋白能夠更廣泛的篩查出結(jié)核桿菌潛伏感染者，因此培養(yǎng)5天的早期培養(yǎng)濾液蛋白更適宜于結(jié)核桿菌潛伏感染人群的篩查。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例I :早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備本實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了 H37Rv分枝桿菌的培養(yǎng)和早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法。I. IH37Rv分枝桿菌的培養(yǎng)和接種將H37Rv分枝桿菌(ATCC 93009)接種于羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)21天。取斜面生長(zhǎng)良好且無(wú)污染的菌體，以生理鹽水洗下菌種，收集至離心桶內(nèi)，4°C，SOOOrpm,離心30min，離心結(jié)束后棄去培養(yǎng)上清，收集菌體。用液體蘇通培養(yǎng)基洗滌菌體3次，洗滌方法為補(bǔ)充液體蘇通培養(yǎng)基到離心前的體積，再離心收集菌體，第一次清洗后上清中蛋白含量為547iig/ml，第二次清洗后上清中蛋白含量為147iig/ml，第三次清洗后上清中蛋白含量為64ii g/ml,由此可知,接種前對(duì)菌體進(jìn)行洗漆能夠有效去除殘余分泌蛋白和菌體膜蛋白等。取液體蘇通培養(yǎng)基重懸洗滌后的菌體，按I X IO7個(gè)細(xì)胞/ml的接種濃度接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養(yǎng)基的三角瓶中，100 200rpm，37°C震蕩培養(yǎng)。I. 2培養(yǎng)濾液蛋白的收集和制備將培養(yǎng)0、3、5、7、10、13、15天的結(jié)核分枝桿菌菌液收集到離心桶內(nèi)，4 °C，8000rpm,離心30min，離心結(jié)束后棄去菌體，收集培養(yǎng)上清。將培養(yǎng)上清過(guò)0. 22 y m濾膜過(guò)濾除菌。將除菌過(guò)濾后的培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮和置換緩沖液。實(shí)驗(yàn)條件5000bp的超濾離心管或超濾離心杯，mi I Iipore公司；冷凍離心機(jī)，eppendorf 公司。實(shí)驗(yàn)試劑pH值為7. 0的磷酸鹽緩沖液。實(shí)驗(yàn)步驟首先將無(wú)菌培養(yǎng)上清置于超濾離心管或離心杯中進(jìn)行離心，離心條件為4°C，4000rpm，控制離心時(shí)間使培養(yǎng)上清濃縮10倍；然后補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件進(jìn)行超濾離心濃縮10倍；離心結(jié)束后再重復(fù)補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮步驟3次，將培養(yǎng)上清中的培養(yǎng)基成分去除，置換成磷酸鹽緩沖液；最后濃縮得到的蛋白即為培養(yǎng)濾液蛋白。其中培養(yǎng)5天獲得的濾液蛋白稱(chēng)為早期培養(yǎng)濾液蛋白。使用時(shí)可根據(jù)使用劑量對(duì)蛋白濃度進(jìn)行調(diào)整。實(shí)施例2 :不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的培養(yǎng)濾液蛋白濃度及其診斷效果比較2. I蛋白含量測(cè)定用Lowry法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定(參見(jiàn)文獻(xiàn)Loery OH, Rosebrough NJ, FarrAL,et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J BiolChem. 1951,193(I)265-275)。實(shí)施例I獲得的不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的培養(yǎng)濾液中蛋白濃度如下0天培養(yǎng)濾液蛋白濃度18 U g/ml3天培養(yǎng)濾液蛋白濃度33 u g/ml5天培養(yǎng)濾液蛋白濃度51 ii g/ml7天培養(yǎng)濾液蛋白濃度61 ii g/ml10天培養(yǎng)濾液蛋白濃度72 ii g/ml13天培養(yǎng)濾液蛋白濃度188 u g/ml 15天培養(yǎng)濾液蛋白濃度222 U g/ml2. 2培養(yǎng)5天的早期濾液蛋白穩(wěn)定性分析由實(shí)施例2. I結(jié)果可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),不同培養(yǎng)時(shí)間后結(jié)核分枝桿菌分泌到培養(yǎng)濾液上清中的蛋白濃度和/或組成也不同。目前為止，雖然有研究從所述濾液蛋白中分離出某些單一蛋白加以分析，但迄今并沒(méi)有也很難清楚的確定出結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白中的所有蛋白及確切濃度，因此本領(lǐng)域?qū)τ诮Y(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白組合物的表征均是采用培養(yǎng)天數(shù)進(jìn)行表征，這樣才能夠更清楚的確定所述蛋白組合物。并且本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，以活化狀態(tài)的菌種接種于液體培養(yǎng)基后，不同批次的生長(zhǎng)曲線是相近的，菌體對(duì)特定蛋白的分泌時(shí)間也是相對(duì)恒定的，且發(fā)明人采用實(shí)施例I的方法重復(fù)進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果培養(yǎng)5天的濾液蛋白濃度均在50 V- g/ml左右，即證實(shí)在一定菌體接種量和培養(yǎng)條件下，固定培養(yǎng)天數(shù)的濾液中蛋白濃度相對(duì)穩(wěn)定，其差異屬于本領(lǐng)域可接受的誤差范圍，因此，以培養(yǎng)時(shí)間表征濾液蛋白能夠更清楚的表征所述蛋白組合物，對(duì)其功能的實(shí)現(xiàn)不產(chǎn)生影響。2. 3不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的培養(yǎng)濾液蛋白的診斷效果比較將培養(yǎng)濾液蛋白進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e以g/ml的劑量對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的培養(yǎng)濾液蛋白的性能進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)方法選取臨床確診的結(jié)核病人(簡(jiǎn)稱(chēng)病人)和無(wú)結(jié)核接觸史且接種過(guò)BCG的健康志愿者(簡(jiǎn)稱(chēng)健康接種者)，體外分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)并調(diào)好細(xì)胞濃度后，分別與陰性對(duì)照物(培養(yǎng)基)、3y g/ml的不同培養(yǎng)時(shí)間獲得的培養(yǎng)濾液蛋白和陽(yáng)性對(duì)照物(PHA)在5% C02，37°C條件下共同孵育16-20小時(shí)。孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用200 u LPBS緩沖液重復(fù)洗板4次。每孔加入50 ii L標(biāo)記抗體工作液，置2 8°C孵育60分鐘。孵育結(jié)束后棄去反應(yīng)孔內(nèi)液體，用200 u L PBS緩沖液重復(fù)洗板4次。每孔加入顯色底物溶液50 u L，在室溫中反應(yīng)5 10分鐘后形成斑點(diǎn)。用實(shí)驗(yàn)用水洗滌各孔終止反應(yīng)。經(jīng)過(guò)上述抗原抗體結(jié)合反應(yīng)和酶促反應(yīng)后形成斑點(diǎn)，計(jì)數(shù)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)以進(jìn)行診斷(陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)> 6個(gè))。比較結(jié)果見(jiàn)表I。表I :不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的培養(yǎng)濾液蛋白-INF-Y-ELISPOT的診斷結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白，其特征在于該早期培養(yǎng)濾液蛋白是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)5天的培養(yǎng)濾液蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白，其特征在于，其由包括以下步驟的制備方法獲得 1)菌種活化培養(yǎng)取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)好的菌體；所述斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件優(yōu)選為37°C條件下培養(yǎng)21天，菌體收集方法優(yōu)選為用生理鹽水洗下，離心收集菌體； 2)用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體，接種于液體蘇通培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)5天；優(yōu)選在用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體前，用液體蘇通培養(yǎng)基洗滌收集到的菌體；接種時(shí)優(yōu)選的接種濃度為I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml I X IO8個(gè)細(xì)胞/ml，更優(yōu)選I X IO7個(gè)細(xì)胞/ml ;振蕩培養(yǎng)條件優(yōu)選100-200rpm ;優(yōu)選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養(yǎng)基的三角瓶中； 3)取培養(yǎng)5天的菌液進(jìn)行離心分離，收集培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)上清過(guò)濾除菌；離心分離的條件優(yōu)選為4°C、8000rpm條件下離心30min,過(guò)濾除菌優(yōu)選使用0. 22 y m的濾膜； 4)將無(wú)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮，得到本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白；優(yōu)選在4°C、4000rpm的條件下進(jìn)行所述超濾離心濃縮。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白，其特征在于，步驟4)的超濾離心濃縮為將所述無(wú)菌培養(yǎng)上清超濾離心濃縮5-15倍，優(yōu)選濃縮10倍，然后補(bǔ)加PH6. 5-7. 5，優(yōu)選pH7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進(jìn)行超濾離心濃縮，再重復(fù)補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮的步驟1-4次，優(yōu)選重復(fù)3次，得到早期培養(yǎng)濾液蛋白。
4.權(quán)利要求I所述的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟 1)菌種活化培養(yǎng)取H37Rv分枝桿菌接種于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集培養(yǎng)好的菌體；所述斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件優(yōu)選為37°C條件下培養(yǎng)21天，菌體收集方法優(yōu)選為用生理鹽水洗下，離心收集菌體； 2)用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體，接種于液體蘇通培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)5天；優(yōu)選在用液體蘇通培養(yǎng)基重懸菌體前，用液體蘇通培養(yǎng)基洗滌收集到的菌體；接種時(shí)優(yōu)選的接種濃度為I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml I X IO8個(gè)細(xì)胞/ml，更優(yōu)選I X IO7個(gè)細(xì)胞/ml ;振蕩培養(yǎng)條件優(yōu)選100-200rpm ;優(yōu)選接種于500ml的裝有200ml液體蘇通培養(yǎng)基的三角瓶中； 3)取培養(yǎng)5天的菌液進(jìn)行離心分離，收集培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)上清過(guò)濾除菌；離心分離的條件優(yōu)選為4°C、8000rpm條件下離心30min,過(guò)濾除菌優(yōu)選使用0. 22 y m的濾膜； 4)將無(wú)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行超濾離心濃縮，得到本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白；優(yōu)選在4°C、4000rpm的條件下進(jìn)行所述超濾離心濃縮。
5.如權(quán)利要求4所述的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法，其特征在于，步驟4)的超濾離心濃縮為將所述無(wú)菌培養(yǎng)上清超濾離心濃縮5-15倍，優(yōu)選濃縮10倍，然后補(bǔ)加pH6. 5-7. 5，優(yōu)選pH7. 0的磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件下進(jìn)行超濾離心濃縮，再重復(fù)補(bǔ)加磷酸鹽緩沖液、超濾離心濃縮的步驟1-4次，優(yōu)選重復(fù)3次，得到早期培養(yǎng)濾液蛋白。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白在制備結(jié)核病或結(jié)核桿菌潛伏感染的診斷試劑或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4-5任一項(xiàng)的制備方法制備得到的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白在制備結(jié)核病或結(jié)核桿菌潛伏感染的診斷試劑或診斷試劑盒中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中診斷試劑為以權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的早期培養(yǎng)濾液蛋白，或以權(quán)利要求4-5任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的早期培養(yǎng)濾液蛋白為刺激源的IFN-Y-ELISPOT診斷試劑，優(yōu)選早期培養(yǎng)濾液蛋白的濃度為5 ii g/ml。
9.用于診斷結(jié)核病或結(jié)核桿菌潛伏感染的診斷試劑盒，其特征在于，以權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白或權(quán)利要求4-5任一項(xiàng)的制備方法制備得到的結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白為刺激源，優(yōu)選早期培養(yǎng)濾液蛋白的濃度為5 y g/ml。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷試劑盒，其特征在于，所述診斷試劑盒包括IFN-y-ELISPOT 診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白、其制備方法及其在制備用于診斷結(jié)核病和結(jié)核桿菌潛伏感染人群的試劑及試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備方法包括將H37Rv菌種接種斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)好的菌種接種到液體蘇通培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)5天后分離得到。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102746390SQ20111011141
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者徐苗, 楊蕾, 沈小兵, 王國(guó)治, 蘇城, 都偉欣, 陳保文 申請(qǐng)人:中國(guó)食品藥品檢定研究院