專利名稱：一種固相萃取柱及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固相萃取柱及其應(yīng)用，具體說(shuō)，是涉及一種凝膠固相萃取柱及其在生物樣品前處理中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于生物樣品的成分復(fù)雜，基質(zhì)干擾嚴(yán)重，因此對(duì)生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)分析檢測(cè)，一直被分析工作者所關(guān)注。一般所采取的生物樣品前處理方法包括有機(jī)溶劑沉淀法(OSP)、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)等。其中固相萃取以其操作簡(jiǎn)單、回收率高、重復(fù)性好、較綠色環(huán)保等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。固相萃取根據(jù)吸附劑的不同可分為反相固相萃取、正相固相萃取、尚子交換固相萃取和吸附固相萃取四種，需要根據(jù)所要檢測(cè)的化合物的性質(zhì)來(lái)選擇不同吸附劑的固相萃取柱。固相萃取法，是主要通過(guò)固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸附及解吸過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品 的分離、純化和富集，其主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。為了方便，固相萃取一般使用固相萃取小柱，根據(jù)不同的需求有各種規(guī)格，常見(jiàn)的有l(wèi)ml、6ml和10ml。但在具體使用中，這種方法存在如下問(wèn)題I)預(yù)裝固相萃取柱不可反復(fù)使用，使用進(jìn)口固相萃取柱的成本很聞；2)要根據(jù)目標(biāo)化合物的極性及溶解度選擇合適的固相萃取柱和洗脫溶劑，具體洗脫過(guò)程需要進(jìn)行大量前期文獻(xiàn)考察和實(shí)驗(yàn)摸索；3)若目標(biāo)化合物與吸附劑形成共價(jià)鍵，則在洗脫時(shí)可能會(huì)因與吸附劑死吸附而無(wú)法洗脫下來(lái)；4)使用時(shí)萃取流速低，影響樣品處理效率，需要外界給予一定的壓力；5)無(wú)法同時(shí)富集分子量大小相似的化合物。在固相萃取法中最常用的填料是顆粒型硅膠或鍵合相的硅膠。傳統(tǒng)的顆粒型填料為了能實(shí)現(xiàn)較高的吸附效率，減少樣品的損失，其填料的顆粒較小，而小的顆粒粒度卻會(huì)引起高的柱壓，吸附時(shí)間長(zhǎng)，因此不能用于快速高效分離和富集。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的缺陷和問(wèn)題，提供一種具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、能快速高效分離和富集分子量相近的中、小分子化合物等優(yōu)點(diǎn)的固相萃取柱及其在生物樣品前處理中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種固相萃取柱，包括玻璃柱和填料，其特征在于所述填料為羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20。所述玻璃柱的長(zhǎng)徑比推薦為I : I 30 1，較佳為10 I 20 1，最佳為15 I0本發(fā)明提供的固相萃取柱在生物樣品前處理中的應(yīng)用，主要是起分離和富集分子量相近的中、小分子化合物的作用。所述的生物樣品包括但不僅限于體液和組織勻漿，所述的體液主要是指血清和尿液。所述的分子量相近的中、小分子化合物主要是指血管緊張素類寡肽化合物、磷脂類化合物、膽汁酸類化合物和氨基酸類化合物。所述的固相萃取柱在生物樣品前處理中的應(yīng)用，包括如下步驟a)制作固相萃取柱；b)將生物樣品溶液注入柱中，待樣品溶液全部滲入固定相后，注入卒取液，根據(jù)目標(biāo)分析物選取所要收集的萃取液的體積；c)濃縮干收集的萃取液中的溶劑； d)復(fù)溶目標(biāo)物，進(jìn)行高效液相色譜或高效液相色譜-質(zhì)譜分離檢測(cè)。Sephadex LH-20凝膠的主要分離原理是分子篩，在反相溶劑中兼具反相分配的作用。由于Sephadex LH-20凝膠的分子篩作用，所以分子大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，分子小的化合物保留強(qiáng)，后被洗脫下來(lái)。本發(fā)明利用Sephadex LH-20凝膠的這一特性和固相萃取柱的優(yōu)點(diǎn)，一方面可以分離生物樣品中如蛋白質(zhì)等大分子化合物，排除其干擾，另一方面可富集分子量相近的中、小分子化合物。因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的固相萃取柱可應(yīng)用于血清、尿液及組織勻漿中的中、小分子的同時(shí)富集及分析檢測(cè)，可以有效排除干擾，保證待測(cè)物分析的高靈敏度、強(qiáng)專屬性、高準(zhǔn)確度，對(duì)于生物體代謝組學(xué)研究以及疾病的檢測(cè)具有良好的指導(dǎo)意義。另外，本發(fā)明的固相萃取柱可反復(fù)使用，幾乎不存在死吸附的現(xiàn)象，而且裝填容易，操作簡(jiǎn)單，在生物樣品分析中具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。


圖I是血清經(jīng)本發(fā)明的固相萃取柱處理得到的血管緊張素類寡肽化合物的分析圖譜。圖2是血清經(jīng)本發(fā)明的固相萃取柱處理得到的磷脂類化合物的分析圖譜。圖3是肝臟勻漿經(jīng)本發(fā)明的固相萃取柱處理得到的膽汁酸類化合物的分析圖譜。圖4是尿液經(jīng)本發(fā)明的固相萃取柱處理得到的氨基酸類化合物的分析圖譜。具體實(shí)施方法下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例I :利用本發(fā)明的固相萃取柱處理血清中的血管緊張素類寡肽取一個(gè)自制空心玻璃柱,長(zhǎng)15厘米，內(nèi)徑I. O厘米,填裝Sephadex LH-20凝膠,用甲醇不斷洗脫，填實(shí)，作為固定相。取血清1ml，加4ml甲醇，立即渦旋混勻，在4°C離心15分鐘；取上清液4. 5ml，氮?dú)獯蹈珊笥肙. 5ml甲醇溶液復(fù)溶，再次在4°C離心15分鐘；再取上清液緩慢上樣至凝膠固相萃取柱，用甲醇不斷洗脫，收集第3 9ml的洗脫流份。濃縮干甲醇后，用含20mmol/L甲酸銨及O. 1% (V V)甲酸的水溶液與乙腈按體積比為88 12混合的溶液150 μ L復(fù)溶，在4°C高速離心(20000轉(zhuǎn)/分鐘)15分鐘后取上清液，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS)進(jìn)行分析，分析條件如下色譜條件Waters,Acquity UPLC BEH C18 (50 X 2. Imm)色譜柱,柱溫 50°C ;流動(dòng)相A為含O. 1% (V : V)甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫；流速為O. 5ml/min ;檢測(cè)模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，離子源溫度為120°C ;去溶劑溫度為400°C ;氮?dú)鉃槿ト軇┖湾F孔氣，流速分別為600L/h和50L/h ;氬氣為碰撞氣,流速為O. 15ml/min ;毛細(xì)管電壓為3. O千伏；錐孔電壓為40伏；碰撞電壓為5電子伏。分析結(jié)果(檢測(cè)到的峰面積)見(jiàn)表I所示 。
權(quán)利要求
1.一種固相萃取柱，包括玻璃柱和填料，其特征在于所述填料為羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的固相萃取柱，其特征在于所述玻璃柱的長(zhǎng)徑比為I: I 30 : I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固相萃取柱，其特征在于所述玻璃柱的長(zhǎng)徑比為10 I 20 : I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固相萃取柱，其特征在于所述玻璃柱的長(zhǎng)徑比為15 I。
5.權(quán)利要求I所述的固相萃取柱在生物樣品前處理中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于用于分離和富集生物樣品中的分子量相近的中、小分子化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的分子量相近的中、小分子化合物是指血管緊張素類寡肽化合物、磷脂類化合物、膽汁酸類化合物和氨基酸類化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的生物樣品為體液或組織勻漿。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的體液為血清或尿液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用過(guò)程包括如下步驟 a)制作固相萃取柱； b)將生物樣品溶液注入柱中，待樣品溶液全部滲入固定相后，注入萃取液，根據(jù)目標(biāo)分析物選取所要收集的萃取液的體積； c)濃縮干收集的萃取液中的溶劑； d)復(fù)溶目標(biāo)物，進(jìn)行高效液相色譜或高效液相色譜-質(zhì)譜分離檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種固相萃取柱，包括玻璃柱和填料，所述填料為羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20。所述的固相萃取柱可應(yīng)用于生物樣品的前處理，尤其可應(yīng)用于血清、尿液及組織勻漿中的分子量相近的中、小分子的同時(shí)富集及分析檢測(cè)。本發(fā)明的固相萃取柱可以有效排除干擾，保證待測(cè)物分析的高靈敏度、強(qiáng)專屬性、高準(zhǔn)確度，對(duì)于生物體代謝組學(xué)研究以及疾病的檢測(cè)具有良好的指導(dǎo)意義。另外，本發(fā)明的固相萃取柱可反復(fù)使用，幾乎不存在死吸附的現(xiàn)象，而且裝填容易，操作簡(jiǎn)單，在生物樣品分析中具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102728101SQ201110087990
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者楊莉, 王崢濤, 祁萌, 耿放 申請(qǐng)人:上海中醫(yī)藥大學(xué)