專利名稱：一種轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及ー種轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法。
背景技術：
現(xiàn)有技術中，對作物中Bt蛋白含量的檢測通常采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(簡稱 ELISA)來檢測，其中雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫試劑盒較為常用，其測定原理是抗原的固相化及抗原的酶標記。該方法中，結(jié)合在固相載體表面的抗原仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性；在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開；再加入酶標記的抗原或抗體通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例；加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性和定量分析。但是，其不足在于很難測定到非靶標害蟲或天敵昆蟲體內(nèi)的Bt毒蛋白含量。因為一些非靶標天敵昆蟲間接取食Bt作物，或ー些害蟲因為取食方式的不同，如取食Bt作物的不同部位，導致攝入Bt毒蛋白的含量很少，這些害蟲或天敵昆蟲體內(nèi)的Bt毒蛋白含量一般在1納克每克體重以下，而現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫吸附劑測定法最低檢測限在1. 2納克每克體重以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于發(fā)明ー種新型的轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，解決上述問題。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下ー種轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，包括步驟如下第一歩，采集在轉(zhuǎn)Bt作物田間生長的待測昆蟲，制作待測蟲液；第二歩，取在實驗室中非轉(zhuǎn)Bt基因植物中生長的與所述待測昆蟲同種或同類昆蟲，制作對照蟲液；第三歩，用所述對照蟲液配置系列濃度的標準Bt毒蛋白；第四歩，利用酶聯(lián)免疫方法測得標準Bt毒蛋白和待測蟲液在波長為650納米處的光密度值； 第五歩，根據(jù)標準Bt毒蛋白的濃度和相對應的光密度值得到一個標準方程，根據(jù)所述標準方程計算待測蟲液的Bt毒蛋白濃度。在所述第一歩中，首先用1倍PBST沖洗緩沖液研磨蟲體獲得研磨液，然后離心所述研磨液取其上清液作為所述待測蟲液。在所述第一歩中，所述1倍PBST沖洗緩沖液按蟲體(克)比沖洗緩沖液(毫升)
3為1 10的比例使用，在IOOOOrpm的情況下離心所述研磨液5min，取其上清液作為所述待測蟲液。在所述第二步中，制作所述對照蟲液的方法與所述第一步中制作所述待測蟲液的方法相同。所述系列濃度的標準Bt毒蛋白的濃度系列為2. 5納克/毫升、1. 25納克/毫升，0. 625納克/毫升、0. 3125納克/毫升、0. 15625納克/毫升和0納克/毫升。本發(fā)明的有益效果如下(1)極高的靈敏度。按照本發(fā)明的操作方法可以測定昆蟲體內(nèi)1納克每克體重以下的Bt毒蛋白含量，而目前的檢測方法最低檢測限在1. 2納克每克體重以上。(2)本發(fā)明所測的Bt含量在0至2. 5納克范圍內(nèi)與在波長為650納米處的光密度值(0D650)存在良好的線性相關性，其相關系數(shù)(R2)達到0.99 ，重現(xiàn)性好。


圖1所示的是實施例中標準Bt蛋白濃度和其對應的平均OD65tl值之間的線性關系的示意圖。
具體實施例方式下面詳細說明本發(fā)明優(yōu)選的技術方案。目前轉(zhuǎn)Bt基因棉大量種植，以防治棉鈴蟲對棉花的危害。但有些害蟲如棉蚜也取食棉花的汁液，轉(zhuǎn)Bt基因棉卻不能殺死棉蚜。在棉蚜取食棉花汁液的同時，也會取食部分Bt毒蛋白。一些天敵昆蟲以棉蚜為食，就會間接取食Bt毒蛋白。本發(fā)明用于測定棉蚜和取食棉蚜天敵體內(nèi)的Bt毒蛋白含量，采用以下測定步驟(1)首先采集在轉(zhuǎn)Bt棉田中生長的待測棉蚜，用1倍PBST沖洗緩沖液按1 10的比例研磨蟲體，蟲體(克)沖洗緩沖液(毫升)=1 10，離心研磨液(10000rpm，5min)，取上清液作為待測蟲液。(2)然后，取自實驗室在非轉(zhuǎn)Bt基因棉上生長的棉蚜按上述方法處理，得到對照蟲液。(3)用對照蟲液配置系列標準Bt毒蛋白濃度，其濃度系列為:2.5,1.25,0. 625,0. 3125,0. 15625，Oppb (納克 / 毫升)。(4)再根據(jù)試劑公司(如Agdia公司)提供的酶聯(lián)免疫試劑盒進行如下的步驟操作A.在酶聯(lián)免疫試劑盒酶標板的每個小孔中加IOOul共軛酶；B.再在酶標板小孔中加入IOOul待測蟲液或系列濃度標準Bt毒蛋白；每個待測蟲液和每一個標準Bt毒蛋白濃度各占一孔，三個重復。(也就是每個待測蟲液和每一個標準Bt毒蛋白濃度各占三個孔)。C.將上述加液的酶標板放到濕潤的盒子里，室溫放置2小時；D.洗盤將酶標板孔里的液體倒入廢液缸，倒時要避免一個孔的液體進入另一個孔；用1倍PBST沖洗緩沖液加滿所有的孔，很快倒掉，重復7次；洗完后把板倒置在紙巾上，用手輕扣，使殘余液體全部流出；
E.加底物在酶標板每個孔里加入IOOul反應底物TMB ；F.將酶標板放在濕潤盒子里放置20min ；G.用酶標儀測定酶標板每孔中在波長為650納米處的光密度值(見下表)。表1.標準Bt蛋白濃度和其對應的平均OD65tl值
權利要求
1.ー種轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，其特征在干，包括步驟如下第一歩，采集在轉(zhuǎn)Bt作物田間生長的待測昆蟲，制作待測蟲液； 第二歩，取在實驗室中非轉(zhuǎn)Bt基因植物中生長的與所述待測昆蟲同種或同類昆蟲，制作對照蟲液；第三歩，用所述對照蟲液配置系列濃度的標準Bt毒蛋白；第四歩，利用酶聯(lián)免疫方法測得標準Bt毒蛋白和待測蟲液在波長為650納米處的光密度值；第五歩，根據(jù)標準Bt毒蛋白的濃度和相對應的光密度值得到一個標準方程，根據(jù)所述標準方程計算待測蟲液的Bt毒蛋白濃度。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，其特征在于在所述第一歩中，首先用1倍PBST沖洗緩沖液研磨蟲體獲得研磨液，然后離心所述研磨液取其上清液作為所述待測蟲液。
3.根據(jù)權利要求2所述的轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，其特征在于在所述第一歩中，所述1倍PBST沖洗緩沖液按蟲體(克)比沖洗緩沖液(毫升) 為1 10的比例使用，在IOOOOrpm的情況下離心所述研磨液5min，取其上清液作為所述待測蟲液。
4.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，其特征在于在所述第二步中，制作所述對照蟲液的方法與所述第一歩中制作所述待測蟲液的方法相同。
5.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，其特征在于所述系列濃度的標準Bt毒蛋白的濃度系列為2. 5納克/毫升、1. 25納克/毫升， 0. 625納克/毫升、0. 3125納克/毫升、0. 15625納克/毫升和0納克/毫升。
全文摘要
一種轉(zhuǎn)Bt作物生境中昆蟲體內(nèi)痕量Bt毒蛋白的檢測方法，包括步驟如下第一步，采集在轉(zhuǎn)Bt作物田間生長的待測昆蟲，制作待測蟲液；第二步，取在實驗室中非轉(zhuǎn)Bt基因植物中生長的與所述待測昆蟲同種或同類昆蟲，制作對照蟲液；第三步，用所述對照蟲液配置系列濃度的標準Bt毒蛋白；第四步，利用酶聯(lián)免疫方法測得標準Bt毒蛋白和待測蟲液在波長為650納米處的光密度值；第五步，根據(jù)標準Bt毒蛋白的濃度和相對應的光密度值得到一個標準方程，根據(jù)所述標準方程計算待測蟲液的Bt毒蛋白濃度。本法的檢測方法具有極高的靈敏度和良好的重現(xiàn)性。
文檔編號G01N33/543GK102590523SQ20111000172
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權日2011年1月6日
發(fā)明者盧延, 宋敦倫, 肖達, 薛麗, 高希武 申請人:宋敦倫