專利名稱：利用特征肽和質(zhì)譜對混合物中的單個重組蛋白進行多重定量的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于給復雜樣品中選定的多重重組蛋白，比如血清中的重組多克隆抗體或者培養(yǎng)物上清中表達的重組多克隆抗體定量的分析方法。所述方法涉及通過質(zhì)譜對肽進行高靈敏度定量。
背景技術：
需要對各種復雜蛋白樣品，例如人血清或血漿中重組蛋白的定量方法。傳統(tǒng)上，這類檢測方法采取免疫分析法的形式，比如象ELISA，利用的是抗目標蛋白的特異抗體作為特異和檢測試劑。新方法，尤其是涉及標記了同位素的肽或蛋白內(nèi)部標準的那些方法，使得質(zhì)譜可以提供這類定量的肽和蛋白檢測法。現(xiàn)有技術對利用內(nèi)部參照肽通過質(zhì)譜進行的定量已有很好的描述。但是，在應用到非常復雜的混合物上吋，比如完整血漿蛋白消化為肽而產(chǎn)生的那些混合物上時，還存在MS檢測法的動態(tài)范圍和靈敏度的問題。關于動態(tài)范圍和靈敏度的問題以前是通過將免疫親和與MS聯(lián)用于內(nèi)源生物標記物的定量分析而解決的[1-5]。本發(fā)明將重組多克隆蛋白(比如重組多克隆抗體)從復雜樣品(比如血清或血漿)或培養(yǎng)物上清中的親和純化和利用內(nèi)部參照肽經(jīng)質(zhì)譜進行的定量結合在一起。本發(fā)明通過采用親和純化步驟使得靈敏度得以提高。本發(fā)明探討的另ー個問題是分析物的完整性。傳統(tǒng)上，基于肽對蛋白進行的定量可能在完整蛋白之外將部分降解的蛋白也計量在內(nèi)。這在對生物藥物進行定量以便制作例如藥代動力學譜時尤其是個問題。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，抗體混合物的量化采用了一個初始的蛋白A純化步驟。因為蛋白A結合免疫球蛋白的Fe部分并且隨后的定量基于來自CDR區(qū)的特異標記肽，因此可能的確是完整抗體被定量。根據(jù)本發(fā)明的方法使得能夠?qū)ρ逯械目贵w進行檢測和量化，而不需要象例如ELISA中的特異性抗個體基因型的抗體。而且本發(fā)明公開的方法是通用的。只需要鑒定并確認合適的特征肽用于MS定量。要達到更高的靈敏度，有可能采用以抗特征肽的抗體進行的免疫親和步驟。因為本發(fā)明的方法涉及通過質(zhì)譜檢測獨特肽，對抗特征肽的抗體沒有高特異性，只有高親和性的要求。與ELISA相比，根據(jù)本發(fā)明的方法的另ー個優(yōu)勢是質(zhì)譜分析產(chǎn)生更大的動態(tài)范圍。發(fā)明概述本發(fā)明涉及藥代動力學研究中進行多克隆性表征和高通量分析的方法。發(fā)明涉及樣品中一或多個重組蛋白的定量方法，該方法包括的步驟有i)通過親和純化將所述ー或多個重組蛋白濃縮以得到第一級分 )消化所述第一級分從而將所述重組蛋白中每ー個的一或多個特異特征肽釋放到第二級分中
iii)給所述第一級分和/或所述第二級分加入所述重組蛋白中每ー個的一或多個內(nèi)部參照肽iv)任選地，利用偶聯(lián)了抗特征肽抗體的樹脂將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽濃縮，然后將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽釋放從而得到第三級分；和/或任選地，利用樹脂以能夠分開樣品的化學物將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽濃縮，從而使目標肽得以濃縮V)通過質(zhì)譜分析對所述特征肽進行量化。所述方法可以用于樣品中一或多個蛋白的定量。在優(yōu)選實施方案中，方法被用于樣品中兩個或更多個蛋白，比如重組多克隆抗體的定量。所述樣品可以是血清或血漿樣品、細胞培養(yǎng)物或生物反應器上清或者是處理中的重組多克隆抗體樣品。方法可以用于藥代動力學研究中確定單個抗體的體內(nèi)清除率。在另ー個實施方案中，方法被用于重組多克隆抗體樣品中藥物的多克隆性表征。再一個實施方案中，本發(fā)明涉及方法在與制備重組多克隆抗體相關聯(lián)的定量一或多個重組蛋白中的用途。定量可以在藥品和/或藥物的上游和/或下游加工過程中進行。發(fā)明的ー個關鍵特點是它g在建立針對事先選定的特異重組蛋白，而不是將ー或多個樣品的所有未知成分互相進行比較的定量方法。根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于分析血清樣品中的一或多個同源重組蛋白，其中所述血清樣品還包含了其他同源蛋白。本發(fā)明的方法能促進對血清中的多克隆抗體組合物中單個抗體進行的分析，以便無需抗獨特型抗體就能進行例如藥代動力學研究，而不是象在例如基于ELISA的技術中那樣需要抗獨特型抗體。相應地，在比如藥代動力學研究中，可以在給藥后確定和/或監(jiān)測有需要的個體中的重組多克隆抗體濃度。在一個實施方案中，純化是通過蛋白A或類似的Fe結合分子進行的，隨后通過測量優(yōu)選位于抗體可變結構域之一的肽來進行定量。這樣確保了被測量的分析物不是降解產(chǎn)物，因為它依賴于Fe和Fab的同時存在。定義和縮寫名詞“特征肽(signature peptide (s)) ”是指ー或多個不同的肽被選中作為樣品中給定蛋白的指示片段/肽(monitor fragment/peptide)。名詞“內(nèi)部參照肽”是指與特征肽氨基酸序列相同的同位素標記的肽。“內(nèi)部參照肽”可以是相應特征肽的任何改造形式，其I)被適宜的結合劑識別為與特征肽等同或者生物物理特性表明是化學等同物，和2)它們的差異可以通過質(zhì)譜來區(qū)別，通過直接測量分子量或者通過對片段進行質(zhì)量測量(例如，通過MS/MS分析)，或者通過另ー種同等的方式。名詞“抗體”是指任何物種的任何種類的免疫球蛋白分子，或者由其衍生的任何分子，或者任何其他特異性結合剤，所述結合劑是通過對保守分子支架進行改造從而能夠特異結合分析物或監(jiān)測片段，比如重組蛋白和/或特征肽。名詞“抗肽抗體”被作為“抗特征肽抗體”的同義詞使用，它可以是任何類型的抗體(以上廣泛意義上)，所述抗體能夠與肽結合，比如特征肽和內(nèi)部參照肽從而從樣品或經(jīng)過處理的樣品中富集。總的來說，本文中任何使用抗體之處應理解為可以通過另ー種結合齊U，比如親和體或抗體模擬物來實現(xiàn)的目的。在一個實施方案中，抗肽抗體與肽的結合不需要特異性很高-即在ー個實施方案中，高親和カ(affinity)和/或親合力(avidity)更重要。
名詞“結合劑(binding agent) ”可以是多種不同的分子、生物細胞或聚集物中的任何ー種。在本文語境中，在檢測前用結合劑結合待檢測的分析物以便使之富集，其特異結合方式使得一或多種分析物被結合并富集。蛋白、多肽、肽、核酸(寡核苷酸和多聚核苷酸)、抗體、配體、多糖、微生物、受體、抗生素、測試化合物(特別是通過組合化學產(chǎn)生的那些)均可以各自作為結合剤。名詞“結合”包括任何物理附著或密切關聯(lián)，可以是永久性或暫時的。一般來說，可逆結合包括促進目的分子和被測量的分析物之間的物理附著的電荷相互作用、氫鍵、疏水作用、范德華力等方面。名詞“蛋白”是指任何不論長度或翻譯后修飾的氨基酸鏈。蛋白可以以單體或多聚體存在，包含兩個或以上的組裝的多肽鏈、蛋白片段、多肽、寡肽或肽?！っ~“重組多克隆抗體”是指利用重組技術制備的重組抗體分子的精選組合物。本發(fā)明特別涉及對重組多克隆抗體組合物的標準，其中所述抗體是利用通常用于商業(yè)生產(chǎn)重組抗體的細胞系表達的，例如以上提及的人或其它哺乳動物細胞系之一。在本發(fā)明的語境中，抗體被認為是重組的，如果其編碼序列已知，并且是由雜交瘤或永生化B細胞表達的。在本發(fā)明的語境中，名詞“重組蛋白”包括“重組多克隆抗體”。重組多克隆抗體描述了由不同抗體分子組成的組合物，其能夠與相同或不同抗原上的多個不同特異性抗原決定簇結合或反應。多克隆抗體還可以被看作是“單克隆抗體雞尾酒”。多克隆抗體的變化性位于構成多克隆抗體的各個抗體中所謂的可變區(qū)，特別是互補決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3區(qū)中?？梢酝ㄟ^本發(fā)明的方法進行表征的多克隆抗體可以是任何來源，例如嵌合的、人源化的或者完全來自人。根據(jù)本發(fā)明的重組多克隆抗體優(yōu)選包含至少兩個不同抗體群。名詞“多克隆性(polyclonality)”是指這樣的事實，即重組多克隆蛋白包含限定數(shù)量的蛋白，因此與傳統(tǒng)重組蛋白或單克隆抗體相比是多克隆的。這個名詞可以用于在基因和蛋白水平描述多克隆性。重組多克隆蛋白的變化性特征在于重組多克隆蛋白中各個成員的氨基酸序列的不同。名詞“組成變化(compositional variability) ”是指最終批次之間單個重組蛋白或抗體的實際量的測量變化。名詞“免疫球蛋白”常用作血液或血清中存在的抗體混合物的總稱。因此血清來源的多克隆抗體經(jīng)常被稱為免疫球蛋白或Y球蛋白。但是，“免疫球蛋白”還可以用于命名來自其他來源的抗體的混合物，例如重組免疫球蛋白。所有免疫球蛋白不論其特異性，具有共同的四個多肽鏈結構兩個相同的重鏈，每個取決于表達狀態(tài)，可能攜帯共價附著的寡糖基團；和兩個相同的通常未被糖基化的輕鏈。重鏈和輕鏈通過ニ硫鍵被連在一起。重鏈還通過ニ硫鍵相互連接。所有四個多肽鏈均含有分別位于羧基端和氨基端的恒定和可變區(qū)。免疫球蛋白根據(jù)其重鏈成分被分為5個主要的類型IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。輕鏈有兩個類型K (kappa)和λ (lambda)。每種分子可能含有κ或Y，但不會兩者都含有。IgG和IgA還可以進ー步劃分為由每個類型中氨基酸序列的細微差別造成的亞型。在人體中發(fā)現(xiàn)了四個IgG亞型:1861、1862、1863和化64。在小鼠中也發(fā)現(xiàn)了四個IgG亞型IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3。在人中，有三個IgA亞型=IgAl, IgA2和IgA3。親和體:親和體分子是小的強親和力蛋白分子，可以經(jīng)改造與大量靶蛋白特異結合。
MS是質(zhì)譜。MS/MS是串聯(lián)質(zhì)譜。MRM是多反應監(jiān)測或等同的技術，比如例如SRM(單個/選定反應監(jiān)測)。B細胞受體是位于B細胞外表面的跨膜受體蛋白。受體的結合部分由膜結合抗體構成，這些抗體與所有抗體一祥，含有獨特的隨機決定的抗原結合位點。T細胞受體或TCR是在T淋巴細胞(或T細胞)表面發(fā)現(xiàn)的分子，它們通常負責識別與主要組織相容性復合體(MHC)分子結合的抗原。在95%的T細胞中，是由α和β鏈構成的異ニ聚體，而5%Τ細胞中含有由Y和δ鏈構成的TCRs。
附圖
描述圖I:顯示A992特征肽的峰面積與AQUA肽的比率關系的標準曲線，其中在一系列空白食蟹猴(Cynomolgus monkey)血衆(zhòng)中加入不同濃度的A992。姆個樣品加入I pmol的A992 AQUA肽。一式三份確定每個濃度處的比率。以線性回歸對數(shù)據(jù)進行擬合，虛線顯示最佳擬合線性回歸的95%置信帯。圖2:顯示A1024特征肽的峰面積與AQUA肽的比率關系的標準曲線，其中在空白食蟹猴血漿集合中加入不同濃度的A1024。每個樣品加入I pmol的A1024 AQUA肽。一式三份確定每個濃度處的比率。以線性回歸對數(shù)據(jù)進行擬合，虛線顯示最佳擬合線性回歸的
95%置信帶。圖3:被給予8mg/kg藥物前導物的食蟹猴中的A992和A1024的血漿濃度ー時間曲線。在給予藥物前導物后的O. 5到48小時確定A992和A1024的濃度。圖4:0. 2yg/mト100yg/ml范圍內(nèi)的標準曲線，一式三份(ー個異常值)。線性曲線顯示了加標(spiked)血清樣品中抗體濃度與相對反應特征肽/參照肽的關系。同時測量兩種抗體。上圖代表A992的標準曲線，下圖代表A1024的標準曲線。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于給復雜樣品中選定的多重重組蛋白，比如血清中的重組多克隆抗體或者細胞或組織培養(yǎng)物上清中表達的重組多克隆抗體定量的分析方法。所述方法涉及通過質(zhì)譜對肽進行高靈敏度定量。發(fā)明涉及樣品中一或多個重組蛋白的定量方法，包括的步驟有i)通過親和純化將所述ー或多個重組蛋白濃縮以得到第一級分ii)消化所述第一級分從而將所述重組蛋白中每ー個的一或多個特異特征肽釋放到第二級分中。在消化前，任選對所述第一級分進行還原和/或烷基化。iii)給所述第一級分和/或所述第二級分加入所述重組蛋白中每ー個的一或多個內(nèi)部參照肽iv)任選地，利用偶聯(lián)了抗特征肽的抗體的樹脂將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽濃縮，然后將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽釋放從而得到第三級分；和/或任選地，利用樹脂和能夠分開樣品的化學物將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽濃縮，從而使目的肽得以濃縮V)通過質(zhì)譜分析對所述特征肽進行量化vi)任選地，用樣品中加有濃度已知的相應蛋白的制品重復步驟i)到V)以便獲得蛋白標準曲線vi)將步驟V)中獲得的所述特征肽的定量與步驟vi)中獲得的蛋白標準曲線進行比較，得到所述樣品中所述ー或多個重組蛋白的量。在一個實施方案中，該方法得到了所述樣品中所述ー或多個重組蛋白的絕對定量。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及樣品中兩種或多種重組蛋白的定量方法，包括如上限定的步驟i)一vi)。如果對特定應用有利，步驟ii)和iii)可以互換。步驟i)涉及重組蛋白的濃縮(up-concentration)以上步驟i)可以包括現(xiàn)有技術中 描述的濃縮/富集一或多個重組蛋白的任何方法-富集到的級分被稱為第一級分。在一個實施方案中，濃縮/富集捕獲到完整蛋白，t匕如諸如完整重組多克隆抗體的完整重組蛋白。通過親和層析進行的分離是基于對特定結合分子的親和カ的不同。將結合分子或者復數(shù)種結合分子(這些不同選項在下文中統(tǒng)稱為結合分子)固定在層析介質(zhì)上，含有重組蛋白的樣品被上樣到親和柱上，上樣條件有利于重組蛋白中各個成員與固定的結合分子之間的相互作用。對固定的結合分子沒有親和カ的蛋白收集到柱子流過液中，隨后在能夠抵消結合的條件(例如，低pH、高鹽濃度或者高配體濃度)下，將對固定化結合分子有親和力的蛋白從柱子上洗脫。濃縮/富集可以利用蛋白A進行。可以將蛋白A固定到支持物上，用于從原始蛋白混合物(比如血清)中純化總IgG。蛋白A以高親和力結合人IgGl和IgG2，以及小鼠IgG2a和IgG2b。蛋白A與人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgGl以中等親和カ結合。蛋白A還可以用于純化來自其他動物，包括猴的抗體。蛋白A的一個重組形式被稱為MabSelectSnRe。在一個實施方案中，步驟i)中使用的親和層析的基質(zhì)由固定在瓊脂糖珠子上的葡萄球菌蛋白A構成。替代品包括蛋白A-SEPHAR0SE ;固定在瓊脂糖上的蛋白；與活化的精氨酸-瓊脂糖偶聯(lián)的蛋白A ;以及偶聯(lián)了磁珠、橡膠珠和瓊脂糖珠、聚合物珠、聚苯こ烯珠和PEG珠的蛋白A。除了蛋白A，以上步驟i)中可以使用其他能夠結合免疫球蛋白的蛋白，比如能夠結合免疫球蛋白的細菌蛋白，象例如蛋白G、蛋白A/G和蛋白し就被識別的抗體部分和能夠結合的抗體物種和類型而言，這些免疫球蛋白結合蛋白的抗體結合特性各不相同。發(fā)明還涉及使用其他免疫球蛋白結合蛋白，比如象鏈球菌蛋白G、兔抗小鼠IgG免疫球蛋白、在其他物種中產(chǎn)生的抗人IgG免疫球蛋白和抗猴IgG免疫球蛋白。本發(fā)明還涉及在步驟i)中使用其他基于親和力的純化方法。這些包括抗體的任何目標分子、Fe受體、Con A(例如來自洋刀豆(Canavalia ensiformis) (Jack bean)的刀豆凝集素A;其識別糖蛋白)、其他類型的凝集素親和層析、抗抗體可變部分的抗體或者抗抗體恒定部分的抗體(比如抗Fe部分的抗體)。磁珠上的抗體也可以用于步驟i)。另ー個實施方案中，步驟i)中使用了循環(huán)免疫親和。另ー個實施方案中，步驟i)包括利用樹脂和/或柱子純化ー或多種抗體，所述樹脂和/或柱子偶聯(lián)了被一或多種重組蛋白，比如一或多種重組多克隆抗體識別的一或多種肽或靶抗原。在一個實施方案中，所述ー或多種蛋白的純化可以借助與結合的靶抗原的相互作用來進行。初始的濃縮步驟，比如步驟i)中通過蛋白A進行的富集，可以批量進行，比如以96孔格式進行或者作為多維LC-MS系統(tǒng)的一部分。替代地，可以離線分批進行。
步驟ii)涉及還原、烷基化和消化在步驟i)的初始濃縮之后，用選定的蛋白酶消化第一級分以便從每種待量化的蛋白中將一或多種特異性特征肽釋放到第二級分中。在一個實施方案中，第一級分在消化前被還原和烷基化。第二級分包含被蛋白酶釋放的特征肽和其他肽。所述第一和/或第二級分的還原、烷基化和消化可以通過本領域已知的任何方法進行。例如肽可以利用ニ硫蘇糖醇(DTT)還原，然后用例如4-こ烯基吡啶、碘こ酰胺或碘こ酸進行烷基化。第一級分(其中有希望測量的一或多種選定的重組蛋白)優(yōu)選用合適的蛋白酶，比如胰蛋白酶基本完全d消化，或者如果能夠以可重復的方式進行部分消化，從而產(chǎn)生肽(包括選定的特征肽)。對于其序列在重組蛋白序列中出現(xiàn)一次的特征肽，理想情況下，這一消化應當產(chǎn)生與第一級分中重組蛋白分子數(shù)量相同的特征肽分子。消化可以首先(用例如脲或鹽酸胍)將蛋白樣品變性，(用例如ニ硫蘇糖醇或巰基こ醇)還原蛋白中的ニ硫鍵，(通過加入碘こ酰胺)將半胱氨酸烷基化，并最終(在除去或者稀釋變性劑后)加入選定的蛋白水解酶，比如胰蛋白酶，然后溫育以便消化進行。在一個優(yōu)選實施方案中，變性不會造成蛋白被化學修飾。變性可以利用與MS相容的ー或多種去污劑進行。在一個實施方案中，RapiGestTM SF Surfactant (Waters)被用于加強蛋白的酶解消化，并代替脲或鹽酸胍作為還原和烷基化過程中的變性劑。溫育后，通過加入化學抑制劑(例如DFP或PMSF)或者通過(經(jīng)加熱或加入變性齊U，或者兩者)變性、或者通過酸化、或者除去(如果諸如胰蛋白酶的蛋白酶位于固相支持物上)蛋白酶(比如胰蛋白酶)來終止蛋白酶(例如胰蛋白酶)的作用。為了避免之后樣品中殘余的蛋白水解活性對抗體的破壞，破除蛋白酶活性很重要。消化可以由任何蛋白酶進行，包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、Asp-N、Glu-C, Lys-C,Iys-N和Arg-C(蛋白酶的特異性參見下文中的表格)?？梢允褂茅`種以上的蛋白酶，比如2、3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上的蛋白酶。 在一個實施方案中，消化可以通過化學降解來進行。
權利要求
1.樣品中一或多種重組蛋白的定量方法，所述方法包括以下步驟 i)通過親和純化將所述一或多種重組蛋白濃縮以得到第一級分 ii)消化所述第一級分從而將所述重組蛋白中每一種的一或多個特異性特征肽釋放到第二級分中 iii)給所述第一級分和/或所述第二級分加入所述每一特征肽的一或多個內(nèi)部參照肽 iv)通過質(zhì)譜分析對所述特征肽進行定量。
2.權利要求I所述的方法，其中所述方法還包括以下步驟 i)用加標了濃度已知的相應蛋白制品的樣品重復權利要求I中的步驟i)_iv)，以得到蛋白標準曲線，和 ii)將權利要求I的步驟iv)中得到的所述特征肽的定量與步驟i)中獲得的蛋白標準曲線進行比較，并得到所述樣品中所述一或多種重組蛋白的定量。
3.權利要求I所述的方法，其中所述方法還包括在權利要求I中步驟ii)的消化之前進行的還原和/或烷基化步驟。
4.權利要求I所述的方法，其中所述方法還包括利用樹脂以化學物質(zhì)將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽進行濃縮的步驟，所述化學物質(zhì)能夠?qū)悠贩旨壏蛛x從而使目標肽得以濃縮。
5.權利要求I所述的方法，其中所述方法還包括利用偶聯(lián)了抗特征肽抗體的樹脂將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽濃縮，然后將所述特征肽和所述內(nèi)部參照肽釋放從而得到第三級分的步驟。
6.權利要求I所述的方法，其中權利要求I中步驟i)中的親和純化包括與一或多種免疫球蛋白結合蛋白結合。
7.權利要求I所述的方法，其中權利要求I中步驟i)中的親和純化包括與一或多種細菌性免疫球蛋白結合蛋白結合。
8.權利要求6所述的方法，其中所述免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
9.權利要求8所述的方法，其中所述人免疫球蛋白是人IgGl、人IgG2、人IgM、人IgA或人IgE。
10.權利要求6所述的方法，其中所述免疫球蛋白是小鼠、兔、山羊、豬、奶牛、駱駝、犬、貓、雞、魚或猴免疫球蛋白。
11.權利要求10所述的方法，其中所述小鼠免疫球蛋白是小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3或小鼠IgGl。
12.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與蛋白A結合。
13.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與蛋白G結合。
14.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與蛋白A/G結合。
15.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與蛋白L結合。
16.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與抗多克隆抗體恒定區(qū)的抗體結合。
17.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與Fe受體結合。
18.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與ConA結合。
19.權利要求I所述的方法，其中步驟i)中的親和純化包括與抗體的靶結合。
20.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用胰蛋白酶進行的。
21.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用胰凝乳蛋白酶進行的。
22.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用Asp-N進行的。
23.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用Glu-C進行的。
24.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用Lys-C進行的。
25.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用Iys-N進行的。
26.權利要求I所述的方法，其中步驟ii)中的消化是用Arg-C進行的。
27.權利要求I所述的方法，其中消化基本上進行完全。
28.權利要求3所述的方法，其中還原是用二硫蘇糖醇(DTT)進行的。
29.權利要求3所述的方法，其中還原是用巰基乙醇進行的。
30.權利要求3所述的方法，其中烷基化是用4-乙烯吡啶進行的。
31.權利要求3所述的方法，其中烷基化是用碘乙酰胺進行的。
32.權利要求3所述的方法，其中烷基化是用碘乙酰胺和/或碘乙酸進行的。
33.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽標記了13C。
34.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽標記了15N。
35.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽標記了180。
36.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽是通過合成后標記方法制備的。
37.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽是通過化學合成制備的。
38.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽是在活細胞內(nèi)通過代謝引入而制備的。
39.權利要求38所述的方法，其中所述細胞是微生物的組成部分。
40.權利要求38所述的方法，其中所述細胞是培養(yǎng)中的哺乳動物細胞。
41.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽是在體外制備的。
42.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括用氘代乙酸根標記伯胺基團。
43.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括n-末端特異試劑。
44.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括肽羧基基團的全甲基酯化。
45.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括在切割過程中給胰蛋白酶解肽C端添加雙18O標記。
46.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括N端肽標記法。
47.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括NIT (N-末端同位素編碼的標記法)。
48.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括C-末端妝標記法。
49.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括與N末端和C末端肽標記法不同的標記法。
50.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括基于氨基酸的標記法。
51.權利要求I所述的方法，其中步驟iii)中的一或多種內(nèi)部參照肽的制備方法包括給每個肽中的一個氨基酸進行基于氨基酸的標記。
52.權利要求4所述的方法，其中所述抗特征肽抗體是來源于多克隆血清的抗體。
53.權利要求4所述的方法，其中所述抗特征肽抗體是單克隆抗體。
54.權利要求I所述的方法，其中所述內(nèi)部參照肽具有與重組多克隆抗體和/或TcR內(nèi)的序列相同的序列。
55.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的恒定區(qū)內(nèi)。
56.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的可變區(qū)內(nèi)。
57.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的輕鏈內(nèi)。
58.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的重鏈內(nèi)。
59.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的框架區(qū)內(nèi)。
60.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的高變結構域內(nèi)。
61.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的互補決定區(qū)(⑶幻內(nèi)。
62.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的⑶Rl內(nèi)。
63.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的⑶R2內(nèi)。
64.權利要求54所述的方法，其中所述重組多克隆抗體內(nèi)的序列位于所述重組多克隆抗體的⑶R3內(nèi)。
65.權利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于離子交換的分離方法進行濃縮。
66.權利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于反相的分離方法進行濃縮。
67.權利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于親水相互作用的分離方法進行濃縮。
68.權利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于疏水相互作用的分離方法進行濃縮。
69.權利要求4所述的方法，其中所述特征肽利用基于大小排阻的分離方法進行濃縮。
70.權利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗體是在兔中產(chǎn)生的。
71.權利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗體是在雞中產(chǎn)生的。
72.權利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗體是在山羊中產(chǎn)生的。
73.權利要求5所述的方法，其中所述抗特征肽抗體是在綿羊中產(chǎn)生的。
74.權利要求5所述的方法，其中所述方法按批次進行。
75.權利要求5所述的方法，其中所述方法是以96孔形式進行。
76.權利要求5所述的方法，其中所述方法是作為多維LC-MS系統(tǒng)的一部分進行的。
77.權利要求5所述的方法，其中所述方法是離線進行的。
78.權利要求5所述的方法，其中所述方法包括，所述特征肽和參照肽被直接洗脫到所述離子源中。
79.權利要求5所述的方法，其中所述方法包括，所述特征肽和參照肽被直接洗脫到ESI源中。
80.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括通過ESI進行電離。
81.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括通過MALDI進行電離。
82.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-MS分析，后者包括二維或多維色譜的分級分離。
83.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-MS分析，后者包括多維色譜。
84.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-MS分析，后者包括一維LC分離。
85.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-MS分析，后者包括二維或多維LC分離。
86.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)、Q-TOF或三重四極桿的方法。
87.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-MS/MS。
88.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-ESI-MS/MS。
89.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括LC-MALDI-MS/MS。
90.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于多重反應監(jiān)測(MRM)的方法。
91.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括提取的離子色譜圖。
92.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于離子阱的方法。
93.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于ESI-三重四極桿的方法。
94.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于Orbitrap的方法。
95.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于ESI-TOF的方法。
96.權利要求I所述的方法，其中所述質(zhì)譜包括基于ESI-Q-TOF的方法。
97.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含兩種或以上的重組多克隆抗體。
98.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含兩種或以上的嵌合多克隆抗體。
99.權利要求98所述的方法，其中所述兩種或以上的親和多克隆抗體包含人部分和小鼠部分。
100.權利要求99所述的方法，其中所述人部分是多克隆抗體的恒定區(qū)。
101.權利要求99所述的方法，其中所述人部分是多克隆抗體的可變區(qū)。
102.權利要求99所述的方法，其中所述小鼠部分是多克隆抗體的恒定區(qū)。
103.權利要求99所述的方法，其中所述小鼠部分是多克隆抗體的可變區(qū)。
104.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含一或多種同源物。
105.權利要求I所述的方法，其中所述樣品是血清樣品。
106.權利要求I所述的方法，其中所述樣品是血漿樣品。
107.權利要求I所述的方法，其中所述樣品是細胞培養(yǎng)物上清。
108.權利要求I所述的方法，其中所述樣品是生物反應器上清。
109.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含用于治療和/或預防兩種或以上傳染性疾病的重組多克隆抗體。
110.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含用于治療和/或預防兩種或以上細菌感染的重組多克隆抗體。
111.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含用于治療和/或預防兩種或以上病毒感染的重組多克隆抗體。
112.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含用于治療和/或預防兩種或以上癌癥形式的重組多克隆抗體。
113.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含由不同重組多克隆抗體組成的重組多克隆抗體。
114.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含重組多克隆抗體，所述重組多克隆抗體由不同重組多克隆抗食蟹猴D(RhD)抗體組成，比如SymOOl。
115.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含重組多克隆抗牛痘病毒抗體來代替現(xiàn)有的抗牛痘高免疫免疫球蛋白(VIG)，比如Sym002。
116.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含針對抗呼吸道合胞病毒的重組多克隆抗體，比如Sym003。
117.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含針對人類癌抗原的重組多克隆抗體。
118.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含針對人EGFR的重組多克隆抗體。
119.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含針對細菌性病原體的重組多克隆抗體。
120.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含針對病毒性病原體的重組多克隆抗體。
121.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含針對傳染性疾病目標的重組多克隆抗體。
122.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含一或多種重組B細胞受體。
123.權利要求I所述的方法，其中所述一或多種重組蛋白包含一或多種重組T細胞受體。
124.權利要求1-123中任一項所述方法在給樣品中一或多種重組蛋白定量的用途。
125.權利要求124所述的用途，其中所述方法被用于確定血清中構成重組多克隆抗體組合物的各個抗體從個體內(nèi)的清除。
126.權利要求124所述的方法，其中所述方法被用于個體的藥物代謝動力學研究。
127.權利要求125或126所述的用途，其中所述個體是人。
128.權利要求125或126所述的用途，其中所述個體是嚙齒動物。
129.權利要求125或126所述的用途，其中所述個體是猴。
130.權利要求124所述的用途,其中所述方法被用于表征原料藥(drugsubstance)的多克隆性。
131.權利要求124所述的用途,其中所述方法被用于表征藥物制劑(drugproduct)的多克隆性。
132.權利要求124所述的用途，其中所述方法被用于給過程中樣品的一或多種重組抗體定量。
133.權利要求I所述的方法與重組多克隆抗體的制備有關的用途。
134.權利要求I所述的方法與在原料藥生產(chǎn)的上游或下游制備重組多克隆抗體有關的用途。
135.權利要求I所述的方法與在藥物制劑生產(chǎn)的上游或下游制備重組多克隆抗體有關的用途。
136.權利要求I所述的方法在挑選用于多克隆細胞庫的克隆中的用途。
137.權利要求I所述的方法，其中待定量的重組蛋白的數(shù)量是兩種或以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及給復雜基質(zhì)中選定的多種重組蛋白(比如血清中的重組多克隆抗體或者表達在培養(yǎng)物上清中的重組多克隆抗體)定量的分析方法。
文檔編號G01N33/68GK102687020SQ201080056227
公開日2012年9月19日 申請日期2010年10月7日 優(yōu)先權日2009年10月9日
發(fā)明者H.內(nèi)斯泰德, J.W.森, P.F.詹森, T.弗蘭德森 申請人:西福根有限公司