專利名稱：：使用紙基微流體系統(tǒng)的定量和自校準(zhǔn)化學(xué)分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性地涉及定量化學(xué)分析系統(tǒng)，特別是涉及使用紙基微流體系統(tǒng)的化學(xué)分析。
背景技術(shù)：
：用于獲得分析物濃度的精確定量測(cè)量結(jié)果的常見方法需要使用儀器深入分析。這種用于測(cè)量溶液中分析物濃度的方法需要使用利用光譜、色譜、NMR、原子吸收或使用起來(lái)還可能困難且費(fèi)時(shí)的其它分析程序的昂貴儀器。而且，測(cè)試可能需要相對(duì)較大體積的溶液。用于包括化學(xué)分析在內(nèi)的多種應(yīng)用中的紙基微流體系統(tǒng)的用途在Martineζ，A.W.；Phillips,S.Τ.；Butte,Μ.；ffhitesides,G.Μ.,PatternedPaperasaPlatformforInexpensive,Low-volume,PortableBioassays,Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,1318-1320中首次提出。使用這種系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是它們的低成本和輕便性。此外，樣品體積量可以顯著減少，這在所獲得的樣品量有限的情況下有利(例如來(lái)自醫(yī)院患者的生物樣品)。應(yīng)注意本申請(qǐng)所用術(shù)語(yǔ)“紙”指除紙外還包括織造織物和非織造材料的纖維素材料。在申請(qǐng)人的澳大利亞臨時(shí)專利申請(qǐng)2008903553和2008905776中描述了這種紙基微流體系統(tǒng)的進(jìn)一步進(jìn)展。在申請(qǐng)人的微流體系統(tǒng)中，在紙基材的表面上提供疏水/親水反差，從而限定由于毛細(xì)作用而無(wú)需外部泵送來(lái)控制水溶液輸送的微流體通道。可以通過(guò)使受試樣品與指示劑溶液反應(yīng)使用該微流體系統(tǒng)和比色法來(lái)測(cè)定受試樣品的濃度。然而結(jié)果的精確性受到多種外界因素影響，包括諸如環(huán)境溫度和相對(duì)濕度的環(huán)境條件、紙的質(zhì)量和使用期限、用于記錄結(jié)果的掃描儀或相機(jī)的質(zhì)量和設(shè)置，或者電子傳送結(jié)果的手段。這可以導(dǎo)致比色分析結(jié)果的顯著誤差。因此，使用不同的紙基材、使用不同的掃描儀或相機(jī)測(cè)量同一受試樣品，或者使用不同電子傳送系統(tǒng)和不同軟件傳送同一受試樣品可以導(dǎo)致結(jié)果的顯著變化。相同的原理可以與基于紙的ELISA型分析一起使用，其中生物綴合物(bioconjugate)被固定到紙上。發(fā)明概述因此本發(fā)明的一個(gè)目的是使用紙基微流體系統(tǒng)來(lái)更精確地測(cè)定受試樣品的濃度。為此，提供一種使用具有多個(gè)親水測(cè)試區(qū)的紙基微流體系統(tǒng)來(lái)測(cè)定受試流體樣品濃度的方法，其包括a)在至少一個(gè)所述測(cè)試區(qū)上施加所述受試流體樣品；b)在其它所述測(cè)試區(qū)上施加具有不同已知濃度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物；c)向每個(gè)所述測(cè)試區(qū)引入指示劑溶液從而與所施加的流體樣品反應(yīng)并產(chǎn)生作為流體樣品濃度的函數(shù)的顏色強(qiáng)度變化；以及d)比較受試流體樣品和標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物之間的顏色強(qiáng)度差異，從而測(cè)定所述受試流體樣品的濃度。標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物的施加可以在施加受試樣品之前或之中進(jìn)行。使用具有不同已知濃度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物為本發(fā)明方法提供內(nèi)部自校準(zhǔn)。這可以致使獲得更精確的結(jié)果而不受之前所述的多個(gè)外部因素的影響。這是因?yàn)榛谑茉嚵黧w樣品和標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物之間的相對(duì)差來(lái)測(cè)定測(cè)試結(jié)果，從而避免了與之前所述的外部因素相關(guān)的影響。因此可以使用多種儀器(包括臺(tái)式掃描儀或甚至手機(jī)照相機(jī))來(lái)記錄結(jié)果。因此可以將圖像導(dǎo)入圖形程序如AdobePhotoshop并轉(zhuǎn)化成灰度模式。然后可以使用軟件的直方圖功能來(lái)修飾主要顏色強(qiáng)度。然后可以優(yōu)選地如下獲得每個(gè)測(cè)試區(qū)的最終平均強(qiáng)度值從空白對(duì)照區(qū)的平均強(qiáng)度減去測(cè)得的平均強(qiáng)度并轉(zhuǎn)化為圖以獲得校準(zhǔn)曲線，該圖是平均強(qiáng)度相對(duì)于溶液濃度的圖。ELISA是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linkedimmunosorbentassay)。紙基微流體裝置可以設(shè)計(jì)為進(jìn)行ELISA類測(cè)定。在該測(cè)定中，將一定量的抗原固定到紙表面上，在紙表面上施加特異抗體以使其可以與所述抗原結(jié)合。該抗體與酶結(jié)合。在ELISA的最后步驟中，添加物質(zhì)以將酶轉(zhuǎn)化成某種可檢測(cè)信號(hào)。還提供一種用于測(cè)定受試流體樣品濃度的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括a)具有多個(gè)親水測(cè)試區(qū)的紙基微流體系統(tǒng)，所述受試流體樣品可被施加到至少一個(gè)測(cè)試區(qū)上；b)不同已知濃度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物，用于施加在其它所述測(cè)試區(qū)上；c)指示劑溶液，用于引入到每個(gè)測(cè)試區(qū)從而與流體樣品反應(yīng)并產(chǎn)生作為流體樣品濃度的函數(shù)的顏色強(qiáng)度變化，其中通過(guò)比較受試流體樣品和標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物之間的顏色強(qiáng)度差異能夠測(cè)定受試流體樣品的濃度。附圖簡(jiǎn)述方便的是參照說(shuō)明本發(fā)明方法的附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明。本發(fā)明可以有其它實(shí)施方案，因此不應(yīng)將附圖的具體內(nèi)容理解為是對(duì)本發(fā)明說(shuō)明進(jìn)行的取代。在圖中圖1示出用于產(chǎn)生N02_校準(zhǔn)曲線的本發(fā)明紙基微流體系統(tǒng)；圖2示出從圖1所示微流體系統(tǒng)的測(cè)試結(jié)果獲得的NO2-校準(zhǔn)曲線；圖3示出用于測(cè)定未知樣品的N02_濃度的本發(fā)明紙基微流體系統(tǒng)；圖4示出從圖3所示微流體系統(tǒng)的測(cè)試結(jié)果獲得的校準(zhǔn)曲線；圖5示出用于測(cè)量未知樣品的尿酸(UA)濃度的本發(fā)明紙基微流體系統(tǒng)；圖6示出從圖5所示微流體系統(tǒng)的測(cè)試結(jié)果獲得的校準(zhǔn)曲線。發(fā)明詳述現(xiàn)在將參照描述本發(fā)明不同可能應(yīng)用的以下實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。然而應(yīng)理解本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。使用本申請(qǐng)人上述臨時(shí)申請(qǐng)中所述的技術(shù)制造紙基微流體系統(tǒng)。選擇Whatman濾紙(No.4)作為基材來(lái)制備微流體系統(tǒng)。使用兩種方法一等離子體處理和噴墨印刷進(jìn)行制造。前一圖案化方法基于這樣的原理使用真空等離子體反應(yīng)器(K1050X等離子體灰化器(QuorumEmitech,UK))和預(yù)制的掩模來(lái)對(duì)預(yù)先已用烷基烯酮二聚體(Wax88konz,BASF)疏水化的濾紙樣品進(jìn)行選擇性去疏水化。后一方法使用市售臺(tái)式噴墨打印機(jī)將烯基烯酮二聚體(Precis900,HerculesAustraliaPtyLtd)選擇性施加到濾紙上。制造具有6個(gè)檢測(cè)區(qū)和一個(gè)中央入口區(qū)構(gòu)成的模式的微流體系統(tǒng)。用Millipore純化的水來(lái)制備測(cè)試微流體系統(tǒng)性能所需的所有液體樣品。分別用溶于水的亞硝酸鈉(彡99%，Sigma-Aldrich)和溶于氫氧化鈉溶液(0.2mol/L)的尿酸(^99%,Sigma-Aldrich)來(lái)制備系列稀釋的亞硝酸鹽和尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。NO2^的指示劑溶液包含50mmol/L磺胺(彡99%，Sigma-Aldrich)、330mmol/L檸檬酸(彡99.5%，Sigma-Aldrich)和10mmol/LN-(1-萘基)乙二胺(彡98%，Sigma-Aldrich)。UA的指示劑溶液由溶液A(2.56%(w/v)2，2'-聯(lián)喹啉_4，4'-二羧酸二鈉鹽水合物，彡98%，Sigma-Aldrich)和溶液B(20mmol/L檸檬酸鈉和0.08%(w/v)硫酸銅(II)，彡99%,Sigma-Aldrich)的11混合物組成。為生成亞硝酸鹽校準(zhǔn)曲線，使用印pendorfresearch移液器(0.1-2.5μL)將I個(gè)空白對(duì)照(水，0.5μL)和5個(gè)系列稀釋的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品(濃度范圍為78μmol/L至1250ymol/L,0.5yL)順次施加到6個(gè)檢測(cè)區(qū)上。將亞硝酸鹽溶液(500ymol/LNO2O假定為濃度未知的樣品溶液。將該樣品溶液(0.5μυ點(diǎn)到1個(gè)檢測(cè)區(qū)上，并將系列稀釋的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品(156ymol/L至2500ymol/L,0.5yL)順次點(diǎn)到其它檢測(cè)區(qū)上。在該測(cè)定中，將水(0.5μL)加到中央入口區(qū)上作為空白對(duì)照。對(duì)于尿酸測(cè)定，將尿酸溶液(500μmol/LUA)假定為未知樣品溶液，并且在μPAD的每個(gè)檢測(cè)區(qū)上相繼載入5個(gè)系列稀釋的UA標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品(100μmol/L至1600μmol/L)。用NaOH溶液(0.2mol/L)作為該測(cè)定中的空白對(duì)照。在所有上述測(cè)定中，用印pendorfresearch移液器(0.5-10μL)利用毛細(xì)滲透從入口區(qū)將相應(yīng)指示劑溶液(5μ引入檢測(cè)區(qū)。對(duì)于每個(gè)測(cè)定而言，用6個(gè)裝置進(jìn)行6次獨(dú)立的測(cè)量。比色測(cè)定的結(jié)果用臺(tái)式掃描儀(EpsonPerfection2450，彩色照片設(shè)置，分辨率1200dpi)成像，然后導(dǎo)入AdobePhotoshop并轉(zhuǎn)化成灰度模式。用AdobePhotoshop的直方圖功能對(duì)平均強(qiáng)度進(jìn)行量化。通過(guò)從空白對(duì)照的平均強(qiáng)度減去測(cè)得的平均強(qiáng)度獲得每個(gè)檢測(cè)區(qū)的最終平均強(qiáng)度值并轉(zhuǎn)入MicrosoftExcel以獲得校準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)。實(shí)施例1在該實(shí)施例中，如圖1和2所示產(chǎn)生了N02_校準(zhǔn)曲線。N02_的比色測(cè)試基于Griess反應(yīng)的機(jī)理，它是NO2-的常用定量測(cè)量方法。在該測(cè)定中，將系列稀釋的NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液(78、156,312,625,1250μmol/L)順次施加在每個(gè)檢測(cè)區(qū)1_5中，而將空白對(duì)照溶液點(diǎn)在檢測(cè)區(qū)0上。然后將N02_的指示劑溶液經(jīng)由入口區(qū)引入裝置中。當(dāng)指示劑溶液由于毛細(xì)作用滲入測(cè)試區(qū)并與分析物接觸時(shí)，指示劑溶液中的檸檬酸將NO2-轉(zhuǎn)化成ΗΝ02-。然后亞硝酸將磺胺轉(zhuǎn)化為重氮化磺胺，重氮化磺胺與N-(1-萘基)乙二胺耦合形成粉紅色偶氮化合物。由于標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品的濃度不同，每個(gè)檢測(cè)區(qū)中顯示的所得顏色從幾乎無(wú)色(區(qū)0)變?yōu)榉奂t(區(qū)5)(圖1)。在圖2中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的平均顏色強(qiáng)度值是使用6個(gè)微流體系統(tǒng)進(jìn)行并用軟件測(cè)量和計(jì)算的6次獨(dú)立測(cè)量的平均值。誤差線(errorbar)是相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。亞硝酸根數(shù)據(jù)的線性最小二乘法擬合給出的決定系數(shù)(R2)為0.9902。平均顏色強(qiáng)度與N02_濃度成比例。該測(cè)定證實(shí)了可以使用紙基微流體系統(tǒng)(例如6通道模式)來(lái)生成用于定量分析的校準(zhǔn)曲線。實(shí)施例2在該實(shí)施例中，測(cè)量了未知樣品的NO2-濃度。為使用紙基微流體系統(tǒng)測(cè)量未知樣品的亞硝酸根濃度，制備了空白對(duì)照溶液(Ομπιο/LNO”施加在區(qū)0上)、5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(156,312,625,1250,2500μmol/LN02_，施加在區(qū)1_5上)和作為假定的未知樣品溶液的500ymol/LN02_溶液(施加在區(qū)χ上)。仍從中央入口區(qū)將指示劑溶液引入系統(tǒng)，它在不同測(cè)試區(qū)顯示不同顏色(圖幻。在該測(cè)定中，使用6個(gè)微流體系統(tǒng)進(jìn)行6個(gè)獨(dú)立測(cè)試，這提供了每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均顏色強(qiáng)度和誤差線以生成校準(zhǔn)曲線(圖4)，這給出用于計(jì)算未知樣品濃度的二次回歸方程。只要測(cè)得的濃度接近真實(shí)值，則認(rèn)為紙基微流體系統(tǒng)是定量分析未知樣品溶液的分析物濃度的有效工具。軟件分析獲得的結(jié)果表明對(duì)未知樣品測(cè)得的平均顏色強(qiáng)度為12.684，因而計(jì)算的未知樣品的Ν02_濃度是507μmol/L(與500μmol/L的實(shí)際濃度相比相對(duì)誤差為1.4%)。實(shí)施例3在該實(shí)施例中，如圖5和6所示測(cè)量未知樣品的UA濃度。尿酸的比色測(cè)定基于bicinchoninate(聯(lián)喹啉二羧酸鹽)螯合法。當(dāng)UA指示劑溶液進(jìn)入檢測(cè)區(qū)后，指示劑溶液中的Cu(II)被預(yù)先負(fù)載在測(cè)試區(qū)上的UA還原成Cu(I)，然后亞銅離子與聯(lián)喹啉二羧酸鈉形成紫色螯合產(chǎn)物。對(duì)應(yīng)于不同的UA濃度(0、100、200、400、800、1600μmol/L)，測(cè)試區(qū)0-5中顯示的所得顏色從淺紫逐漸變深到紫色(圖6)。圖7的數(shù)據(jù)和誤差線分別是使用6個(gè)裝置進(jìn)行的6次獨(dú)立測(cè)量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。制備了具有500μmol/L尿酸的樣品溶液，并假定該溶液為未知樣品，將該樣品也施加在測(cè)試區(qū)χ上。通過(guò)軟件分析，未知樣品的6次顏色強(qiáng)度測(cè)量值的平均為12.492；因此可以從回歸方程計(jì)算6個(gè)未知樣品的平均UA濃度為502μmol/L。與真實(shí)濃度值(500μmol/L)相比相對(duì)誤差為0.4%。所有測(cè)定的結(jié)果表明紙基微流體系統(tǒng)足以同時(shí)對(duì)不同檢測(cè)區(qū)進(jìn)行平行測(cè)試。用1個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行的測(cè)試量與測(cè)試區(qū)的數(shù)目相關(guān)聯(lián)，而測(cè)試區(qū)的數(shù)目可根據(jù)不同的預(yù)先設(shè)計(jì)模式進(jìn)行更改。在所述實(shí)施例中，6通道模式能1次檢測(cè)多達(dá)7個(gè)樣品，從而生成校準(zhǔn)曲線并為未知樣品濃度測(cè)量提供回歸方程。該方法是依靠受試分析物的比色化學(xué)的低成本、快速且簡(jiǎn)便的濃度檢測(cè)方法。微流體紙基多流體系統(tǒng)與分析物的比色反應(yīng)以及現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)軟件(例如AdobePhotoshop)聯(lián)用可以提供定量檢測(cè)未知樣品濃度的便宜且易用的工具。這些微流體系統(tǒng)的原材料(紙)是相對(duì)經(jīng)濟(jì)的，并且這些系統(tǒng)的制造方法相當(dāng)簡(jiǎn)單。因此，當(dāng)在資源受限的工業(yè)化程度較低的區(qū)或偏遠(yuǎn)地區(qū)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，紙基微流體系統(tǒng)可以是有用的工具。此外，該方法大大減少了樣品體積，這在可獲得樣品量有限(例如，來(lái)自患者的生物樣品)的情況下有利。權(quán)利要求1.一種使用具有多個(gè)親水測(cè)試區(qū)的紙基微流體系統(tǒng)來(lái)測(cè)定受試流體樣品的濃度的方法，其包括a)在至少一個(gè)所述測(cè)試區(qū)上施加所述受試流體樣品；b)在其它所述測(cè)試區(qū)上施加具有不同已知濃度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物；c)向每個(gè)所述測(cè)試區(qū)引入指示劑溶液從而與所施加的流體樣品反應(yīng)并產(chǎn)生作為所述流體樣品濃度的函數(shù)的顏色強(qiáng)度變化；以及d)比較所述受試流體樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物之間的顏色強(qiáng)度差異，從而測(cè)定所述受試流體樣品的濃度。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括對(duì)每個(gè)所述測(cè)試區(qū)中作為已知流體樣品濃度的函數(shù)的所述顏色強(qiáng)度進(jìn)行量化，從而生成校準(zhǔn)曲線，從所述校準(zhǔn)曲線能夠獲得所述受試流體樣品的濃度。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中一個(gè)所述測(cè)試區(qū)施加有水或標(biāo)準(zhǔn)溶液以提供空白對(duì)照區(qū)。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在施加所述受試流體樣品之前施加所述標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用生物綴合進(jìn)行ELISA型生物分析。6.一種用于測(cè)定受試流體樣品的濃度的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括a)具有多個(gè)親水測(cè)試區(qū)的紙基微流體系統(tǒng)，所述受試流體樣品能被施加到至少一個(gè)測(cè)試區(qū)上；b)不同已知濃度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物，用于施加在其它所述測(cè)試區(qū)上；c)指示劑溶液，用于引入到每個(gè)測(cè)試區(qū)從而與所述流體樣品反應(yīng)并產(chǎn)生作為流體樣品濃度的函數(shù)的顏色強(qiáng)度變化，其中通過(guò)比較所述受試流體樣品和所述標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物之間的顏色強(qiáng)度差異能夠測(cè)定所述受試流體樣品的濃度。7.—種適于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法的紙基微流體系統(tǒng)。全文摘要一種使用具有多個(gè)親水測(cè)試區(qū)的紙基微流體系統(tǒng)來(lái)測(cè)定受試流體樣品的濃度的方法，所述方法包括a)在至少一個(gè)所述測(cè)試區(qū)上施加所述受試流體樣品；b)在其它所述測(cè)試區(qū)上施加具有不同已知濃度的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物；c)向每個(gè)所述測(cè)試區(qū)引入指示劑溶液從而與所施加的流體樣品反應(yīng)并產(chǎn)生作為流體樣品濃度的函數(shù)的顏色強(qiáng)度變化；以及d)比較受試流體樣品和標(biāo)準(zhǔn)流體樣品或反應(yīng)物之間的顏色強(qiáng)度差異，從而測(cè)定所述受試流體樣品的濃度。文檔編號(hào)G01N33/52GK102472745SQ201080029424公開日2012年5月23日申請(qǐng)日期2010年6月30日優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日發(fā)明者吉爾·加尼爾,李煦,沈衛(wèi),田君飛申請(qǐng)人:莫納什大學(xué)