專利名稱：用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及光譜測試，尤其涉及一種用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理及抗逆性 鑒定的方法。
背景技術(shù)：
影響植物生長發(fā)育及農(nóng)作物產(chǎn)量的逆境脅迫有很多，例如干旱、水澇、冷脅、熱脅、 凍脅、鹽脅、輻射、水污染、土壤污染、大氣污染、農(nóng)藥、病蟲害等。開展植物尤其是農(nóng)作物逆 境生理檢測及抗逆性鑒定技術(shù)的研究，對于準確判斷作物的抗性大小，快速篩選抗性新品 種，進而實現(xiàn)作物品種改良，保障農(nóng)作物高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，確保農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的理論意 義和應(yīng)用價值。目前在植物逆境生理檢測中應(yīng)用得較廣泛的主要有兩種方法，一種為檢測 光合能力大小的紅外線氣體分析法，另一種為檢測熒光誘導(dǎo)動力學(xué)曲線參數(shù)的葉綠素?zé)晒?分析法。除此而外，還有一些傳統(tǒng)的逆境生理檢測及抗性鑒定的理化分析方法。紅外線氣 體分析法是利用二氧化碳對紅外線的吸收率檢測紅外光能量的被吸收量的多少來實現(xiàn)逆 境脅迫下光合能力檢測的方法，由于其檢測方法的特殊性，存在受外界環(huán)境因素影響大、測 量時間長等問題。而葉綠素?zé)晒夥治龇ㄊ抢眉す庹T發(fā)熒光技術(shù)進行逆境下熒光參數(shù)檢測 及分析的方法，雖然是現(xiàn)今用得最多的逆境生理檢測法，但存在著信號微弱、參數(shù)混雜、參 數(shù)波動性較大(熒光參數(shù)易受外界環(huán)境與植物自身生理狀況等因素的影響)等問題。傳統(tǒng) 的理化分析方法也存在著實驗周期長、實驗步驟繁瑣、工作量大、靈敏度不高等缺點?？梢姡?現(xiàn)有的進行植物逆境生理檢測及抗逆性鑒定的方法都有著各自不同的缺點，因此在實際應(yīng) 用中存在一些問題，不利于在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的推廣和普及。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種操作簡單、可控性 好、受外界環(huán)境因素影響小，可以準確偵斷作物逆境脅迫損傷程度及抗逆性大小的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是這樣實現(xiàn)的一種用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，其特征在于包括下 述步驟1. 1選擇生長狀態(tài)相似的作物和/或該作物葉片不同生長部位的若干組葉片，一 般為5 10組，每組選擇5 8片相似的葉片進行逆境生理檢測與抗逆性鑒定的樣品；1. 2將整株作物和/或樣品進行逆境脅迫處理；所述逆境脅迫系指對作物和/或 樣品創(chuàng)造的諸如干旱、水澇、冷脅、熱脅、凍脅、鹽脅、輻射、水污染、土壤污染、大氣污染等環(huán) 境因子；1. 3在室溫下測量作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜，其工藝過程為1. 3. 1將作物葉片置于室溫下具有磷光或延遲熒光檢測功能的熒光光譜儀的樣品 室中暗適應(yīng)30min ；1. 3. 2光譜的激發(fā)光源選擇波長為藍光470 500nm與紅光650 680nm范圍，強度為 0 2500 μ mol · m2 · s-1；1. 3. 3激發(fā)光源均勻輻照葉片的時間為0 1min ；1. 3. 4停止激發(fā)到采集葉片延遲熒光光譜的間隔時間為0. 01 Is ；1. 3. 5延遲熒光光譜采集的接收波長范圍為185 900nm，放大增益為IXlO8 ；1. 4對逆境脅迫條件下作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜進行分析，采用商用化 ORIGIN軟件對所述光譜儀輸出的數(shù)據(jù)進行分析，尋找發(fā)射光譜特征峰685nm和730nm附近 的最高峰值，分別記錄為F685與F730，由此計算得到F730/F685 ；1. 5測量作物在不同逆境脅迫下的延遲熒光發(fā)射光譜峰值比F730/F685的值；1. 6將健康生長條件下作物的F730/F685值記錄為最適宜比值F。p，逆境脅迫生理 條件下的F730/F685值記錄為Fsteess ；1. 7比較F。p與Fstress的差異，對作物遭受逆境脅迫后光合功能的損傷狀況進行判 斷；1. 8比較不同作物在相同逆境脅迫下F。p與Fstress的差異，即可對不同作物的抗逆 性大小進行鑒定。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜能有效地反映出逆境脅迫下 植物光合功能受到傷害的程度以及抗逆性的大??；在不同的脅迫環(huán)境下，延遲熒光發(fā)射光 譜發(fā)生明顯改變，尤其是685nm與730nm附近的特征峰的最大峰值F685與F730 ；兩個最 大峰值的比值F730/F685隨脅迫情況的變化更為顯著，且與凈光合速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù) Fv/Fm有很好的正相關(guān)性；植物的凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm與植物生長發(fā)育的 環(huán)境有直接關(guān)系，是逆境脅迫下植物生理檢測的有效表征。總的來說當植物生長在脅迫環(huán) 境中時，葉片的凈光合速率和Fv/Fm要比最適宜生長環(huán)境中對應(yīng)的值要低，且隨著脅迫的 加深，降低的程度加劇，相應(yīng)地，葉片的延遲熒光發(fā)射光譜特征峰值比F730/F685也隨之降 低，其下降程度可以有效反應(yīng)作物遭受逆境脅迫傷害的程度，通過分析不同作物在相同逆 境脅迫下特征峰值比F730/F685的變化差異，從而可以判定作物的抗逆性大小。室溫下延遲熒光發(fā)射光譜的685nm附近特征峰被公認為來自于光系統(tǒng)II，而 730nm附近的特征峰被認為是光系統(tǒng)I與II共同貢獻的結(jié)果，因此特征峰值比F730/F685 是植物葉片兩大光系統(tǒng)光合效能的直觀體現(xiàn)。它取決于植物的類型、生長發(fā)育狀況、體內(nèi)與 體外環(huán)境狀況。在一致的測量條件(如激發(fā)波長、激發(fā)時間、激發(fā)光強度、測量時間長度、暗 室內(nèi)溫度)下，通過檢測同品種、同生長發(fā)育狀況的植物葉片在不同脅迫環(huán)境下的延遲熒 光發(fā)射光譜，計算其特征峰值比F730/F685，與健康環(huán)境下特征峰值比進行比較，可以準確 而有效地反應(yīng)出植物的逆境生理狀況及損傷程度，并可進行植物抗逆性大小的鑒定。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的優(yōu)點及效果(1)由于植物的光合作用被認為是對逆境脅迫最敏感的生理過程，因此通過光合 作用或光合器官活性的檢測是判定植物逆境生理的一個有效方法。在植物體內(nèi)的兩大光合 作用系統(tǒng)(光系統(tǒng)I與光系統(tǒng)II)遭受不同的逆境脅迫時會產(chǎn)生相應(yīng)的變化，引起發(fā)射光 譜發(fā)生改變，尤其是延遲熒光光譜中來自于光系統(tǒng)II的685nm譜峰與光系統(tǒng)I(PSI)與光 系統(tǒng)II (PSII)共同作用產(chǎn)生的730nm譜峰的峰值強度發(fā)生了明顯的變化，從而導(dǎo)致特征峰 值比F730/F685隨著逆境脅迫的影響升高或降低。所以本發(fā)明方法通過測量植物延遲熒光 光譜特征峰值比F730/F685來檢測逆境脅迫的損傷程度以及進行抗逆性鑒定具有直觀、簡單、有效的特點。(2)本發(fā)明方法是從檢測植物受激后發(fā)出延遲熒光的光譜變化尤其是特征峰值比 變化的角度進行光合功能強弱的分析，是對植物體內(nèi)光合能力大小的一種判斷，這就避免 了傳統(tǒng)方法易受外界環(huán)境干擾，參數(shù)波動性大等缺點。另一方面，對植物進行的光誘導(dǎo)是由 暗室內(nèi)的激發(fā)光源產(chǎn)生，激發(fā)光源的強度可以調(diào)節(jié)，激發(fā)波長可以選擇，且是在停止激發(fā)后 才進行延遲熒光光譜信息的采集，因此，本發(fā)明方法具有不受外界環(huán)境干擾、穩(wěn)定、可控性 好、高信噪比、快速等優(yōu)點。(3)本用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理及抗逆性鑒定的方法操作過程簡單、容 易實現(xiàn)、參數(shù)直觀。


本發(fā)明有附圖4幅，其中圖1為本發(fā)明的實施流程圖。圖2為利用本發(fā)明實現(xiàn)大豆與玉米樣品在不同溫度脅迫下的F730/F685值的統(tǒng)計表。圖3為利用本發(fā)明方法實現(xiàn)溫度脅迫下大豆作物光合功能損傷判斷及抗逆性鑒定。圖4為利用本發(fā)明方法實現(xiàn)溫度脅迫下玉米作物光合功能損傷判斷及抗逆性鑒定。
具體實施例方式如圖1所示，一種用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，包括 選擇生長狀態(tài)相似的作物和/或該作物不同部位的若干組葉片作為進行逆境生理檢測與 抗逆性鑒定的樣品和將整株作物或葉片進行逆境脅迫處理的步驟，其特征在于還包括下述 步驟(1. 1)測量作物在不同逆境脅迫下的延遲熒光發(fā)射光譜峰值比F730/F685的值；(1. 2)比較健康生長條件與逆境脅迫條件下作物的F730/F685，對作物遭受逆境 脅迫后光合功能的損傷狀況進行判斷；(1. 3)通過對不同作物相同逆境脅迫后F730/F685的變化差異，判斷作物的抗逆
性大小。下面結(jié)合附圖，對其工藝過程進行具體描述圖1為本發(fā)明方法檢測作物逆境生理與抗逆性鑒定的流程圖。根據(jù)圖1，先對需要 鑒定的作物進行選取，目的在于對作物進行相似生長狀態(tài)的逆境生理檢測及抗逆性評價， 以保證鑒定結(jié)果的合理性；對生長狀態(tài)相似的多株作物分別進行健康生長條件培養(yǎng)與逆境 (高溫、低溫、鹽、大氣污染、紫外輻射等)脅迫處理；將健康的或處理后的作物葉片置于具 有延遲熒光光譜檢測功能的光譜儀中進行延遲熒光發(fā)射光譜采集；對延遲熒光發(fā)射光譜數(shù) 據(jù)用商用化ORIGIN軟件進行特征峰值F685與F730的提?。挥嬎闾卣鞣逯当菷730/F685 ； 記作物在健康生理下的F730/F685為F。p，逆境生理下F730/F685的為Fsteess ；比較不同逆境 脅迫下同一作物的Fstass與F。p的差異，即可對作物在相應(yīng)逆境下光合功能的受損程度進行檢測分析；比較不同作物在相同逆境脅迫下Fstress與F。p的差異，即可對不同作物的抗逆性 大小進行判斷鑒定。實施例1本實施例旨在對一種大豆品種和一種玉米品種在高溫和低溫脅迫下光合生理的 受損程度進行檢測，并對這兩個品種的抗逆性大小進行判斷。實驗選擇京黃大豆品種(苗 期)與晉單36號玉米品種(苗期)，選取8組不同生長部位，每組5片相似生長狀態(tài)的葉片 為樣品。溫度的處理范圍為5 50°C，溫度處理間隔為5°C。測量時，將活體作物置于設(shè)置 好脅迫溫度(5 50V )的植物培養(yǎng)箱中適應(yīng)2小時，植物培養(yǎng)箱保持自然光照，濕度保持 在75%。經(jīng)不同溫度處理后再將葉片置于具有磷光檢測功能的商用化熒光-磷光光譜儀 LS55的暗室內(nèi)暗適應(yīng)10分鐘(暗室內(nèi)溫度為室溫25°C )，用波長為660nm的激發(fā)光源對 葉片進行光激發(fā)0. ^，延遲0. ^，接收延遲熒光光譜信號。將延遲熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)傳給 PC機，用商用化軟件ORIGIN進行發(fā)射光譜分析，尋找發(fā)射光譜的685nm和730nm附近的兩 個特征峰值值F685與F730，并計算F730/F685。分析數(shù)據(jù)時，計算玉米或大豆樣品8組各 5片共40片葉片的延遲熒光發(fā)射光譜F730/F685的平均值和標準差，以平均值作為F730/ F685的數(shù)據(jù)點，而標準差作為數(shù)據(jù)的偏差，兩種實驗樣品的F730/F685值與溫度的變化如 統(tǒng)計表附圖2和變化曲線圖3，圖4所示。對圖2及圖3的進一步分析可知京黃大豆樣品的最適宜生長溫度為25°C，F(xiàn)730/ F685為0. 67476，記為該作物的F。p。在大豆植株適宜的生長溫度20 30°C范圍內(nèi)，20°C 時F730/F685值5優(yōu)是0. 65062，降低為Fop的96. 4%。相應(yīng)地，當溫度為15°C時F15o降低 為F。p的92. 4%，表現(xiàn)出顯著的低溫損傷(*)，當溫度低于15°C，10°C時的Fltrc降低為F。p的 呂^^，^降低為？㈤的？？^^，可見，樣品出現(xiàn)了極顯著低溫損傷(**)。高溫情況也有類 似的規(guī)律，相較于最適宜生長溫度，30°C時的F3trc降低為F。p的97. 9%，F(xiàn)35O降低為96. 0%, 當溫度為40°C，相應(yīng)的F4crc降低為91.8%，表現(xiàn)出顯著的高溫損傷(+)，超過40°C，樣品表 現(xiàn)出極顯著高溫損傷(++)，F(xiàn)45o降低為F。p的85. 3%，F(xiàn)5crc降低為F。p的76. 7%。由此可以判斷20 35°C是該大豆樣品的適宜生長溫度范圍，最適宜溫度為 25°C，在最適宜生長溫度處延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值最高記為F。p ；當溫度低于 20°C時該大豆樣品表現(xiàn)出明顯的低溫逆境傷害，當溫度高于35°C時該大豆樣品表現(xiàn)出明顯 的高溫逆境傷害；隨著逆境傷害的加劇，延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值顯著下降。對圖2及圖4的進一步分析可知晉單36號玉米樣品的最適宜生長溫度為35°C， F730/F685為0. 601，記為該作物的F。p。在玉米植株適宜的生長溫度25 40°C范圍內(nèi)，F(xiàn)4crc 為F。p的98. 3%，F(xiàn)3trc* F。p的98. 1%，F(xiàn)25o降低為F。p的93. 2%。當溫度為20°C時，相應(yīng) 的F2trc降低為F。p的80. 5%，可見，相較于最適宜生長溫度情況，20°C時作物表現(xiàn)出顯著的 低溫損傷㈩。當溫度低于20°C, F15o降低為20°C的71. 0%, Fltrc降低為65. 6%, Frc降低 為61.8%，可見，在5 20°C的低溫逆境下，樣品出現(xiàn)了極顯著低溫損傷(**)。高溫情況 也有類似的規(guī)律，相較于最適宜生長溫度，F(xiàn)45o降低為F。p的91. 8%，表現(xiàn)出顯著的高溫損傷 ⑴，F(xiàn)5crc降低為88. 3%，樣品表現(xiàn)出極顯著高溫損傷(++)。由此可以判斷25 40°C是該玉米樣品的適宜生長溫度范圍，最適宜溫度為 35°C，在最適宜生長溫度處延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值最高，記為F。p ；當溫度低于 25°C時該玉米樣品表現(xiàn)出明顯的低溫逆境傷害；當溫度高于40°C時該玉米樣品表現(xiàn)出明顯的高溫逆境傷害；隨著逆境傷害的加劇，延遲熒光光譜峰值比F730/F685比值顯著下降。
綜合對大豆與玉米樣品的溫度脅迫光合損傷檢測結(jié)果的分析，可明顯發(fā)現(xiàn)大 豆實驗樣品的最適宜生長溫度低于玉米實驗樣品；大豆樣品出現(xiàn)顯著低溫傷害的溫度 (15°C )高于玉米樣品(20°C )；大豆樣品出現(xiàn)顯著高溫傷害的溫度(40°C )低于玉米樣品 (45°C )；大豆樣品抗高溫脅迫的能力低于玉米樣品；大豆樣品抗低溫脅迫的能力高于大豆 樣品。
權(quán)利要求
1. 一種用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，其特征在于包括下述 幾個步驟1.1選擇生長狀態(tài)相似的作物和/或該作物葉片不同生長部位的若干組葉片，一般為 5 10組，每組選擇5 8片相似的葉片進行逆境生理檢測與抗逆性鑒定的樣品；1. 2將整株作物和/或樣品進行逆境脅迫處理；所述逆境脅迫系指對作物和/或樣品 創(chuàng)造的諸如干旱、水澇、冷脅、熱脅、凍脅、鹽脅、輻射、水污染、土壤污染、大氣污染等環(huán)境因 子；1. 3在室溫下測量作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜，其工藝過程為 1. 3. 1將作物葉片置于室溫下具有磷光或延遲熒光檢測功能的熒光光譜儀的樣品室中 暗適應(yīng)30min ；1. 3. 2光譜的激發(fā)光源選擇波長為藍光470 500nm與紅光650 680nm范圍，強度為 0 2500 μ mo 1 · πΓ2 · ；1. 3. 3激發(fā)光源均勻輻照葉片的時間為0 Imin ； 1. 3. 4停止激發(fā)到采集葉片延遲熒光光譜的間隔時間為0. 01 Is ； 1. 3. 5延遲熒光光譜采集的接收波長范圍為185 900nm，放大增益為IX IO8 ； 1. 4對逆境脅迫條件下作物葉片的延遲熒光發(fā)射光譜進行分析，采用商用化ORIGIN軟 件對所述光譜儀輸出的數(shù)據(jù)進行分析，尋找發(fā)射光譜特征峰685nm和730nm附近的最高峰 值，分別記錄為F685與F730，由此計算得到F730/F685 ；1. 5測量作物在不同逆境脅迫下的延遲熒光發(fā)射光譜峰值比F730/F685的值； 1. 6將健康生長條件下作物的F730/F685值記錄為最適宜比值F。p，逆境脅迫生理條件 下的F730/F685值記錄為Fsteess ；1. 7比較F。p與Fstress的差異，對作物遭受逆境脅迫后光合功能的損傷狀況進行判斷； 1. 8比較不同作物在相同逆境脅迫下F。p與Fstass的差異，即可對不同作物的抗逆性大 小進行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用延遲熒光光譜檢測作物逆境生理與抗逆性鑒定的方法，包括選擇生長狀態(tài)相似的作物不同部位的若干組葉片作為進行逆境生理檢測與抗逆性鑒定的樣品和將整體操作物或葉片樣品進行逆境脅迫處理的步驟，其特征在于還包括檢測逆境脅迫下活體作物葉片光誘導(dǎo)延遲熒光發(fā)射光譜特征峰值比F730/F685，來反映逆境脅迫下作物生理變化情況，結(jié)合最適生長環(huán)境下作物的峰值比F730/F685特性，由此判斷出作物逆境脅迫損傷狀況及抗逆性大小。本發(fā)明操作簡單、可控性好、受外界環(huán)境因素影響小，可以準確偵斷作物溫度脅迫損傷程度及抗逆性的大小。
文檔編號G01N21/64GK102147367SQ20101061368
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者李瑛 , 董麗麗, 許文海 申請人:大連海事大學(xué)