專利名稱：三唑侖檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)免疫方法的測定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用膠體金免疫層技術(shù)制作的一種三唑侖檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
三唑侖又名海樂神、酣樂欣，淡藍(lán)色片，是一種強(qiáng)烈的麻醉藥品，口服后可以迅速使人昏迷暈倒，故俗稱迷藥、蒙汗藥、迷魂藥?？梢园殡S酒精類共同服用，也可溶于水及各種飲料中。見效迅速，藥效比普通安定強(qiáng)45-100倍。三唑侖是當(dāng)前國內(nèi)最常用的苯二氮卓類藥物之一，常被犯罪分子用于麻醉搶劫和麻醉兇殺。據(jù)報(bào)道，三唑侖在體內(nèi)吸收代謝快，其主要代謝產(chǎn)物是α-羥基三唑侖。由于三唑侖劑量少，在生物檢材中的三唑侖及其代謝產(chǎn)物含量均很低，因此對其提取檢驗(yàn)困難。有關(guān)三唑侖的檢測方法有很多，例如高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等方法，這些方法雖然檢測的靈敏度較高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但是存在需要昂貴的儀器設(shè)備，對檢測材料的要求高，需要提純處理等限制。因此研究具有快速、便攜等優(yōu)點(diǎn)的檢測方法具有現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明介紹了一種以膠體金免疫層析法快速檢測三唑侖的檢測試劑盒及其制備方法，該方法具有簡單、快速，無需任何儀器設(shè)備，經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)，適用于快速定性檢測樣本中是否含有三唑侖。膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)九十年代以來在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體金顯色技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)?；谀z體金免疫層析技術(shù)可以制備膠體金試紙，膠體金試紙的原理是應(yīng)用膠體金標(biāo)記技術(shù)，以膠體金為示蹤物，利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，利用特定的顯色反應(yīng)在試紙上的顯色而判定檢測的結(jié)果，具有操作簡單、檢測快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，無須復(fù)雜的儀器等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、快捷、靈敏度高、特異性強(qiáng)的三唑侖試劑盒及其制備方法，用于檢測待檢樣本中是否含有三唑侖。一種用于檢測三唑侖的檢測試劑盒，包括樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板，在PVC支撐板上依次緊密粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊。所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的三唑侖單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被有檢測線(Τ線)和質(zhì)控線(C線)，其中檢測線(Τ線)上包被了三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原，質(zhì)控線((線)上包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體；所述吸樣墊為吸水紙。本發(fā)明采用納米膠體金技術(shù)及抗原抗體特異性反應(yīng)，應(yīng)用免疫競爭抑制反應(yīng)的原理制備而成，通過待檢樣本中含有的三唑侖與硝酸纖維素膜上檢測線(Τ線)包被的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的三唑侖單克隆抗體，通過T線的顯色來判定待檢樣本中是否含有三唑侖。
本發(fā)明提供了一種三唑侖檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟(1)制備三唑侖偶聯(lián)抗原將三唑侖與牛血清蛋白偶聯(lián)，合成三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原，作為三唑侖偶聯(lián)抗原。(2)制備三唑侖單克隆抗體采用三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術(shù)， 得到分泌抗三唑侖單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用 Protein G柱進(jìn)行純化，獲得三唑侖單克隆抗體。(3)制備膠體金取0. 01%的氯金酸水溶液，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入枸櫞酸三鈉水溶液 lml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。(4)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調(diào)至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入三唑侖單克隆抗體，使三唑侖單克隆抗體的濃度為10-60 μ g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入10%的牛血清蛋白 (BSA)溶液使其濃度為10-60 μ 1/ml，混合均勻，室溫放置30分鐘；12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解；12000轉(zhuǎn)離心30 分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30% -100%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到三唑侖單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將三唑侖單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按ImL 鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥對士2小時(shí)，制成膠體金墊。上述膠體金復(fù)溶液為含0.01-0. 的Tris，l. 0-3.0%的蔗糖、0. 1-1.0%的BSA 的0. 02M pH7. 0-9. 0的磷酸鹽緩沖溶液。(4)包被三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原、羊抗鼠IgG多克隆抗體設(shè)定劃膜儀涂覆參數(shù)1 μ L/cm,分別用微量進(jìn)樣器取濃度為0. 5-5. Omg/ml的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原、取濃度為0. 5-5. Omg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復(fù)運(yùn)動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原(T線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥對士2小時(shí)，保存，備用。(5)樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于0. OlM pH 7. 0-8. 0的磷酸鹽緩沖溶液中20_40min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含0. 5-1.5% BSA, 0. 5-1.0% Tweeen-20，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用(6)組裝試劑盒在PVC支撐板上按順序依次粘附樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，得到所述用于檢測三唑侖的試紙條，試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，組裝成檢測卡。其中所述樣品墊為玻璃纖維，吸樣墊為吸水紙。本發(fā)明所述試劑盒的檢測方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出三唑侖檢測裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，10-15分鐘時(shí)觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結(jié)果。
本發(fā)明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術(shù)測定三唑侖，檢測時(shí)，將被測樣品加在試劑盒上的樣品墊上，可以直接觀察到免疫反應(yīng)的結(jié)果，完成樣品檢測。本發(fā)明可用于檢測樣本中可能存在的三唑侖，具有使用方便、操作簡單、反應(yīng)迅速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。


圖1三唑侖檢測試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖；附圖符號說明1 樣品墊；2 膠體金墊(膠體金標(biāo)記三唑侖單克隆抗體的聚酯膜)3 硝酸纖維素膜(T 包被了三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原的檢測線；C 包被了羊抗鼠IgG多克隆抗體的質(zhì)控線)；4:吸樣墊；5 =PVC 支撐板；圖2本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果示意圖。自左至右依次為C線一條線陽性檢測結(jié)果；T、C兩條線陰性檢測結(jié)果；無效。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 三唑侖檢測試劑盒的制備1.制備三唑侖偶聯(lián)抗原將三唑侖與牛血清蛋白偶聯(lián)，合成三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原，作為三唑侖偶聯(lián)抗原。2.制備三唑侖單克隆抗體采用三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原為免疫原免疫BALB/C小鼠，通過雜交瘤技術(shù)， 得到分泌抗三唑侖單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用 Protein G柱進(jìn)行純化，獲得三唑侖單克隆抗體。3.制備膠體金取0. 01%的氯金酸水溶液100ml，加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液1ml，繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。4.制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，加入0. 15ml 0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的PH值調(diào)至8. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入0. 0375ml濃度為4. Omg/ml的三唑侖單克隆抗體，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入0. 25ml 10%的牛血清蛋白(BSA) 溶液，混合均勻，室溫放置30分鐘；12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解；12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去， 剩余的沉淀用50%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到三唑侖單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將三唑侖單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按ImL鋪56cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥M小時(shí)，制成膠體金墊。上述膠體金復(fù)溶液為含0.01%的Tris，2.0%的蔗糖、0.5%的BSA的0.02M pH 8. 0的磷酸鹽緩沖溶液。
4.包被三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原、羊抗鼠IgG多克隆抗體設(shè)定劃膜儀涂覆參數(shù)1 μ L/cm,分別用微量進(jìn)樣器取濃度為2. Omg/ml的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原、取濃度為1. 2mg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復(fù)運(yùn)動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原(T線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體 (C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥對士2小時(shí)，保存，備用。5.樣品墊的處理將玻璃纖維浸泡于50ml 0. OlM pH 8. O的磷酸鹽緩沖溶液處理液中30min，其中磷酸鹽緩沖溶液中含1. 0% BSA, 0. 5% Tweeen-2，于烘干箱中38°C烘干，保存，備用6.組裝試劑盒在PVC支撐板上按順序依次粘附樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，得到所述用于檢測三唑侖的試紙條，試紙條可以裝入塑料卡內(nèi)，組裝成檢測卡。其中所述樣品墊為玻璃纖維，吸樣墊為吸水紙。實(shí)施例2 三唑侖檢測試劑盒的檢測1.檢測方法取出三唑侖檢測試劑盒，水平放置；在樣品墊上滴入3滴樣品，10分鐘后觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結(jié)果。2.結(jié)果判定陽性T線不顯色，僅C線顯色，判定為陽性結(jié)果；陰性Τ線、C線均顯色，判定為陰性結(jié)果；無效C線不顯色，說明不正確操作或試劑盒已經(jīng)變質(zhì)損壞。檢測樣品時(shí)，樣品因毛細(xì)管作用向吸樣墊一端層析。若被測樣品中含有三唑侖，它們將和檢測線(T線)上包被的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的三唑侖單克隆抗體上有限的抗體結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)樣品中的三唑侖達(dá)到一定濃度時(shí)，與膠體金標(biāo)記的三唑侖單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)并完全飽和，此時(shí)膠體金復(fù)合物已無空余的位點(diǎn)和檢測線上包被的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原結(jié)合，此時(shí)T線不顯色，此為陽性結(jié)果。若被測樣品中不含三唑侖，標(biāo)記了三唑侖單克隆抗體的膠體金顆粒將隨同樣品層析至T線位置后， 與T線上包被的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原發(fā)生免疫結(jié)合反應(yīng)，膠體金顆粒在T線位置堆積使得T線呈現(xiàn)出一條肉眼可見的紅色條帶，此為陰性結(jié)果。無論被測樣品中是否含有三唑侖，膠體金標(biāo)記物均會與包被在質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合而顯色，C線顯色是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也作為試劑的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例3 三唑侖檢測試劑盒的應(yīng)用評價(jià)1.最低檢出量用磷酸緩沖溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為 0、400、500、600ng/mL 的三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品，各濃度分別進(jìn)行10次平行檢驗(yàn)，10分鐘時(shí)觀察檢測結(jié)果，0ng/mL、400ng/mL的三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果為T線、C線均顯色，為陰性結(jié)果；500ng/mL、600ng/mL的三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果為T線不顯色、C線顯色，判定為陽性檢測結(jié)果；最終確定三唑侖檢測試劑盒的最低檢出量為500ng/ml。
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2.陰性參考品符合率用磷酸緩沖溶液(PBS 0. Olmol/L.pH 7. 5)配制濃度為100ug/mL的冰毒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次平行檢驗(yàn)，10分鐘時(shí)觀察檢測結(jié)果，T線、C線均呈現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陰性。用磷酸緩沖溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為100ug/mL的美沙酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次平行檢驗(yàn)，10分鐘時(shí)觀察檢測結(jié)果，T線、C線均呈現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陰性。3.陽性參考品符合率用磷酸緩沖溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為 500ng/mL、600ng/mL、 700ng/mL的三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品，各濃度分別進(jìn)行10次平行檢驗(yàn)，10分鐘時(shí)觀察檢測結(jié)果，T線不顯色、C線顯色，結(jié)果為陽性。4.重復(fù)性用磷酸緩沖溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為500ng/mL的三唑侖標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10次平行檢驗(yàn)，10分鐘時(shí)觀察檢測結(jié)果，結(jié)果均為T線不顯色，C線顯色，且顯色度均一，為陽性結(jié)果。5.穩(wěn)定性37°C放置20天后，最低檢出量、陰性參考品符合率、陽性參考品符合率、重復(fù)性各項(xiàng)指標(biāo)均符合以上要求，本試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種三唑侖檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊緊密粘附在PVC 支撐板上；所述樣品墊為玻璃纖維；所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的三唑侖單克隆抗體聚酯膜；所述硝酸纖維素膜上依次包被了三唑侖-牛血清白蛋白偶聯(lián)抗原作為檢測線(T線)， 羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線(C線)；所述吸樣墊為吸水紙。
2.—種權(quán)利要求1所述的三唑侖檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的三唑侖單克隆抗體由三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原作為免疫原免疫BALB/C小鼠獲得。
3.—種權(quán)利要求1所述的三唑侖檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下制成大小為20-40nm的膠體金顆粒。
4.一種權(quán)利要求1所述的三唑侖檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液，用0. lmol/L 1(20)3將膠體金溶液的 PH值調(diào)至7. 0-9. 0，室溫放置30分鐘；在上述溶液中加入三唑侖單克隆抗體，使三唑侖單克隆抗體的濃度為10-60 μ g/ml膠體金，混合均勻后，室溫放置30分鐘；加入10%的牛血清蛋白(BSA)溶液使其濃度為10-60 μ 1/ml，混合均勻，室溫放置30分鐘；12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解；12000轉(zhuǎn)離心30分鐘，仔細(xì)吸取上清液，棄去，剩余的沉淀用30% -100%初始膠體金體積的膠體金復(fù)溶液溶解，得到三唑侖單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；將三唑侖單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物按ImL鋪40-70cm2聚酯膜的比例均勻鋪在聚酯膜上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于 30%的條件下干燥對士2小時(shí)，制成膠體金墊。
5.一種權(quán)利要求1及權(quán)利要求5所述的三唑侖檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金復(fù)溶液為含0. 01-0. 的Tris，1. 0-3. 0%的蔗糖、0. 1-1. 0%的BSA的0. 02M pH7. 0-9. 0的磷酸鹽緩沖溶液。
6.一種權(quán)利要求1所述的三唑侖檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上的兩條線的包被方法為設(shè)定劃膜儀涂覆參數(shù)1 μ L/cm，分別用微量進(jìn)樣器取濃度為0. 5-5. Omg/ml的三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原、取濃度為0. 5-5. Omg/ml羊抗鼠IgG多克隆抗體，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復(fù)運(yùn)動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原(T 線)、羊抗鼠IgG多克隆抗體(C線)。劃線后于溫度38°C的烘箱中干燥對士2小時(shí)，保存， 備用。
全文摘要
一種用于檢測三唑侖的檢測試劑盒，該試劑盒包括樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)，在PVC支撐板上依次連續(xù)粘附有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，所述膠體金墊為膠體金標(biāo)記的三唑侖單克隆抗體聚酯膜，所述硝酸纖維素膜上依次包被了三唑侖-牛血清蛋白偶聯(lián)抗原作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG多克隆抗體作為質(zhì)控線(C線)。本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術(shù)制備三唑侖檢測試劑盒，用于檢測樣本中可能存在的三唑侖，本試劑盒制備方法簡單，具有使用方便、反應(yīng)迅速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等特點(diǎn)。
文檔編號G01N33/558GK102539765SQ20101061090
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者李峰, 楊利, 陳立柱 申請人:北京寶瑞源科技孵化有限公司