專(zhuān)利名稱(chēng)：高溫環(huán)境下海水魚(yú)類(lèi)體表粘液功能蛋白檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于比較蛋白組學(xué)技術(shù)，是一種檢測(cè)高溫環(huán)境下海水魚(yú)類(lèi)體表粘液功能蛋 白的方法。
背景技術(shù)：
魚(yú)類(lèi)體表粘液是機(jī)體防御外界病原微生物入侵的第一道保護(hù)屏障，而體表粘液中 含有的多種具有免疫功能的功能蛋白起著至關(guān)重要的作用，因此研究這些活性物質(zhì)在高溫 環(huán)境下的變化規(guī)律，確定與溫度相關(guān)的生物指示蛋白，將是一種新的更快捷的耐溫選育途徑。本發(fā)明做出之前，Cristiane等(Analytical Biochemistry 2006)發(fā)表的 Optimization of sample preparation from skin mucus of a neotropical fish for two-dimensional substrate gel electrophoresis,曾報(bào)道了禾丨J用雙向電泳技術(shù)可以建立 熱帶魚(yú)Tambacu的體表粘液蛋白酶圖譜，但并沒(méi)有應(yīng)用比較蛋白組學(xué)的技術(shù)確定與某些性 狀相關(guān)的功會(huì)邑蛋白；Frederic Silvestre 等(Science of the Total Environment 2010) 發(fā)表的 A proteomic analysis of green and white sturgeon larvae exposed to heat stress and selenium,曾報(bào)道了利用雙向電泳技術(shù)比較分析高溫脅迫對(duì)鱘魚(yú)幼仔組織蛋 白影響，但并沒(méi)有將此技術(shù)應(yīng)用于快速檢測(cè)體表粘液的功能蛋白。綜上所述，利用雙向電泳 技術(shù)檢測(cè)高溫環(huán)境下海水魚(yú)類(lèi)體表粘液功能蛋白的方法，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一套完整的檢測(cè)高溫環(huán)境對(duì)海水魚(yú)類(lèi)體表粘液功能蛋白影 響的方法體系，利用雙向電泳技術(shù)構(gòu)建出體表粘液蛋白酶圖譜，通過(guò)圖譜分析從中篩選出 與溫度脅迫相關(guān)的功能蛋白，并結(jié)合個(gè)體高溫耐受力情況，以期找到與溫度脅迫相關(guān)的標(biāo) 記蛋白，為后期功能蛋白的研究提供依據(jù)，以及今后與傳統(tǒng)方法結(jié)合進(jìn)行耐溫選育工作奠 定基石出。本發(fā)明是按照以下操作技術(shù)方案完成的具體步驟是1、收集粘液；2、提取體表 粘液蛋白；3、對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定；4、采用雙向電泳分離蛋白；5、蛋白圖譜分析；6、差異蛋 白點(diǎn)切膠回收；7、質(zhì)譜分析，確定功能蛋白。1.收集粘液是使用簡(jiǎn)便的無(wú)菌塑料吸管收集粘液。2.提取蛋白利用TCA/丙酮酸法提取海水魚(yú)類(lèi)體表粘液蛋白。3.蛋白含量測(cè)定按照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定。4.雙向電泳分離蛋白(1)等點(diǎn)聚焦電泳(一向)選用pH4-7，17cm的線性膠條，樣品最終稀釋濃度為 1μ g/μ 1，上樣量為 300μ 1 ；等電聚焦程序S1 Stp :300V, 2h ；S2 Stp :1000V, 2h ；S3 Grd 8000V, 2h ；S4 Stp :8000V, 2h ；S5 Grd :10000V, 3h ；S6 Stp :10000,1. 5h ;S7 Stp :500V，12h，
根據(jù)等電點(diǎn)不同分離蛋白。
(2)聚丙烯酰胺垂直電泳(二向)再次分離蛋白，其程序起始時(shí)2W/塊膠，45min 后，將功率改為15W電泳4-5個(gè)小時(shí)根據(jù)重力原理進(jìn)行分離；當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部邊緣 時(shí)停止電泳。(3)染色將PAGE膠放入銀染液中銀染30min，加入顯色液顯色2-5min，加10%的 冰醋酸溶液輕搖動(dòng)終止染色，終反應(yīng)即得到大菱鲆體表粘液蛋白酶圖譜。5.蛋白圖譜分析利用Imagemaster 2D Platinum 6. 0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分 析，查找到差異顯著的蛋白點(diǎn)。6.差異蛋白點(diǎn)切膠回收切割蛋白膠點(diǎn)，回收蛋白。7.質(zhì)譜分析，確定功能蛋白進(jìn)行MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜分析，采用PMF技術(shù)和 MASCOT、NCBI網(wǎng)站提供的檢索工具進(jìn)行鑒定；確定與溫度相關(guān)的功能蛋白。本發(fā)明技術(shù)有以下特點(diǎn)(1)本發(fā)明可快捷的獲得高溫環(huán)境下，魚(yú)類(lèi)不同個(gè)體的體表粘液蛋白圖譜，方法簡(jiǎn) 便，所得結(jié)果可直觀的檢測(cè)出體表粘液蛋白在溫度脅迫下的變化趨勢(shì)，可迅速篩選出與其 相關(guān)的功能蛋白，確定與溫度相關(guān)的指示蛋白，從而進(jìn)行輔助耐溫選育研究。(2)本發(fā)明在收集粘液的方法上做了革新，目前魚(yú)類(lèi)體表粘液收集方法有兩種，一 種是將魚(yú)麻醉后放入裝有無(wú)菌去離子水的滅菌袋中振蕩，但該方法對(duì)魚(yú)的傷害性較大，而 且采集的粘液不能長(zhǎng)時(shí)間保存，蛋白降解較快；第二種是利用滅菌玻璃片刮取粘液，但收集 后分裝比較困難，而本發(fā)明在收集粘液時(shí)用滅菌的塑料吸管，可以快速收集體表粘液，而且 分裝簡(jiǎn)單，并能夠?qū)⑵浔４嬖?80 °C中一年以上。(3)本發(fā)明在一向等電聚焦電泳程序中做了改進(jìn)，由于海水魚(yú)類(lèi)體表粘液鹽離 子比較多，在電泳過(guò)程中往往出現(xiàn)脫鹽不徹底，造成圖片不清晰，蛋白點(diǎn)有拖帶現(xiàn)象，為后 期的分析造成困難；本發(fā)明中的等電聚焦程序采用延長(zhǎng)低壓時(shí)間，以及線性升至高壓后增 加一個(gè)直線升壓的過(guò)程，從而穩(wěn)定電壓，使蛋白點(diǎn)分離完全，聚焦徹底；即si Stp :300V, 2h ；S2 Stp :1000V, 2h ；S3 Grd :8000V, 2h ；S4 Stp :8000V, 2h ；S5 Grd :10000V, 3h ；S6 Stp 10000，1.5h ；S7 Stp :500V，12h，可以將鹽離子除凈，得到的蛋白點(diǎn)清晰，圓滑，從而更準(zhǔn)確 的對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行定位定量。(4)本發(fā)明所檢測(cè)的功能蛋白——凝集素，其與溫度的相關(guān)性屬于首次確認(rèn)。


圖1 常溫條件下大菱鲆體表粘液蛋白酶圖譜；圖2 高溫脅迫下體表粘液蛋白酶圖譜；圖3 凝集素在不同溫度下的蛋白表達(dá)差異性比較。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的檢測(cè)方法。首先是TCA/丙酮發(fā)提取大菱鲆體表粘液蛋白；再利用粘液蛋白各等電點(diǎn)不同的 原理進(jìn)行等點(diǎn)聚焦；然后丙烯酰胺配置電泳再次分離蛋白；染色脫色獲得不同高溫脅迫下 的蛋白圖譜；利用Imagemaster 2D Platinum 6. 0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，查找到差 異顯著的蛋白點(diǎn)；進(jìn)行MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜分析，采用PMF技術(shù)和MASCOT、NCBI網(wǎng)站提供的檢索工具進(jìn)行鑒定；得到與逆境脅迫相關(guān)的功能蛋白。具體方法是1.大菱鲆體表粘液收集；2.蛋白質(zhì)提??；3.蛋白定量測(cè)定；4、雙向 電泳分離蛋白；5.蛋白圖譜分析；6.差異蛋白點(diǎn)切膠回收；7.質(zhì)譜分析，確定功能蛋白。1.大菱鲆體表粘液收集使用無(wú)菌塑料吸管將體表粘液收集入1. 5ml的離心管 中。2.蛋白質(zhì)提取取Iml粘液加入4倍體積的10% TCA/丙酮(TCA 丙酮=1 10，含0. 07%巰基 乙醇，-20°C預(yù)冷30min)，-20°C靜置過(guò)夜；4°C下15000 X g離心30min，棄上清；沉淀加入10 倍體積的丙酮溶液(含0. 07%巰基乙醇，-20°C預(yù)冷)，4°C下15000\8離心301^11，棄上清； 重復(fù)此步驟一次；將沉淀冷凍干燥，將適量裂解液加入干粉中，超聲波破碎儀進(jìn)行復(fù)溶。3.蛋白定量測(cè)定按照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定，最后利用0rigin5. 0軟件繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的樣品的吸光度回歸計(jì)算蛋白濃度。4、雙向電泳分離蛋白(1)等電聚焦電泳(一向)水化液定量樣品，最終濃度約為Iyg/μ 1，上樣量為 300 μ 1 ；把水化好的蛋白質(zhì)溶液加入平衡盤(pán)中，膠條放入混合液中，浸泡膠條池后，加入礦 物油，泡漲時(shí)間為12-16h(25°C )。把膠條放入聚焦盤(pán)中；在聚焦盤(pán)的電極上各放一小塊浸 濕的濾紙片，夾上電極板，加入礦物油，同時(shí)排除膠條下的氣泡，接通電源，設(shè)定聚焦程序進(jìn) 行聚焦(pH 4-7，17011膠條)51 Stp :300V,2h ；S2 Stp :1000V, 2h ；S3 Grd :8000V, 2h ；S4 Stp :8000V,2h ；S5 Grd :10000V,3h ；S6 Stp :10000,1. 5h ；S7 Stp :500V，12h。(2)聚丙烯酰胺垂直電泳(二向)聚丙烯酰胺配置電泳再次分離蛋白，將平衡的 膠條轉(zhuǎn)移到垂直板電泳槽凝膠上(凝膠配方按常規(guī)SDS電泳配方)，加入電泳緩沖液后進(jìn)行 電泳；程序起始時(shí)2W/塊膠，45min后，將功率改為15W/塊膠；電泳4_5個(gè)小時(shí)根據(jù)重力原 理進(jìn)行分離，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部邊緣時(shí)即可停止電泳。(3)染色a.固定凝膠取下后，用去離子水清洗膠面，然后加入固定液振蕩至少 30min ；b.漂洗；棄去固定液后，凝膠用漂洗液清洗一次。棄去漂洗液，加入新鮮漂洗液， 振蕩15min ；c.水化凝膠用去離子水清洗一次，棄去去離子水，再次加入去離子水水化 15-30min ；d.敏化用敏化液浸泡凝膠2. 5min ；去除背景；e.水洗凝膠用去離子水洗3 遍，每次20sec ；f.銀染用銀染液覆蓋凝膠，輕微振蕩30min ；g.水洗重復(fù)第5步；h.顯 色加入新鮮配置的顯色液，顯色2-lOmin，注意觀察染色狀況，顯色時(shí)間視蛋白量而定； i.洗膠迅速用去離子水漂洗凝膠20sec;j.終止迅速加入終止液，終止顯色反應(yīng)；k.水 洗一次。5.蛋白圖譜分析染色完畢后，用凝膠圖像掃描儀Imagekarmer采集圖像(如圖 1，圖2所示)。使用Imagemaster 2D Platinum 6. 0對(duì)雙向凝膠電泳圖譜進(jìn)行分析，分析內(nèi) 容包括圖像密度校正、找點(diǎn)、背景扣除、設(shè)置參比膠及圖譜間的點(diǎn)匹配、標(biāo)準(zhǔn)化和差異點(diǎn)篩 選，選出6個(gè)具有顯著差異的蛋白點(diǎn)。6.差異蛋白點(diǎn)切膠回收切去蛋白膠點(diǎn)，回收蛋白。7.質(zhì)譜分析，確定功能蛋白進(jìn)行MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜分析，采用PMF技術(shù)和 MASC0T.NCBI網(wǎng)站提供的檢索工具進(jìn)行鑒定，確定與海水溫度相關(guān)的功能蛋白，最終得到與溫度相關(guān)的功能蛋白——凝集素，其與溫度的相關(guān)性如圖3所示。 經(jīng)過(guò)后期重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了凝集素與海水溫度的相關(guān)性，即凝集素其表達(dá) 含量猛烈增加時(shí)的海水溫度為大菱鲆的致死溫度點(diǎn)，因此，凝集素將可作為一種與海水溫 度相關(guān)的指示蛋白，應(yīng)用于海水魚(yú)類(lèi)在海水溫度改變時(shí)機(jī)體處于致死溫度臨界點(diǎn)時(shí)的檢 測(cè)，從而可進(jìn)行輔助耐溫選育的研究。
權(quán)利要求
1. 一種高溫環(huán)境下海水魚(yú)類(lèi)體表粘液功能蛋白檢測(cè)方法，它的方法步驟是收集粘 液；提取體表粘液蛋白；對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定；雙向電泳分離蛋白；蛋白圖譜分析；差異蛋 白點(diǎn)切膠回收；質(zhì)譜分析，確定功能蛋白；其特征在于所述的收集粘液是使用簡(jiǎn)便的無(wú)菌塑料吸管收集粘液；所述的雙向電泳分離蛋白其等電聚焦程序?yàn)?S1 Stp :300V, 2h ；S2 Stp :1000V, 2h ； S3 Grd :8000V, 2h ；S4 Stp :8000V, 2h ；S5 Grd :10000V, 3h ；S6 Stp : 10000，1. 5h ;S7 Stp 500V,12h ；所述的質(zhì)譜分析進(jìn)行MALDI-T0F-T0F質(zhì)譜分析，采用PMF技術(shù)和MASC0T、NCBI網(wǎng)站提 供的檢索工具進(jìn)行鑒定，確定功能蛋白一一凝集素以及其與溫度的相關(guān)性。
全文摘要
一種高溫環(huán)境下海水魚(yú)類(lèi)體表粘液功能蛋白檢測(cè)方法，首先收集魚(yú)類(lèi)體表粘液，其次粗提體表粘液蛋白；再利用雙向電泳技術(shù)得到體表粘液蛋白圖譜；之后再利用Imagemaster 2D Platinum 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析，查找到差異顯著的蛋白點(diǎn)；進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析，采用PMF技術(shù)和MASCOT、NCBI網(wǎng)站提供的檢索工具進(jìn)行鑒定，得到與高溫脅迫相關(guān)的功能蛋白。本發(fā)明中采用簡(jiǎn)便的無(wú)菌塑料吸管收集粘液，快速、簡(jiǎn)便，并可快速分裝，在-80℃下可保存一年以上；本發(fā)明中雙向電泳等點(diǎn)聚焦電泳程序可將鹽離子除凈，得到的蛋白點(diǎn)清晰，圓滑，可以更加準(zhǔn)確的對(duì)體表粘液功能蛋白定位定量。本發(fā)明適用于海水魚(yú)類(lèi)體表粘液蛋白在高溫環(huán)境下的差異性表達(dá)、功能蛋白確定等檢測(cè)技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102135524SQ20101060737
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者王新安, 馬愛(ài)軍, 黃智慧 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所