專利名稱：動(dòng)物源性功能性食品中五種磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動(dòng)物源性功能性食品中獸藥殘留檢測(cè)方法，特別涉及磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
改革開(kāi)放30年來(lái)，功能性食品行業(yè)作為21世紀(jì)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)愈來(lái)愈呈現(xiàn)出勃勃生機(jī)，功能性食品也逐漸走進(jìn)了廣大人民群眾的生活，對(duì)促進(jìn)機(jī)體健康、突破亞健康、祛除疾病等方面發(fā)揮了重要作用。動(dòng)物源性功能性食品如鈣粉、魚(yú)油和蜂蜜等的生產(chǎn)制備多以畜牧、水產(chǎn)動(dòng)物和半成品為原料，而磺胺類藥物因其造價(jià)低廉、抗病效果好，被廣泛地應(yīng)用于預(yù)防和治療家畜及水產(chǎn)品的細(xì)菌感染性疾病，這就有可能產(chǎn)生多種磺胺類殘留?；前奉惈F藥殘留對(duì)人體的直接毒害作用主要包括三種①對(duì)人類胃腸道微生物的影響，國(guó)內(nèi)外近年許多研究認(rèn)為，有抗菌性藥物殘留的動(dòng)物產(chǎn)品，可以對(duì)人類腸道的正常菌群產(chǎn)生不良的影響，部分敏感菌受抑制或被殺死，使得正常的微生物環(huán)境遭到破壞，有些條件性致病菌(如大腸桿菌等)可能大量繁殖，或易使體外病原菌侵入，損害人類健康。②造成人類病原菌耐藥性的增加，使用含抗生素等抗菌藥物的飼料后，抗菌藥物在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留可能使人類的病原菌長(zhǎng)期接觸這些低濃度的藥物，從而產(chǎn)生耐藥性。1997年10月首次"抗生素應(yīng)用于食品動(dòng)物后對(duì)人類醫(yī)療影響"國(guó)際研討會(huì)，專家一致認(rèn)為食品動(dòng)物長(zhǎng)期低劑量使用抗生素會(huì)增加耐藥菌，并且細(xì)菌的耐藥基因可以在人群中細(xì)菌、動(dòng)物群中細(xì)菌和生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)菌之間相互傳遞， 由此可導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性而引起人類和動(dòng)物感染性疾病治療的失敗。③直接導(dǎo)致人類疾病，有許多抗生素殘留可以直接導(dǎo)致人體產(chǎn)生疾病?；前奉愃幬镌谀讨袣埩?，不僅能抑制乳產(chǎn)品的發(fā)酵，而且還可能使人產(chǎn)生過(guò)敏和變態(tài)反應(yīng)。因此，國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、 歐盟和美國(guó)規(guī)定食品和飼料中磺胺類總量不得超過(guò)100 μ g/kg，我國(guó)無(wú)公害水產(chǎn)品中漁藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(附5070-200幻也規(guī)定了水產(chǎn)品中同樣限值。同樣GB/T 20759-2006中規(guī)定了畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的LC-MS-MS法，各種磺胺類藥物方法檢出限如下磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶為5. 0 μ g/kg ；磺胺二甲基嘧啶為20. 0 μ g/kg ；磺胺間二甲基嘧啶為 10.0 μ g/kg ；而磺胺喹噁啉目前暫無(wú)限量標(biāo)準(zhǔn)。GB/T221316-2007中規(guī)定在動(dòng)物肝、腎、肌肉組織和牛奶中23種磺胺藥物殘留的定量限均為50 μ g/kg ；在水產(chǎn)品中23種磺胺藥物殘留的定量限為10 μ g/kg。目前，動(dòng)物源性食品中磺胺類獸藥殘留量的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法、免疫分析法、高效液相色譜與紫外、熒光技術(shù)、電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用等。這些方法都有最低檢出濃度高，不能有效排除基質(zhì)干擾，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性且有機(jī)溶劑使用量大等缺點(diǎn)。 功能性食品中成分比較復(fù)雜，大多含有多種不同成分，這就給檢測(cè)其中的磺胺類獸藥殘留帶來(lái)困難。目前，功能性食品中磺胺類獸藥殘留檢測(cè)尚未有文獻(xiàn)報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種能夠有效檢測(cè)功能性食品中磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基嘧啶(SMR)、磺胺二甲基嘧啶(SDM)、磺胺喹噁啉(SQX)和磺胺間二甲氧嘧啶(SDT)五種磺胺類獸藥殘留的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中最低檢出濃度高，不能有效排除基質(zhì)干擾，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性且有機(jī)溶劑使用量大等缺點(diǎn)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種功能性食品中五種磺胺類獸藥殘留的 HPLC-MS-MS檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)樣品提取稱取適量樣品，乙腈作為溶劑渦旋振蕩提取2-4次，合并乙腈液，置分液漏斗中待用；稱樣量為0. 5克-10. 0克，每次溶劑提取乙腈用量為5mL-100mL。(2)樣品凈化用正己烷萃取步驟(1)中所得乙腈液，底層乙腈液經(jīng)濃縮后用10% 乙腈水溶解，過(guò)濾；(3)采取HPLC-MS-MS系統(tǒng)測(cè)定樣品中五種磺胺類獸藥殘留量。所述五種磺胺類獸藥包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉和磺胺間二甲氧嘧啶。所述步驟C3)采取HPLC-MS-MS系統(tǒng)測(cè)定樣品中五種磺胺類獸藥殘留量，檢測(cè)條件是色譜條件流動(dòng)相是乙腈0-90體積份0. 05% -0. 2%甲酸水溶液5-95體積份流速為0. 3mL/min ；進(jìn)樣量5μ L，柱溫:35°C ；質(zhì)譜條件電離方式為電噴霧電離，正離子(ESI+)；毛細(xì)管電壓3. 50kV ；離子源溫度110°C;錐孔氣氮?dú)猓?0L/Hr ；脫溶劑氣氮?dú)猓?00L/Hr，溫度400°C ；碰撞氣氬氣，0.14mL/min。所述流動(dòng)相甲酸水溶液為乙酸銨溶液或甲酸銨溶液，濃度為0. 05mM-10mM。所述樣品為動(dòng)物源性原料制成的功能性食品，例如以骨粉為原料制成的補(bǔ)鈣類功能性食品，以雞蛋蛋黃粉為原料制成的功能性食品，或者以蜂蜜為原料制成的功能性食品等。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的測(cè)定方法，對(duì)以動(dòng)物源性原料制成的功能性食品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉和磺胺間二甲氧嘧啶五種磺胺類獸藥殘留的分離性良好，靈敏度高，選擇性和特異性好，能夠有效排除基質(zhì)干擾和假陽(yáng)性， 最低檢出濃度低，達(dá)到20ng/ml，且在樣品處理過(guò)程中采用遞減量乙腈進(jìn)行提取，即保證了目標(biāo)物的回收率，還減少了有機(jī)溶劑的使用量，減少了廢液排放，節(jié)約了檢測(cè)成本。與其他方法相比，HPLC-MS-MS(液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜)系統(tǒng)技術(shù)靈敏度高，選擇性和特異性好，不僅可對(duì)樣品中低濃度的多藥物殘留進(jìn)行定性確認(rèn)，克服樣品基質(zhì)干擾， 而且能夠有效排除假陽(yáng)性，進(jìn)行動(dòng)物源性為原料制成的功能性食品中殘留物準(zhǔn)確的定量分析。本發(fā)明建立了適用于功能性食品中磺胺類獸藥殘留測(cè)定的HPLC-MS-MS技術(shù)，是動(dòng)物源性功能性食品生產(chǎn)過(guò)程中有效履行HACCP管理體系的重要內(nèi)容之一，是保障功能性食品安全的有力手段，也是廣大消費(fèi)者身體健康的重要保證，為以后功能性食品中獸藥殘留監(jiān)測(cè)提供了有效的技術(shù)支撐。


圖1為本發(fā)明五種磺胺類獸藥的TIC譜圖。
具體實(shí)施例方式下面將通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。1.樣品提取取混合均勻的樣品，稱取2g(精確至0. Olg)樣品裝于具塞旋蓋四氟乙烯試管中，加入30mL乙腈，渦旋振蕩lmin，振蕩提取30min，于10000r/min離心5min， 將乙腈層移入150mL分液漏斗中。向沉淀物再加入20mL乙腈搖勻，振蕩提取30min，于 lOOOOr/min離心5min，合并乙腈提取液。離心后沉淀物再加入IOmL乙腈，照上述操作振蕩離心，合并乙腈提取液，待凈化。2.樣品凈化提取液中加入25mL正己烷，振搖5min，將底層乙腈溶液移入150mL 雞心瓶中，加入15mL異丙醇，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45°C水浴中減壓蒸發(fā)至近干。雞心瓶中加入5mL乙腈，超聲30s溶解殘?jiān)?，將溶解液移?5mL離心管中；再向雞心瓶中加入3mL乙腈，超聲30s，合并溶解液。溶解液在氮吹儀上氮?dú)獯蹈伞?0%乙腈溶液溶解，漩渦lmin，過(guò) 0. 22 μ m微孔濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定。3.色譜質(zhì)譜條件流速為0. 3mL/min ；進(jìn)樣量5 μ L，柱溫35°C，流動(dòng)相及梯度洗脫條件見(jiàn)表1。MS/MS測(cè)定條件為電離方式為電噴霧電離，正離子(ESI+)；毛細(xì)管電壓 3. 50kV ；離子源溫度=IlO0C ；錐孔氣氮?dú)猓?0L/Hr ；脫溶劑氣氮?dú)猓?00L/Hr，溫度400°C ； 碰撞氣氬氣，0. 14mL/min。以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各種化合物離子對(duì)和電壓見(jiàn)表2。表1流動(dòng)相及梯度洗脫條件
時(shí)間/mm流動(dòng)相A (乙腈)％流動(dòng)相B (0.1%甲酸水溶液)％~
10.0025.00
30 30.5 40
15 50 40
95 85 50 60 95 95 表2各種化合物的離子對(duì)和電壓
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)物源性功能性食品中五種磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)樣品提取稱取樣品，乙腈作為溶劑渦旋振蕩提取2-4次，合并乙腈液，置分液漏斗中待用；(2)樣品凈化用正己烷萃取步驟(1)中所得乙腈液，底層乙腈液經(jīng)濃縮后用10%乙腈水溶解，過(guò)濾；(3)采取HPLC-MS-MS系統(tǒng)測(cè)定樣品中五種磺胺類獸藥殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述五種磺胺類獸藥包括磺胺嘧啶、 磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉和磺胺間二甲氧嘧啶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟C3)采取HPLC-MS-MS系統(tǒng)測(cè)定樣品中五種磺胺類獸藥殘留量，檢測(cè)條件是色譜條件 流動(dòng)相是乙腈0-90體積份0. 05% -0. 2%甲酸水溶液5-95體積份流速為0. 3mL/min ；進(jìn)樣量5 μ L，柱溫:35°C ； 質(zhì)譜條件電離方式為電噴霧電離，正離子(ESI+)；毛細(xì)管電壓:3. 50kV ；離子源溫度110°C ；錐孔氣氮?dú)猓?0L/Hr ；脫溶劑氣氮?dú)猓?00L/Hr，溫度400°C ；碰撞氣氬氣，0. 14mL/min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的甲酸水溶液為乙酸銨溶液或甲酸銨溶液，濃度為0. 05mM-10mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(1)稱樣量為0.5克-10. 0 克，每次溶劑提取乙腈用量為5mL-100mL。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種動(dòng)物源性功能性食品中五種磺胺類獸藥殘留的檢測(cè)方法，包括如下步驟(1)樣品提取稱取適量樣品，乙腈作為溶劑渦旋振蕩提取2-4次，合并乙腈液，置分液漏斗中待用；(2)樣品凈化用正己烷萃取步驟(1)中所得乙腈液，底層乙腈液經(jīng)濃縮后用10％乙腈水溶解，過(guò)濾；(3)采取HPLC-MS-MS系統(tǒng)測(cè)定樣品中五種磺胺類獸藥殘留量。本發(fā)明的測(cè)定方法，對(duì)功能性食品中五種磺胺類獸藥殘留的分離性良好，靈敏度高，選擇性和特異性好，能夠有效排除基質(zhì)干擾和假陽(yáng)性，最低檢出濃度低，且在樣品處理過(guò)程中采用遞減量乙腈進(jìn)行提取，即保證了目標(biāo)物的回收率，還減少了有機(jī)溶劑的使用量，減少了廢液排放，節(jié)約了檢測(cè)成本。
文檔編號(hào)G01N30/72GK102253148SQ20101060493
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者李星芝, 趙曉娟, 韓立軍 申請(qǐng)人:天津天獅生命源有限公司, 天津天獅生物發(fā)展有限公司, 天獅集團(tuán)有限公司