專利名稱：能靶向治療乳癌的人造油體載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，涉及使用大腸桿菌表達(dá)oleZH2蛋白的 方法，人造油體載體的制備方法以及該載體在專一性偵測及標(biāo)靶治療乳癌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥，亦稱為惡性腫瘤，根據(jù)目前了解，其病因是由于癌細(xì)胞異常分裂且在體內(nèi)各 處進(jìn)行轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致生理功能異常且難以治愈，近年來成為全球人類死因之首。從2003年起， 乳癌已成為臺灣女性中最常見的癌癥，世界上50%的乳癌病患已診斷出HER2/neU陽性。這 些病患缺乏臨床癥狀，且難以在早期發(fā)現(xiàn)。因此，迫切需求乳癌早期診斷工具。傳統(tǒng)上治療方法主要是利用外科手術(shù)方式將腫瘤切除，或是以化學(xué)藥物或放射線 手段來殺死癌細(xì)胞。但是外科手術(shù)方式難以根除癌細(xì)胞而且不易實(shí)施，一般化學(xué)藥物和放 射線治療不具有專一性，在治療過程中，往往會殺死維持一般生理功能所必須的正常細(xì)胞， 從而產(chǎn)生許多副作用，例如免疫功能下降(白血球數(shù)量下降)、惡心、嘔吐、掉發(fā)、腸胃吸收功 能衰退及貧血等現(xiàn)象。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞通常會帶有某些特殊分子生物標(biāo)記，近年來針對癌癥治療發(fā) 展出標(biāo)靶治療(targeting therapy)的方法。所謂標(biāo)靶治療，是設(shè)計(jì)一種可以專一性辨識癌 細(xì)胞表面分子生物標(biāo)記的藥物，可以有效阻斷癌細(xì)胞活化或抑制其生長，從而達(dá)到治療的 目的。標(biāo)靶治療藥物可以直接精準(zhǔn)地命中目標(biāo)癌細(xì)胞，對于體內(nèi)正常細(xì)胞的影響較小。因 此相對于傳統(tǒng)治療方法，標(biāo)靶治療具有低毒性、低副作用、高效率和實(shí)行方便等優(yōu)點(diǎn)。標(biāo)靶治療有多種方式，如利用一載體包覆、連結(jié)或鑲嵌一具有治療活性的藥 物分子，運(yùn)用各種機(jī)制將該載體與藥物分子專一性地遞送到目標(biāo)癌細(xì)胞，此種模式一般稱 為藥物傳遞系統(tǒng)(drug delivery system)。該載體具有標(biāo)靶功能，該物質(zhì)可以為蛋白質(zhì)(例 如抗體)、類固醇、糖類或其它化合物等。目前已知載體有高分子聚合顆粒、微胞(micell)、微酯粒(liposome)及病 毒性載體等，這些載體各具不同缺點(diǎn)，例如粒徑過大而不易被人體吸收、具有毒性、在血液 或體液中不穩(wěn)定等，在實(shí)際運(yùn)用上多有局限。此外，當(dāng)此類型載體結(jié)合上述可辨識癌細(xì)胞的 物質(zhì)時(shí)，通常需要復(fù)雜且耗時(shí)的化學(xué)合成步驟，不僅提高了制造成本，且會造成環(huán)境污染。 所以，迫切需求具有微小粒徑、無毒性、穩(wěn)定及易于結(jié)合辨識癌細(xì)胞的載體。針對上述需求，本發(fā)明利用分子生物技術(shù)，可提供一種人造油體載體，其制 備過程簡便且對環(huán)境污染很低。經(jīng)由活體外(in vitro)和活體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)證明本發(fā) 明的油體載體可有效地運(yùn)用于標(biāo)靶治療或偵測，且具優(yōu)異的生物兼容性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種融合蛋白，其包含一油體蛋白、一配體性肽或一抗體性 肽、一細(xì)胞穿透性肽或前述組合。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種人造油體載體，其包含上述融合蛋白和一脂質(zhì)，融合蛋白與脂質(zhì)重量/體積比值(微克/微升)至少約1/25，該油體平均粒徑為50納米 至2000納米。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述融合蛋白和人造油體載體的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種可以靶向治療乳癌的藥物傳遞系統(tǒng)，其包含上述 人造油體載體及一藥物、一訊號分子、或前述組合，能在活體外(in vitro)及活體內(nèi)(in vivo)對乳癌進(jìn)行專一性偵測及標(biāo)靶治療。
本發(fā)明所述的一種能靶向治療乳癌的人造油體載體的制備方法包括以下步驟
(1)融合蛋白的表達(dá)。重組菌種BL21(DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培養(yǎng)，細(xì)菌初 始密度OD55tl值為0.08。接種到新鮮含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌密度OD55tl值為 0. 3時(shí)，37°C誘導(dǎo)4小時(shí)，收集菌體，以4000 rpm、4°C冷凍離心10 min，再用0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次，收集菌體，以 0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer 濃縮成細(xì)菌密度OD55tl值為10的菌液。將細(xì)菌密度OD55tl值為10的菌液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲破碎(功 率3. 5%，時(shí)間2分鐘，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)。超聲結(jié)束后，以13000 rpm、4°C冷凍 離心10 min，收集離心后上清液和沉淀不水溶蛋白。(2)人造油體載體的制備。取IOOPg oleZH2蛋白，加入950μ1 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合 (功率3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷凍離心 10 min, 取出上面一層白色的油餅，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì) 胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，構(gòu)建出人造油體載體。本發(fā)明所述的人造油體載體經(jīng)過了各種性能測試，具有容積小、在血球或血清中 穩(wěn)定性佳、低毒性、低副作用、高效、操作方便等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所述的人造油體載體在活體外(in vitro)和活體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)中都具 有靶向性，能專一性識別靶細(xì)胞，當(dāng)包覆藥物后，能抑制腫瘤生長。在體內(nèi)抗腫瘤活性測試中，取約8-10周的裸鼠，用細(xì)胞株(SK0V3和MDA-MB-231) 進(jìn)行皮下組織注射，使裸鼠皮下組織的腫瘤大小約0. 5厘米以上，每星期兩次注射IOOmg/ ml包覆喜樹堿的油體載體在腫瘤上，結(jié)果顯示，隨時(shí)間的增加，包覆喜樹堿的油體載體能抑 制腫瘤生長，而且裸鼠體重沒有減少。這說明本研究成功構(gòu)建一種能靶向治療乳癌的人造 油體載體。除非文中另有說明，于本說明書中所使用之“一”或“該”及類似用語應(yīng)理解為包 含單數(shù)及復(fù)數(shù)形式。植物種子的油體具有相當(dāng)大的表面積，可用于包覆或鑲嵌大量的訊號分子， 以做為生物體內(nèi)移動的實(shí)時(shí)(real time)訊號放大器來追蹤并確認(rèn)病灶，也可用于包覆脂 溶性藥物，作為專一性藥物傳遞系統(tǒng)來治療疾病。本發(fā)明利用油體的上述特性，結(jié)合分子生 物技術(shù)，由簡易制備方法來提供一種人造油體載體(下文簡稱為油體載體)。本發(fā)明的油體載體包含一融合蛋白及一脂質(zhì)，其中，該融合蛋白包含一油體 蛋白、一配體性肽或一抗體性肽、一細(xì)胞穿透性肽或前述組合。本發(fā)明油體載體融合蛋白所含的油體蛋白并無任何限制。來自植物種子的油體蛋白較佳，例如芝麻油、橄欖油、大豆油、花生油和礦物油其組合，其中芝麻種子的油體蛋白更佳。本發(fā)明油體載體融合蛋白所含的配體性肽或抗體性肽，使油體載體成為專一性傳 遞載體(即標(biāo)靶載體)。配體性肽或抗體性肽可精準(zhǔn)地辨識癌細(xì)胞表面受體(rec印tor)，通 過配體性肽或抗體性肽與受體結(jié)合，可將包覆有抗癌藥物的油體載體直接投遞至癌變部位 或作用于癌細(xì)胞，提高區(qū)域性的藥物濃度，不影響正常細(xì)胞。此外，利用上述機(jī)制，也可刺激 癌細(xì)胞通過吞式作用(phagocytosis)與融合作用(fusion)吸收油體載體，使抗癌藥物進(jìn) 入癌細(xì)胞，從而達(dá)到治療及避免產(chǎn)生抗藥性的目的。本發(fā)明融合蛋白所包含配體勝肽或抗體勝肽并無任何限制，只要具有專一性 識別細(xì)胞的功能即可。就配體性肽而言，當(dāng)治療乳癌或卵巢癌時(shí)，可采用HER2/neU蛋白 質(zhì)受體的配體性肽。已知HER2/neu蛋白質(zhì)受體系屬于表皮細(xì)胞生長因子受體(印idermal growth factor receptor, EGFR)，其存在于多種癌細(xì)胞表面，在致癌機(jī)制中扮演重要角色， Nord等人已經(jīng)研發(fā)出一種可專一性地與HER2/neu蛋白質(zhì)受體結(jié)合的Sfer2性肽，以作 為該受體的配體。ZHer2性肽有58個(gè)氨基酸，其分子量(約為7至15千道爾頓)遠(yuǎn)小于單 株抗體分子量(150千道爾頓)，易于穿透細(xì)胞膜，使油體載體進(jìn)入乳癌細(xì)胞，進(jìn)行靶向性檢 測及治療。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明利用pJ01-oleZH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21 (DE3)宿主細(xì)胞后，經(jīng)過誘 導(dǎo)，進(jìn)行ole ZH2蛋白的生產(chǎn)，再將油和ole ZH2蛋白混合，構(gòu)建出人造油體載體。經(jīng)由活 體外(in vitro)和活體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)本發(fā)明的油體載體可有效地運(yùn)用于標(biāo)靶治療 或偵測，且具優(yōu)異的生物兼容性。本發(fā)明的制備過程簡便且對環(huán)境造成的污染很低。油體 載體在血球或血清中穩(wěn)定性佳，便宜、低毒性、低副作用、高效率、操作方便、容積小，容易運(yùn) 輸、能包覆各種不同油溶性抗癌藥物，包覆藥物后可有效殺死癌細(xì)胞，并可以對癌細(xì)胞進(jìn)行 專一性偵測及治療。


圖1是融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)和油體載體制備后的電泳圖。在圖1中，marker 蛋白標(biāo)準(zhǔn)116kDa，66. 2kDa, 45kDa, 35kDa, 25kDa, 18. 4kDa, 14. 4kDa 分別代表不同分子量 大小標(biāo)準(zhǔn)蛋白；oleosin 油體蛋白；oleoSin-ZH2 融合蛋白；AOB 油體載體；-IPTG 誘導(dǎo) 前；+IPTG誘導(dǎo)后；sup-1 大腸桿菌表達(dá)融合蛋白，超聲破碎，離心后的上清液；ppt-Ι 大 腸桿菌表達(dá)融合蛋白，超聲破碎，離心后的沉淀不水溶蛋白；sup-2 油與融合蛋白，超聲混 合，離心后的上清液；ppt-2 油與融合蛋白，超聲混合，離心后的沉淀不水溶蛋白。圖2是油體載體包覆熒光物質(zhì)yellow GGK和Nile red的顯微鏡觀察。在圖2中， 左列圖為明視野觀察圖。右列圖為熒光視野觀察圖。圖3是油體載體的AFM測試。圖4是油體載體在不同制備條件下的顯微鏡觀察。圖5是油體載體在不同制備條件下的穩(wěn)定度測試。圖6是油體載體的融血實(shí)驗(yàn)(上圖)；不同溫度下油體載體隨時(shí)間增加的粒徑變 化測試(下圖)。
圖7是油體載體作用于固定腫瘤細(xì)胞(Fixed cell)的專一性測試。圖8是油體載體作用于腫瘤活細(xì)胞(Living cell)的專一性測試。圖9是不同濃度的油體載體作用于I0V3細(xì)胞株的專一性測試。圖10是油體載體作用于SK0V3細(xì)胞株不同時(shí)間的專一性測試。圖11是不同濃度的油體載體作用于不同腫瘤活細(xì)胞株的專一性FLOW測試。圖12是油體載體作用于不同腫瘤活細(xì)胞株不同時(shí)間的專一性FLOW測試。圖13是油體載體作用于SK0V3細(xì)胞株的共軛熒光顯微鏡XY軸平面觀察和Z軸切 面觀察。圖14是包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的FIlR觀察。圖15是包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的穩(wěn)定性濁度測試。圖16是包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的細(xì)胞存活性試驗(yàn)。圖17是腫瘤小鼠注射油體載體后隨時(shí)間的IVSI觀察測試。圖18是腫瘤小鼠注射油體載體M小時(shí)后，臟器累積性測試和腫瘤組織冷凍切片 的熒光顯微鏡觀察。圖19是油體載體治療腫瘤負(fù)荷鼠的腫瘤體變化和體重變化觀察圖。圖20是油體載體治療腫瘤負(fù)荷鼠的腫瘤生長觀察圖。表1是油和融合蛋白的不同比例。表2是油體載體在不同制備條件下的粒徑大小測試。表3是油體載體在不同制備條件下的電負(fù)度測試。表4是包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的粒徑大小和電負(fù)度測試。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1油體載體的制備
重組菌種BL21 (DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培養(yǎng)，細(xì)菌初始密度OD55tl值為0. 08。 接種到新鮮含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌密度OD55tl值為0.3時(shí)，37°C誘導(dǎo)4小時(shí)， 收集菌體，以 4000 rpm、4°C冷凍離心 10 min，再用 0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次，收集菌體，以0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer濃縮成細(xì)菌密度OD55tl值為 10的菌液。將細(xì)菌密度OD55tl值為10的菌液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲破碎(功 率3. 5%，時(shí)間2分鐘，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)。超聲結(jié)束后，以13000 rpm、4°C冷 凍離心10 min，收集離心后上清液和沉淀不水溶蛋白。取30μ1的上清液并加入10μ1的 2Χ Sample Buffer，利用牛血清定量得到supl。沉淀不水溶蛋白加入30μ1的0. IM ρΗ7· 5 sodium phosphate buffer,并加入 10μ1 的 2Χ Sample buffer，利用牛血清定量得到 pptl，并用SDS-PAGE分析(圖1)，以Quantity One (Bio-RAD)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析， 由融合蛋白量換算融合蛋白質(zhì)濃度。取 IOOPg oleZH2 蛋白，加入 950μ1 0. OlM ρΗ7· 5 sodium phosphate buffer，再 加入50μ1芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功率3. 0%，time :20秒，run 0. 5秒，rest 0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min，取出上面一層白色的油餅，加入 0.01M pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，構(gòu)建出油體載體。用SDS-PAGE分析觀察是否為所構(gòu)建出來的目標(biāo)油體載體(圖1)。
結(jié)果顯示，將pJ01-oleZH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE!3)菌株后，會表達(dá)ole ZH2蛋白，可 以很明顯看到經(jīng)過誘導(dǎo)后，在預(yù)測位置有目標(biāo)蛋白生產(chǎn)出。然后，經(jīng)過構(gòu)建油體載體的步 驟后，目標(biāo)蛋白o(hù)leZH2可通過ole油體結(jié)構(gòu)蛋白，固定于油體上，可以看出oleZH2位置在 33KDa。實(shí)施例2油體載體包覆熒光物質(zhì)及油體AFM測試
取 oleZH2 蛋白，加入 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入含有 nile red (廠牌SIGMA，濃度0. 5Pg/ml)或是kllow GGK (廠牌懷德生技化學(xué)股份有限公司，濃度 lPg/ml)的芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功率3. 0%，time :20秒，run 0. 5秒，rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min，取出上面一層白色的油餅，加入 0.01M pH7.5 sodium phosphate buffer，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，構(gòu) 建出熒光油體載體。用0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer稀釋，并用熒光顯微鏡觀 察，Yellow GGK用488 nm激發(fā)，能看到油體載體發(fā)綠色熒光，nile red用454-458 nm激 發(fā)，能看到油體載體發(fā)紅色熒光(圖2)。將云母片用水清洗三次，每次三分鐘，再用0. 02M的MgC12泡2_3分鐘，再用清 水清洗一次。把油體載體加在云母片上，靜置2小時(shí)，使油體載體吸附在云母片上，然后用 ddH20清洗兩次，放置于37°C烘箱中干燥，最后AFM觀察油體型態(tài)和大小(圖3)。利用AFM 測試得出油體載體的大小約200 500納米。
實(shí)施例3油體載體在不同制備條件下的測試
不同比例的油和蛋白構(gòu)建油體載體。將油和oleZH2蛋白分別以比例為10:1、2:1、1:1、 1:5、1:10混合，取0162!12蛋白，加入0.01]\1 pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入芝 麻油(表1)，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功率3. 0%，time :20秒，run :0. 5秒， rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min，取出上面一層白色的油餅，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，構(gòu) 建油體載體。在不同pH條件下構(gòu)建油體載體。將油和融合蛋白的比例固定，取oleZH2蛋白， 力口入各種 PH 的 sodium phosphate buffer (pH6. 5、pH7. 0、pH7. 5、pH8. 0、pH9. 0)，再力口 入芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功率3. 0%，time 20秒，run :0. 5秒， rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min，取出上面一層白色的油餅，加入各種pH 的0.01M sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次， 構(gòu)建油體載體。用不同種類的油構(gòu)建油體載體。將油和融合蛋白的比例固定，取oleZH2蛋白質(zhì)， 加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入不同油(芝麻油、礦物油、花生油、橄 欖油和大豆油)，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功率3. 0%，time 20秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5秒)，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min，取出上面一層白色的油餅，加入0. OlM sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，構(gòu)建油體 載體。構(gòu)建上述不同條件的油體載體，用sodium phosphate buffer稀釋，再用熒光顯微 鏡觀察(圖4)。
油體載體的粒徑大小測試。不同條件的油體載體用sodium phosphate buffer稀 釋，適合粒徑分析儀測試的最佳稀釋比例是IXlO4到IXlO6個(gè)油體，將不同條件的油體載 體放入aiil cuvette里，再放進(jìn)粒徑分析儀中，進(jìn)行測試(表2)。油體載體的電負(fù)度測試。不同條件的油體載體用sodium phosphate buffer稀釋， 適合電位量測儀測試的最佳稀釋比例是1XIO4到1 X IO6個(gè)油體，將不同條件的油體載體放 Λ 2ml cuvette里，利用Zeta電位量測儀測試油體(表3)。
結(jié)果顯示，將油和融合蛋白以下列比例(10:1、2:1、1:1、1:5、1:10)混合，來測出最佳 的比例，用顯微鏡觀察，得出油和融合蛋白的最佳比例為1:1，此時(shí)油體載體的大小輪廓最 平均，而且油體載體之間的相互融合較少。當(dāng)以不同PH (6.5,7.0,7.5,8.0,9. 0)的buffer 構(gòu)建出油體載體，得出用PH7. 5的buffer構(gòu)建的油體載體大小輪廓最平均，而且油體載 體之間的相互融合較少。用各種油(芝麻油、礦物油、花生油、橄欖油和大豆油)構(gòu)建油體載 體，芝麻油和橄欖油所構(gòu)建的油體載體的大小輪廓最平均，而且油體載體之間的相互融合 較少，相反礦物油油體載體顆粒最大，而花生油油體載體之間互相融合較多，呈現(xiàn)鏈球狀。通過粒徑分析可知油和融合蛋白在1:1、1:5和1:10時(shí)，油體載體顆粒偏小。用 pH7. 5、pH8. 0和pH9. 0的buffer構(gòu)建出的油體載體顆粒偏小。用大豆油、芝麻油和橄欖油 所構(gòu)建的油體載體顆粒偏小。在zata分析圖中可以看出在不同制備條件下的油體載體的 電負(fù)度在-45 -56，差異不大。實(shí)施例4油體載體的穩(wěn)定度測試
不同條件的油體載體用sodium phosphate buffer調(diào)整其懸浮的混濁度(T)，在每 間隔固定時(shí)間持續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定度測試。為了要用分光光度計(jì)0D600測量油體載體，并使用2ml cuvette，選定間隔20分鐘，用分光光度計(jì)記錄不同條件的油體載體在sodium phosphate buffer中的懸浮程度。油體載體懸浮液的混濁度(T)，用10A表示是成比例，混濁度關(guān)系表 示T/T0=10A/10A0=10A/102. 0，將人造油體稀釋至iVo=2，開始隨時(shí)間測試其穩(wěn)定度(圖5)。 穩(wěn)定度結(jié)果顯示，油體載體的size越大越不穩(wěn)定，反之，油體載體的size越小越穩(wěn)定。實(shí)施例5油體載體對血球溶血性測試和血清穩(wěn)定性測試
油體載體對血球溶血性測試。將油體載體置于生理鹽水和5%葡萄糖溶液，并放置 3730分鐘后離心10000rpm、10分鐘，最后用分光光度計(jì)測量(圖6)。油體載體對血清穩(wěn)定性測試。將油體載體置于含有5%血清的sodium phosphate buffer并打散，用粒徑分析儀在不同時(shí)間和不同溫度進(jìn)行測量，并觀察隨時(shí)間增加油體載 體在血清的穩(wěn)定度和大小(圖6)。結(jié)果顯示油體載體對血球無傷害，不會使血球溶血。粒徑分析顯示，油體載體在5% 血清里，在不同溫度測量二4小時(shí)后仍非常穩(wěn)定。實(shí)施例6油體載體的靶向?qū)Ｒ恍怨δ軠y試(in vitro檢測)
油體載體作用于固定腫瘤細(xì)胞(Fixed cell)的專一性測試。取細(xì)胞SK0V3和 MDA-MB-231，于前一日接種在 24 孔板中，隔日以 Phosphate Buffered Saline (PBS)pH7. 5 清洗兩次，用2. 5% Formaldehyde在30°C固定40分鐘后，再用PBS pH7. 5清洗，放置30°C 讓PBS蒸發(fā)。將油體載體加入在固定好的細(xì)胞，在25°C反應(yīng)兩小時(shí)，以PBS pH7.5清洗三 次，每次15分鐘，用blocking solution (3% BSA溶于PBS中)在室溫下反應(yīng)一小時(shí)，以1 200稀釋一抗anti-her2/neu (9G6)，室溫反應(yīng)至少一小時(shí)，再PBS清洗三次，每次15分鐘， 以1 :500稀釋二抗anti-mouse IgG-TRITC,反應(yīng)一小時(shí)，再用PBS清洗三次，每次15分鐘， 用1 :15000稀釋的DAPI染細(xì)胞核，染色4分鐘，再以PBS清洗三次，每次15分鐘，放置干 燥，封片，利用熒光顯微鏡觀察(圖7)。油體載體作用于腫瘤活細(xì)胞(Living cell)的專一性測試。取細(xì)胞(MCF_7、MCF_7/ Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔1 X IO5細(xì)胞的密度接種在M孔板 中，以 DMEM/F12 培養(yǎng)液(GIBCO Invitrogen Corporation, New York, USA)培養(yǎng)，隔日以 DMEM/F12清洗兩次，以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋油體載體，加在已清洗好的細(xì)胞中，在37°C， 5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，再以PBS pH7. 4清洗三次，用2.5% R)rmaldehyde于30°C固 定40分鐘，以PBS pH7. 4清洗三次，然后用blocking solution (3% BSA溶于PBS中)在室 溫下反應(yīng)一小時(shí)，以1 :200稀釋一抗anti-her2/neu(9G6)，室溫反應(yīng)一小時(shí)，再PBS pH7. 4 清洗三次，每次15分鐘，以1 :500稀釋二抗anti-mouse IgG-TRITC,反應(yīng)一小時(shí)，再用PBS PH7. 4清洗三次，每次15分鐘，用1 15000稀釋的DAPI染細(xì)胞核，染色4分鐘，再以PBS清 洗三次，每次15分鐘，放置干燥，封片，利用熒光顯微鏡觀察(圖8)。不同濃度(MOI)的油體載體作用于腫瘤活細(xì)胞測試。取細(xì)胞(MCF-7、MCF_7/ Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔1 X IO5細(xì)胞的密度接種在M孔板 中，以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日以DMEM/F12清洗兩次，以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋油體載 體，加入不同濃度油體載體在已清洗好的細(xì)胞中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，再 以PBS pH7. 4清洗三次，用2. 5% Formaldehyde于30°C固定40分鐘，以PBS pH7. 4清洗三 次，然后用blocking solution (3% BSA溶于PBS中)在室溫下反應(yīng)一小時(shí)，以1 :200稀釋 一抗anti-her2/neu (9G6)，室溫反應(yīng)一小時(shí)，再PBS ρΗ7· 4清洗三次，每次15分鐘，以1 500稀釋二抗anti-mouse IgG _ TRITC，反應(yīng)一小時(shí)，再用PBS pH7. 4清洗三次，每次15分 鐘，用1 :15000稀釋的DAPI染細(xì)胞核，染色4分鐘，再以PBS清洗三次，每次15分鐘，放置 干燥，封片，利用熒光顯微鏡觀察(圖9)。油體載體作用腫瘤活細(xì)胞不同時(shí)間的測試。細(xì)胞于前一日以每孔IX IO5細(xì)胞的密 度接種在24孔板中，以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日以DMEM/F12清洗兩次，以DMEM/F12培 養(yǎng)液稀釋油體載體，加在已清洗好的細(xì)胞中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間(15分 鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘和240分鐘)，再以PBS pH7. 4清洗三次，用2. 5% Formaldehyde 于30°C固定40分鐘，以PBS pH7. 4清洗三次，然后用blocking solution (3% BSA溶于 PBS中)在室溫下反應(yīng)一小時(shí)，以1 :200稀釋一抗anti-her2/neu (9G6)，室溫反應(yīng)一小時(shí)， 再PBS pH7. 4清洗三次，每次15分鐘，以1 :500稀釋二抗anti-mouse IgG - TRITC,反應(yīng) 一小時(shí)，再用PBS pH7. 4清洗三次，每次15分鐘，用1 15000稀釋的DAPI染細(xì)胞核，染色4 分鐘，再以PBS清洗三次，每次15分鐘，放置干燥，封片，利用熒光顯微鏡觀察(圖10)。不同濃度的油體載體作用于腫瘤活細(xì)胞的FLOW測試。取細(xì)胞(MCF-7、MCF_7/ Her 18、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔5X105細(xì)胞的密度接種在12孔板中， 以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日以DMEM/F12清洗兩次，以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋油體載體，加 入不同濃度油體載體在已清洗好的細(xì)胞中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，再以PBS PH7. 4清洗三次，加入trypsin作用5分鐘，取細(xì)胞至tube (廠牌BD，型號Falcon)中， 1000 rpm、離心10分鐘，去除上清液，若馬上用流式細(xì)胞儀(廠牌BD，型號=FACSCanto)檢測，直接加PBS buffer。若隔天測試，用2. 5% i^ormaldehyde于4°C固定，隔夜放置，將細(xì)胞 打散，用流式細(xì)胞儀檢測(圖11)。油體載體作用腫瘤活細(xì)胞不同時(shí)間的FLOW測試。取細(xì)胞(MCF-7、MCF_7/Herl8、 SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231)，于前一日以每孔5 X IO5細(xì)胞的密度接種在12孔板中，以 DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日以DMEM/F12清洗兩次，以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋油體載體，加在 已清洗好的細(xì)胞中，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間(15分鐘、30分鐘、60分鐘、120 分鐘和240分鐘)，再以PBS pH7. 4清洗三次，加入trypsin作用5分鐘，取細(xì)胞至tube中， 1000 rpm、離心10分鐘，去除上清液，若馬上用流式細(xì)胞儀檢測，直接加PBS buffer.若隔 天測試，用2. 5% Formaldehyde于4°C固定，隔夜放置，將細(xì)胞打散，用流式細(xì)胞儀檢測(圖 12)。油體載體對SK0V3細(xì)胞株的共軛熒光顯微鏡XY軸平面觀察和Z軸切面觀察。取細(xì) 胞SK0V3，于前一日以每孔1 X IO5細(xì)胞的密度接種在M孔板中，以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)， 隔日以DMEM/F12清洗兩次，以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋油體載體，加在已清洗好的細(xì)胞中，在 37°C, 5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，再以PBS pH7. 4清洗三次，再用2. 5% Formaldehyde于 30°C固定40分鐘，以PBS pH7. 4清洗三次，然后用blocking solution (3% BSA溶于PBS 中)在室溫下反應(yīng)一小時(shí)，以1 :200稀釋一抗anti-her2/neu(9G6)，室溫反應(yīng)一小時(shí)，再PBS ρΗ7· 4清洗三次，每次15分鐘，以1 :500稀釋二抗anti-mouse IgG - TRITC，反應(yīng)一小時(shí)， 再用PBS pH7. 4清洗三次，每次15分鐘，用1 :15000稀釋的DAPI染細(xì)胞核，染色4分鐘，再 以PBS清洗三次，每次15分鐘，放置干燥，封片，利用雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡拍攝 相同位置不同高度的照片，再用Leica system分析(圖13)。結(jié)果顯示，利用細(xì)胞固定的方式，來測試由oleZH2所構(gòu)建的油體載體表面融合的 ZH2 pepteide是否能專一性識別HER-2/neu蛋白受體。利用有HER-2/neu的MCF7/Herl8細(xì) 胞和無HER-2/neu的MDA-MB-231細(xì)胞，用油體載體作用此兩種細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231 細(xì)胞未觀察到有熒光訊號產(chǎn)生，而在MCF7/Herl8細(xì)胞可以觀察到很多綠色熒光訊號。有綠 色熒光油體載體訊號是因?yàn)榧?xì)胞上的HER-2/neu過度表達(dá)，所以能讓油體載體辨識到?？?見，油體載體的oleZH2能專一性識別HER-2/neu過度表現(xiàn)的細(xì)胞。油體載體能專一性識別HER-2/neu過度表現(xiàn)的固定細(xì)胞，下一步要深入了解油 體載體對活細(xì)胞的專一性識別。利用MCF-7、MCF-7/Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 細(xì)胞株，從結(jié)果可知油體載體作用于HER-2/neu過度表現(xiàn)的細(xì)胞(MCF7/Herl8、SKBR3和 SK0V3)，由熒光顯微鏡可以觀察到很多綠色熒光訊號。油體載體不能作用于沒有HER-2/neu 過度表現(xiàn)的細(xì)胞(MCF7和MDA-MB-231)，由熒光顯微鏡未觀察到有熒光訊號產(chǎn)生。以上結(jié)果表明證明油體載體能專一性識別靶細(xì)胞。當(dāng)用不同濃度的油體載體作用 于HER-2/neu過度表現(xiàn)的SK0V3細(xì)胞，由熒光顯微鏡觀察，隨著油體載體的加入濃度越高， 油體載體結(jié)合在細(xì)胞表面越多，專一性識別細(xì)胞的能力越好，但是油體載體作用到MOI 200 時(shí)有呈現(xiàn)飽和的趨勢。利用油體載體在不同時(shí)間作用SK0V3細(xì)胞，由熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)油體載體 加入濃度固定時(shí)，隨著時(shí)間越長，油體載體結(jié)合在細(xì)胞表面越多，專一性識別細(xì)胞的能力越 好，但是油體載體作用到兩小時(shí)時(shí)有呈現(xiàn)飽和的趨勢。利用流式細(xì)胞儀檢測油體載體在不同時(shí)間和不同濃度進(jìn)入細(xì)胞的多少，結(jié)果顯示當(dāng)濃度固定時(shí)，時(shí)間越長，油體載體進(jìn)入細(xì)胞的量越多。當(dāng)時(shí)間固定，濃度越高，油體載體進(jìn) 入細(xì)胞的量越多。無論是時(shí)間越長或是濃度越高，油體載體進(jìn)入細(xì)胞的量都有增加的趨勢， 后來都會有飽和的情形。利用共軛熒光顯微鏡對有油體載體作用的單一細(xì)胞進(jìn)行平行切割，在不同的層面 疊加起來，可以看到發(fā)綠色熒光的油體載體確實(shí)進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)施例7油體載體的靶向藥物傳送測試(in vitro檢測)
取oleZH2蛋白，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入含有喜樹堿 (廠牌SIGMA，濃度500μ g/ml)的芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功 3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷凍離心 10 min，取出上 面一層白色的油餅，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲機(jī)打散，相 同步驟進(jìn)行三次，構(gòu)建出包覆油溶性藥物的油體載體。包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的FIlR觀察。油體載體于4°C冷凍離心10 min, 取出上層油餅，再用冷凍干燥機(jī)將油體載體冷凍干燥，最后將油體載體放置鹽片中，并用 FTIR觀察(圖14)。包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的穩(wěn)定性濁度測試。油體載體用sodium phosphate buffer調(diào)整其懸浮的混濁度(T)，在每間隔固定時(shí)間持續(xù)進(jìn)行穩(wěn)定度測試。為 了要用分光光度計(jì)0D600測量油體載體，并使用aiil cuvette，選定間隔20分鐘，并用分光 光度計(jì)記錄不同條件的油體載體在sodium phosphate buffer中的懸浮程度。油體載體懸 浮液的混濁度(T)，用10A表示是成比例，混濁度關(guān)系表示為T/T0=10A/10A0=10A/102. 0，將 油體載體稀釋至Ao=2，開始隨時(shí)間測試其穩(wěn)定度(圖15)。包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的粒徑大小測試。油體載體用sodium phosphate buffer稀釋，適合粒徑分析儀測試的最佳稀釋比例是1 X IO4到1 X IO6個(gè)油體，將不同條件 的油體載體放入anl cuvette里，放進(jìn)粒徑分析儀中，進(jìn)行測試(表4)。
包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的電負(fù)度測試。油體載體用sodium phosphate buffer稀釋，適合電位量測儀測試的最佳稀釋比例是IXlO4到1 X IO6個(gè)油體，將不同條件 的油體載體放入anl cuvette，利用kta電位量測儀測試(表4)。包覆不同濃度喜樹堿的油體載體的細(xì)胞存活性測試。取細(xì)胞(MCF-7、MCF_7/ Herl8、SK0V3、SKBR3和MDA-MB-231 )，于前一日以每孔1 X IO4細(xì)胞的密度接種在M孔板 中，以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔日以DMEM/F12清洗兩次，并以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋油體載 體，加在已清洗好的細(xì)胞中，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)，再以PBS pH7. 4清洗三次， 加入含有10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱以標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行繼代培養(yǎng)， 于72小時(shí)計(jì)數(shù)活細(xì)胞和apoptosis細(xì)胞，進(jìn)行分析(圖16)。結(jié)果顯示，當(dāng)用油體載體包覆不同濃度的油溶性喜樹堿后，利用FIlR測試喜樹堿 的官能基結(jié)果得知，油體載體可以包覆油溶性藥物(喜樹堿最大溶油溶解度是500mg/ml)。 由粒徑測試得知油體載體可以包覆油溶性藥物，不會因?yàn)榘菜幬锒褂腕w載體的size 更大。但是，油體載體包覆喜樹堿后，隨包覆量增加，其粒徑增加，負(fù)電性減少。經(jīng)過穩(wěn)定度 測試，油體載體包覆喜樹堿后的size偏小，因此非常穩(wěn)定。經(jīng)以上實(shí)驗(yàn)證明，可知油體載體能專一性識別細(xì)胞，當(dāng)用油體載體包覆不同濃度 的油溶性藥物(喜樹堿)作用在HER-2/neu過度表現(xiàn)細(xì)胞(MCF7/Herl8和SK0V3)和沒有HER-2/neu過度表現(xiàn)細(xì)胞(MDA-MB-231和MCF7)，觀察不同時(shí)間細(xì)胞apoptosis程度，結(jié)果 得到在固定時(shí)間內(nèi)，油體載體包覆濃度越高的油溶性藥物，細(xì)胞apoptosis程度越高。實(shí)施例8油體載體的靶向?qū)Ｒ恍怨δ軠y試(in vivo檢測)
取約8-10周的裸鼠，利用細(xì)胞株(SK0V3和MDA-MB-231)進(jìn)行皮下組織注射，使裸 鼠皮下組織的腫瘤大小約0. 5厘米以上，注射lOOPg/ml含有熒光染劑(Yellow GGK)的油 體載體在腫瘤上，在注射后的0h、lh、4h、》!和Mh時(shí)間，利用IVIS觀察油體載體的殘留訊 號(圖17)。再取出腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，利用非侵入式活體影像系統(tǒng)觀察油 體載體殘留在各個(gè)臟器中的訊號(圖18)。再把腫瘤和有訊號的組織進(jìn)行冷凍組織切片。先取下腫瘤，利用OCT包埋(包埋時(shí)不要有氣泡)，在_20°C的冰箱里放置一小時(shí) 以上，利用冷凍切片機(jī)(廠牌LeiCa，型號CM3050S)切下包埋的組織并貼附在玻片上，用 PBS pH7. 4清洗兩次，再用2. 5% R)rmaldehyde于室溫固定40分鐘，以PBS pH7. 4清洗三 次，用15000倍稀釋的DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色，以PBS pH7. 4清洗三次，封片，利用熒光顯微 鏡進(jìn)行觀察(圖18)。
結(jié)果顯示，約8-10周大的裸鼠利用有HER-2/neu過度表現(xiàn)細(xì)胞(SKOViB)和沒有 HER-2/neu過度表現(xiàn)細(xì)胞(MDA-MB-231)，進(jìn)行皮下組織注射，使裸鼠皮下組織的腫瘤長、寬 和高大小各約0. 5厘米以上，并注射帶熒光的油體載體在腫瘤上，利用IVIS觀察，隨著時(shí)間 增加，在有HER-2/neu過度表現(xiàn)的腫瘤上，亮度不會減少，一直有殘留訊號，而沒有HER-2/ neu過度表現(xiàn)的腫瘤，隨著時(shí)間的增加，油體載體熒光訊號發(fā)光強(qiáng)度會慢慢消失，可見油體 載體能專一性識別腫瘤。取出裸鼠的腫瘤、心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟，對每個(gè)臟器進(jìn)行IVIS觀察，可以 看到在有HER-2/neu過度表現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞里，有熒光訊號。再進(jìn)行冷凍組織切片，利用熒光 顯微鏡觀察油體載體的分布，可以看出有HER-2/neu過度表現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞有熒光油體載體 殘留。實(shí)施例9油體載體的靶向藥物遞送測試(in vivo檢測)
取約8-10周的裸鼠，利用細(xì)胞株(SK0V3和MDA-MB-231)進(jìn)行皮下組織注射，使裸鼠皮 下組織的腫瘤大小約0. 5厘米以上，每星期兩次注射100mg/ml包覆喜樹堿的油體載體在腫 瘤上，觀察腫瘤大小與體重變化(圖19，圖20)。由以上動物實(shí)驗(yàn)可觀察到油體載體的靶向性，進(jìn)一步觀察包覆藥物的油體載體的 癌癥治療效果。由結(jié)果顯示，隨時(shí)間的增加，包覆喜樹堿的油體載體能抑制腫瘤生長，使腫 瘤縮小，而裸鼠的體重沒有減少，這更能達(dá)到治療的功效。
權(quán)利要求
1.一種靶向治療乳癌的人造油體載體，其特征在于，所述人造油體載體包含一融合蛋 白和一脂質(zhì)，融合蛋白與脂質(zhì)重量/體積比值(微克/微升)至少約1/25，該油體平均粒徑 為50納米至2000納米。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人造油體載體，其特征在于，該人造油體載體所含的融合蛋 白，其包含一油體蛋白、一配體性肽或一抗體性肽、一細(xì)胞穿透性肽或前述組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人造油體載體，其特征在于，該人造油體載體所含的融合 蛋白，其所含的油體蛋白并無任何限制；來自植物種子的油體蛋白較佳，例如芝麻油、橄欖 油、大豆油、花生油和礦物油其組合，來自芝麻種子的油體蛋白更佳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人造油體載體，其特征在于，該人造油體載體所含的融合 蛋白，其所含的配體勝肽或抗體勝肽并無任何限制，只要具有專一性識別細(xì)胞的功能即可； 就配體性肽而言，當(dāng)治療乳癌或卵巢癌時(shí)，可采用HER2/neU蛋白質(zhì)受體的配體性肽。
5.一種如權(quán)利要求1所述的靶向治療乳癌的人造油體載體的制備方法，其特征包括以 下步驟(1)融合蛋白的表達(dá)；重組菌種BL21(DE3)/pJ01-oleZH2在37°C下培養(yǎng)，細(xì)菌初始密 度OD55tl值為0.08 ；接種到新鮮含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌密度OD55tl值為0.3時(shí)， 37°C誘導(dǎo)4小時(shí)，收集菌體，以4000 rpm、4°C冷凍離心10 min，再用0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次,收集菌體，以 0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer濃縮成 細(xì)菌密度OD55tl值為10的菌液；將細(xì)菌密度OD55tl值為10的菌液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲破碎(功率3. 5%， 時(shí)間2分鐘，run 0. 5秒，rest :0. 5秒);超聲結(jié)束后，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min, 收集離心后上清液和沉淀不水溶蛋白；(2)人造油體載體的制備；取IOOPgoleZH2蛋白，加入950μ1 0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合(功率 3. 0%, time :20 秒，run :0. 5 秒，rest :0. 5 秒)，以 13000 rpm、4°C冷凍離心 10 min，取出上 面一層白色的油餅，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì)胞粉碎 機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，構(gòu)建出人造油體載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的重組菌種為BL21(DE3)/ pJ01-oleS12，在 37°C下培養(yǎng)，初始濃為 OD55tl = 0. 08。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的重組菌種接種到新鮮含有 氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞濃達(dá)OD55tl = 0.3時(shí)，37°C誘導(dǎo)4小時(shí)，收集菌體，以 4000 rpm、4°C冷凍離心 10 min，再用 0. 1 M pH7. 5 sodium phosphate buffer 清洗一次， 收集菌體，以0. IM pH7. 5 sodium phosphate buffer濃縮成細(xì)胞濃 OD55tl = 10的菌液。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(1)所述的細(xì)胞濃OD55tl = 10的菌 液用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲破碎；超聲設(shè)置為功率3. 5%，時(shí)間2分鐘，rim 0. 5秒， rest 0. 5 秒。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的取IOOPgoleZH2蛋白，加 入950μ1 0. OlM ρΗ7· 5 sodium phosphate buffer，再加入50μ1芝麻油，用超聲波細(xì)胞粉 碎機(jī)進(jìn)行冰上超聲混合。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的超聲設(shè)置為功率3.0%，time 20 秒，run 0. 5 秒，rest 0. 5 秒。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟(2)所述的冰上超聲混合后，以13000 rpm、4°C冷凍離心10 min，取出上面一層白色的油餅，加入0. OlM pH7. 5 sodium phosphate buffer 1 ml，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)打散，相同步驟進(jìn)行三次，建構(gòu)出人造油體載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于，所述的人造油體載體在不同制 備條件下(不同比例、不同PH和不同種的油)的優(yōu)化測試，由熒光顯微鏡觀察、粒徑大小分 析、電負(fù)度測試和穩(wěn)定度測試可得到人造油體載體最佳條件有下列幾點(diǎn)(1)油和融合蛋 白的最佳比例為1:1，此時(shí)人造油體載體的大小輪廓最平均，而且人造油體載體之間的相互 融合較少；(2)用pH7.5的buffer構(gòu)建的人造油體載體大小輪廓最平均，而且人造油體載體之 間的相互融合較少；(3)以芝麻油制備的人造油體載體最穩(wěn)定；(4)人造油體載體的size越大越不穩(wěn)定，越小越穩(wěn)定；(5)利用過膜實(shí)驗(yàn)?zāi)艿玫捷^小的人造油體載體；(6)不同條件構(gòu)建的人造油體載體的負(fù)電荷為-45 -56，差異不大。
13.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于所述的人造油體載體包覆熒光 物質(zhì)(如yellow GGK和Nile red)后，也能使人造油體載體發(fā)出熒光，而且更利于觀察，可 用于反映HER2/neu陽性癌細(xì)胞，從而可專一性檢測過度表達(dá)HER2/neu的乳癌細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于所述的人造油體載體在活體外 (in vitro)和活體內(nèi)(in vivo)實(shí)驗(yàn)中都具有靶向性，能專一性識別靶細(xì)胞，包覆藥物后可 有效殺死乳癌細(xì)胞，可用于乳癌細(xì)胞的靶向治療。
15.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于所述的人造油體載體進(jìn)行 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(固定細(xì)胞和活細(xì)胞)，可以看出人造油體載體可專一性識別過度表現(xiàn)HER-2/ neu的腫瘤細(xì)胞株(SKBR3和SK0V3)，不會識別沒有表現(xiàn)HER-2/neu的腫瘤細(xì)胞(MCF7和 MDA-MB-231)；人造油體載體加入的時(shí)間越長或濃度越高，人造油體載體結(jié)合到HER-2/neu 過度表現(xiàn)的細(xì)胞越多，專一性識別此細(xì)胞的能力越好，但是人造油體載體作用時(shí)間達(dá)兩小 時(shí)或濃度達(dá)200時(shí)有呈現(xiàn)飽和的情形；利用共軛熒光顯微鏡在不同的層面疊加起來可以看 出發(fā)綠色熒光的人造油體載體進(jìn)入細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步說明若濃度固定，時(shí)間越長， 人造油體載體進(jìn)入細(xì)胞的量越多，若時(shí)間固定，濃度越多，人造油體載體進(jìn)入細(xì)胞的量越多。
16.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于所述的人造油體載體包覆油溶 性藥物(喜樹堿)，當(dāng)其作用于有HER-2/neu過度表現(xiàn)的細(xì)胞時(shí)，會產(chǎn)生毒殺效果，使細(xì)胞有 apoptosis現(xiàn)象；當(dāng)作用于沒有HER-2/neu過度表現(xiàn)的細(xì)胞時(shí)，則少看到有毒殺效果。
17.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于所述的人造油體載體注射到裸 鼠腫瘤細(xì)胞，利用IVIS觀察到人造油體載體在有HER-2/neu過度表現(xiàn)的腫瘤組織上有訊號 產(chǎn)生，在沒有HER-2/neu過度表現(xiàn)的腫瘤組織則無訊號；再經(jīng)由組織切片得知人造油體載 體會專一性識別過度表現(xiàn)HER-2/neu的腫瘤，不會識別沒有表現(xiàn)HER-2/neu的腫瘤。
18.根據(jù)權(quán)利要求5獲得的人造油體載體，其特征在于所述的人造油體載體包覆油 溶性藥物(喜樹堿)，在體內(nèi)抗腫瘤活性測試中，取約8-10周的裸鼠，用細(xì)胞(SK0V3和MDA-MB-231)進(jìn)行皮下組織注射，使裸鼠皮下組織的腫瘤大小約0. 5厘米以上，每星期兩次 注射100mg/ml包覆喜樹堿的人造油體載體在腫瘤上，結(jié)果顯示，隨時(shí)間增加，包覆喜樹堿 的人造油體載體能抑制腫瘤生長，而且裸鼠體重沒有減少；這說明本研究成功構(gòu)建一種能 靶向治療乳癌的人造油體載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能靶向治療乳癌的人造油體載體、該載體的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明利用pJO1-oleZH2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)宿主細(xì)胞后，經(jīng)過誘導(dǎo)，進(jìn)行oleZH2蛋白的生產(chǎn)，再將油和oleZH2蛋白混合，構(gòu)建出人造油體載體。經(jīng)由活體外(invitro)和活體內(nèi)(invivo)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)本發(fā)明的人造油體載體可有效地運(yùn)用于標(biāo)靶治療，而且包覆熒光物質(zhì)的油體載體可反映HER2/neu陽性癌細(xì)胞，從而可專一性檢測過度表達(dá)HER2/neu的乳癌細(xì)胞。本發(fā)明的制備過程簡便且對環(huán)境造成的污染很低，人造油體載體在血球或血清中穩(wěn)定性佳，還具有便宜、高效、操作方便、容積小和容易運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。此人造油體載體能包覆各種不同油溶性抗乳癌藥物，包覆藥物后可有效殺死乳癌細(xì)胞，并可以對乳癌細(xì)胞進(jìn)行專一性檢測及標(biāo)靶治療。
文檔編號G01N33/574GK102100914SQ201010598650
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者朱寶美, 陳順基 申請人:朱寶美, 陳順基