專利名稱：一種魚過敏原標準物的制備方法
技術領域：
一種魚過敏原標準物的制備方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
近年來，食物過敏已成為一個公眾性的食品安全問題，而魚是最常見的八大食品 過敏原之一。過敏疾病嚴重危害人們的身體健康，雖然激發(fā)過敏反應的最低過敏原的量隨 著人群的不同而不同，但是微量的過敏原就可以使絕大部分患者產(chǎn)生過敏癥狀。研究魚過 敏原的檢測與控制，必須首先獲得高純度的過敏原組分，它可以更為細致地了解魚過敏原 的生化特征及各種加工過程中對其致敏性的影響提供實驗材料，從而有助于低過敏或無過 敏的魚制品以及魚過敏原的檢測。而當前對于研究過敏原檢測的關鍵問題就是沒有標準物 質(zhì)，所以制備標準物質(zhì)有著非常重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
要解決的技術問題
本發(fā)明所要解決的技術問題是要提供一種魚過敏原標準物的制備方法，同時該方法不 能破壞所制備物質(zhì)的生物活性。技術方案
一種魚過敏原標準物的制備方法，該制備方法采取低溫攪拌浸提、分級鹽析、低溫離心 和凝膠過濾層析等多種技術相結合的手段，將高致敏性蛋白組分從魚中分離出來，最大程 度的保留了蛋白質(zhì)的生物活性。制備步驟為
(1)脫脂
魚肉搗碎均質(zhì)后，用60 90°C石油醚脫脂，按魚肉質(zhì)量石油醚體積比為1 10 (W/ V)，在低于60°C下進行攪拌萃取12h，4°C 6000r/min離心15min，棄上清，沉淀置于通風櫥 使石油醚揮發(fā)，得脫脂魚肉；
(2)浸提
將脫脂魚肉溶解于4°C預冷的0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，魚肉質(zhì)量磷酸 鹽緩沖液體積比為1 20 (W/V)，4°C磁力攪拌4h，4°C 7000r/min離心20min，收集上清， 得魚蛋白浸提液；
(3)加熱
將魚蛋白浸提液加熱但不沸騰，加熱30min后，4°C 7000r/mim離心20min，收集上清； 去除了不耐熱雜蛋白，得耐熱魚蛋白浸提液；
(4)飽和硫酸銨分級沉淀
在所得耐熱魚蛋白浸提液中緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，直至溶液中硫酸銨飽和度 達30%，4°C磁力攪拌lh、靜置lh，4°C 8000r/min離心20min，離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加 入硫酸銨直至飽和度達50%，4°C磁力攪拌lh、靜置lh，4°C 8000r/mim離心20min，收集沉淀，用0. 05mol/L、ρΗ7· 4的磷酸鹽緩沖液復溶； (5)凝膠過濾層析
將50%飽和度的蛋白組分裝入透析袋，用0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液于4°C透 析48h，然后使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行凝膠過濾層析；條件經(jīng)Superdex 75 10/300 GL 凝膠柱層析，以0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速0. 4mL/min, 2mL間隔自動 收集，280nm紫外吸收監(jiān)測，收集所需出峰樣品，合并后于4°C超純水透析Mh;樣品冷凍干 燥后即為所制備的魚過敏原蛋白標準品。所述的魚過敏原標準物的制備方法，第(1)步中所用石油醚為60 90°C的石油 醚，第(2)步中獲得的魚蛋白浸提液、第(3)步中獲得的耐熱魚蛋白浸提液、第(4)步中獲得 的飽和硫酸銨分級沉淀組分、第(5)步中獲得的凝膠過濾各峰組分都要進行變性聚丙烯酰 胺電泳SDS-PAGE鑒定，電泳條件為13. 5%分離膠，5%濃縮膠，恒壓100V，步驟(5)中冷凍干 燥后獲得的條帶單一、相對分子量12kDa的蛋白質(zhì)組分即為魚過敏原標準物。本發(fā)明的有益效果在于所制備的魚過敏原標準物質(zhì)最大程度的保留了其生物活 性，可用于免疫學來檢測食品中的魚過敏原物質(zhì)，同時還有助于在醫(yī)學上對魚過敏的診斷 分析。
圖1所制備的魚過敏原標準物SDS-PAGE鑒定圖。
具體實施例方式實施例1 魚過敏原標準物的制備，步驟如下 (1)脫脂
魚肉搗碎均質(zhì)后，用60 90°C石油醚脫脂，按魚肉質(zhì)量石油醚體積比為1 10 (W/ V)，在低于60°C下進行攪拌萃取12h，4°C 6000r/min離心15min，棄上清，沉淀置于通風櫥 使石油醚揮發(fā)，得脫脂魚肉。(2)浸提
將脫脂魚肉溶解于4°C預冷的0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，魚肉質(zhì)量磷酸 鹽緩沖液體積比為1 20 (W/V)，4°C磁力攪拌4h，4°C 7000r/min離心20min，收集上清， 得魚蛋白浸提液。(3)加熱
將魚蛋白浸提液加熱但不沸騰，加熱30min后，4°C 7000r/min離心20min，收集上清。 去除了不耐熱雜蛋白，得耐熱魚蛋白浸提液。(4)飽和硫酸銨分級沉淀
在所得耐熱魚蛋白浸提液中緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，直至溶液中硫酸銨飽和度 達30%，4°C磁力攪拌lh、靜置lh，4°C 8000r/min離心20min，離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加 入硫酸銨直至飽和度達50%，4°C磁力攪拌lh、靜置lh，4°C 8000r/min離心20min，收集沉 淀，用0. 05mol/L、pH7· 4的磷酸鹽緩沖液復溶。(5)凝膠過濾層析
將50%飽和度的蛋白組分裝入透析袋，用0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液透析4 (4°C)，然后使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行凝膠過濾層析。條件經(jīng)Superdex 75 10/300 GL 凝膠柱層析，以0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速0. 4mL/min, 2mL間隔自動 收集，280nm紫外吸收監(jiān)測，收集所需出峰樣品，合并后超純水透析24h (4°C )。樣品冷凍干 燥后即為所制備的魚過敏原蛋白標準品。
實施例2 魚過敏原蛋白的SDS-PAGE鑒定
對實施例1中第(2)、(3)、(4)、(5)步所獲得的魚蛋白浸提液、耐熱魚蛋白浸提液、飽和 硫酸銨分級沉淀組分、凝膠過濾各峰組分進行SDS-PAGE鑒定。電泳條件為13. 5%分離膠， 5%濃縮膠，恒壓100V。圖1中所制備的標準物質(zhì)條帶單一，相對分子量12kDa，與文獻報道 相一致。
權利要求
1.一種魚過敏原標準物的制備方法，其特征在于制備步驟為(1)脫脂魚肉搗碎均質(zhì)后，用60 90°C石油醚脫脂，按魚肉質(zhì)量石油醚體積比W/V為1 10， 在低于60°C下進行攪拌萃取12h，4°C 6000r/min離心15min，棄上清，沉淀置于通風櫥使石 油醚揮發(fā)，得脫脂魚肉；(2)浸提將脫脂魚肉溶解于4°C預冷的0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，魚肉質(zhì)量磷酸 鹽緩沖液體積比W/V為1 20，4°C磁力攪拌4h，4°C 7000r/min離心20min，收集上清，得 魚蛋白浸提液；(3)加熱將魚蛋白浸提液加熱但不沸騰，加熱30min后，4°C 7000r/min離心20min，收集上清； 去除了不耐熱雜蛋白，得耐熱魚蛋白浸提液；(4)飽和硫酸銨分級沉淀在所得耐熱魚蛋白浸提液中緩慢加入硫酸銨，邊加邊攪拌，直至溶液中硫酸銨飽和度 達30%，4°C磁力攪拌lh、靜置lh，4°C 8000r/min離心20min，離心后的上清液中繼續(xù)緩慢加 入硫酸銨直至飽和度達50%，4°C磁力攪拌lh、靜置lh，4°C 8000r/min離心20min，收集沉 淀，用0. 05mol/L、pH7· 4的磷酸鹽緩沖液復溶；(5)凝膠過濾層析將50%飽和度的蛋白組分裝入透析袋，用0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液于4°C透 析48h，然后使用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行凝膠過濾層析；條件經(jīng)Superdex 75 10/300 GL 凝膠柱層析，以0. 05mol/L、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速0. 4mL/min, 2mL間隔自動 收集，280nm紫外吸收監(jiān)測，收集所需出峰樣品，合并后于4°C超純水透析Mh ；樣品冷凍干 燥后即為所制備的魚過敏原蛋白標準品。
2.根據(jù)權利要求1所述的魚過敏原標準物的制備方法，其特征在于，第(1)步中所用石 油醚為60 90°C的石油醚，第(2)步中獲得的魚蛋白浸提液、第(3)步中獲得的耐熱魚蛋 白浸提液、第(4)步中獲得的飽和硫酸銨分級沉淀組分、第(5)步中獲得的凝膠過濾各峰組 分都要進行變性聚丙烯酰胺電泳SDS-PAGE鑒定，電泳條件為13. 5%分離膠，5%濃縮膠，恒 壓100V，步驟(5)中冷凍干燥后獲得的條帶單一、相對分子量12kDa的蛋白質(zhì)組分即為魚過 敏原標準物。
全文摘要
一種魚過敏原標準物的制備方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明涉及從魚中將小清蛋白這種過敏原物質(zhì)進行有效的提取、分離和純化的方法，所述小清蛋白的提純采取低溫攪拌浸提、分級鹽析、低溫離心和凝膠過濾層析等多種技術相結合的手段，將高致敏性蛋白組分從魚中分離出來，最大程度的保留了蛋白質(zhì)的生物活性。本發(fā)明方法獲得的蛋白質(zhì)有助于魚過敏的診斷并可用于免疫學來檢測食品中的魚過敏原物質(zhì)。
文檔編號G01N1/28GK102128738SQ201010597749
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月21日 優(yōu)先權日2010年12月21日
發(fā)明者勇倩倩, 匡華, 宋姍姍, 王利兵, 胥傳來, 鄧小芳, 馬文蔚 申請人:江南大學