專利名稱：肥大細(xì)胞脫顆粒的直接監(jiān)測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種測(cè)定引起類過敏反應(yīng)的物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
過敏反應(yīng)為常見的不良反應(yīng)之一。過敏反應(yīng)即變態(tài)反應(yīng)，是外源性抗原物質(zhì)與體內(nèi)抗體間所發(fā)生的一種非正常的免疫反應(yīng)。可以誘發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)很多，如蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子物質(zhì)具有完全的抗原性；另一些分子較小的化合物可作為半抗原與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合成全抗原，從而引起過敏反應(yīng)。目前涉及到過敏反應(yīng)的過敏物質(zhì)很多，發(fā)生頻率較高的有藥品(中藥及西藥)、食品、花粉、螨蟲等。最新調(diào)查研究表明，77 %的急性過敏反應(yīng)為類過敏反應(yīng)，類過敏反應(yīng)發(fā)生率遠(yuǎn)高于I型超敏反應(yīng)。類過敏反應(yīng)無需IgE介導(dǎo)，首次接觸藥物即可出現(xiàn)過敏癥狀，給人類的生活帶來及大的危害。類過敏反應(yīng)屬于非免疫反應(yīng)，無免疫系統(tǒng)參與，不需接觸抗原物質(zhì)，也無抗體參與，首次用藥即可激發(fā)，外來物質(zhì)直接刺激肥大細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞脫顆粒，釋放大量組胺， 由此產(chǎn)生過敏癥狀。因此，肥大細(xì)胞脫顆粒是類過敏反應(yīng)中最直接、最重要的環(huán)節(jié)。肥大細(xì)胞的脫顆粒過程是由一系列步驟組成的，它包括囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、定向、錨定、 融合等環(huán)節(jié)，每一個(gè)環(huán)節(jié)均受到嚴(yán)格調(diào)控。因此直接觀察囊泡的運(yùn)動(dòng)方向監(jiān)測(cè)其與膜融合的過程無疑是動(dòng)態(tài)觀察脫顆粒的最直接方法，但目前還沒有一個(gè)合適的方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。RBL-2H3細(xì)胞是離體實(shí)驗(yàn)中常用的大鼠肥大細(xì)胞株，具有與在體肥大細(xì)胞相似的反應(yīng)特性，因此，常被做為過敏反應(yīng)的離體研究對(duì)象。在本發(fā)明中，綠色熒光蛋白(Green Fluorescence Protein, GFP)與囊泡表面的標(biāo)志性表面分子CD63基因融合，使RBL-2H3細(xì)胞(離體實(shí)驗(yàn)中最常規(guī)使用的大鼠肥大細(xì)胞株)特異性表達(dá)GFP-⑶63分子，使囊泡具有可識(shí)別的綠色熒光，利用全內(nèi)反射顯微鏡成像技術(shù)，通過對(duì)囊泡與細(xì)胞膜融合釋放活性物質(zhì)的直接觀察，評(píng)估肥大細(xì)胞脫顆粒的程度，從而建立一種直接觀測(cè)方法。該方法在活細(xì)胞狀態(tài)下，直觀、靈敏、快速對(duì)致敏原進(jìn)行篩選，克服了原有方法的不足，將為過敏原過敏性篩查、過敏原檢測(cè)、環(huán)境安全性監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域提供新的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種通過肥大細(xì)胞脫顆粒的直接監(jiān)測(cè)測(cè)定過敏物質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞和過敏物質(zhì)放到一起培養(yǎng)，步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
優(yōu)選的方法包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，孵育；步驟3，加入過敏物質(zhì)用顯微鏡掃描采集圖像，步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。更優(yōu)選的方法包括以下步驟步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng) 24h ；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。更優(yōu)選的方法還可以是以下方法，包括以下步驟步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng) 24h ；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。本發(fā)明所述的過敏物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)藥物，花粉，食物，螨蟲，細(xì)菌，微生物，植物等。本發(fā)明針對(duì)藥物中的過敏物質(zhì)具有特別優(yōu)越的價(jià)值，如藥物的注射劑，特別是針對(duì)中藥的注射劑如雙黃連粉針、清開靈注射液、穿琥寧注射液、參麥注射液、魚腥草注射液寸。本發(fā)明的方法經(jīng)過以下實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的方法比現(xiàn)有技術(shù)優(yōu)越1 材料試劑MEM 培養(yǎng)基(GIBC0，美國)；Compound48/80 (Sigma,美國)；CD63-GFP 質(zhì)粒；Iipofect轉(zhuǎn)染試劑(Tiangen Biotech，中國)；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Tiangen Biotech，中國)；E. coli感受態(tài)大腸桿菌(Tiangen Biotech，中國)；大鼠嗜堿性細(xì)胞細(xì)胞株RBL-2H3細(xì)胞購自協(xié)和細(xì)胞庫，使用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo 371，美國)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化，中國)；激光掃描共焦顯微鏡及全內(nèi)反射顯微鏡(Olympus FV1000,日本)；PCR儀(英國TechneTC-512)2 方法2. 1CD63-GFP RBL-2H3 細(xì)胞的構(gòu)建2. 1. 1CD63-GFP融合基因的構(gòu)建CD63全長(zhǎng)cDNA是從RBL-2H3細(xì)胞中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)擴(kuò)增獲得。上游引物為 AGCTTCGAATTCatggc ggtggaagga ggaatg (EC0R I)，下游引物為ACCGGTGGATCCCGCATTACTTCATAGCCACTTCGA (BamH I)。CD63 cDNA通過EcoR I和BamH I雙酶切后與經(jīng)相同酶切后的 pEGFP-Nl質(zhì)粒鏈接，后克隆入感受態(tài)E. coli DH5a中，構(gòu)建成⑶63-GFP E. coli，抗生素篩選后，增菌，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。2. 1. 2質(zhì)粒提取增菌后，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，具體過程按說明書所示。2. 1. 3 轉(zhuǎn)染體外擴(kuò)增質(zhì)粒后按照DNAfection試劑盒說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)。 轉(zhuǎn)染后使用不含青鏈霉素的MEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。7 后培養(yǎng)液中加入G418 (G418濃度為 0. 6ug/ml)進(jìn)行篩選。待篩選至有熒光的細(xì)胞達(dá)到50%左右時(shí)，利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選，純化后，傳代，得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。2. 2本發(fā)明的肥大細(xì)胞脫顆粒的活體檢測(cè)方法2. 2. ITIRFM觀察將RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡IOOX油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后切換至TIRFM掃描模式，開始連續(xù)掃描采集圖像，曝光時(shí)間0. Is, Is采集一張圖片，連續(xù)采集20min。compound48/80及陰性對(duì)照藥(細(xì)胞培養(yǎng)液)分別均在圖像采集前加入。2. 2. 2激光掃描共聚焦顯微鏡將RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h 后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡IOOX油鏡下觀察。 選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每隔IOs采集一張圖像，共采集40min。COmpOimd48/80及陰性對(duì)照藥(細(xì)胞培養(yǎng)液)分別均在圖像采集前加入。4 結(jié)果4. 1CD63-GFP RBL-2H3 細(xì)胞株的建立轉(zhuǎn)染了 GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，500-600nm波長(zhǎng)處采集熒光信號(hào)。圖像大小512X512B CD63-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，圖1 CD63-GFP RBL-2H3細(xì)胞株的建立轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，500-600nm波長(zhǎng)處采集熒光信號(hào)。圖像大小512X512。從圖1可以看出，在單純轉(zhuǎn)染Free GFP的對(duì)照組細(xì)胞中，GFP熒光均勻分布在整個(gè)細(xì)胞中；而在轉(zhuǎn)染CD63-GFP的細(xì)胞中，GFP熒光分布在細(xì)胞內(nèi)囊泡的膜表面，形成圓環(huán)樣的形狀，說明轉(zhuǎn)染成功。4. 2Compound48/80刺激后TIRFM觀察細(xì)胞膜表面熒光顆粒變化圖2C0mp0und 48/80刺激后，細(xì)胞膜表面TIRF結(jié)果圖轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，500-600nm波長(zhǎng)處采集熒光信號(hào)。選取到合適的細(xì)胞及視野后，切換至TIRF狀態(tài)， EM-CXD工作狀態(tài)-60°C，圖像采集時(shí)間0. ls，大小512X512，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。TIRF圖像采集在加入compound48/80后立即開始。通過圖2可以看出，經(jīng)抗原刺激后，細(xì)胞膜表面在不同時(shí)間出現(xiàn)多個(gè)熒光顆粒，表明我們觀察到了細(xì)胞內(nèi)被熒光標(biāo)記的囊泡運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞膜表面時(shí)的狀態(tài)。圖3細(xì)胞經(jīng)Compound 48/80刺激后激光共聚焦成像結(jié)果轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，500-600nm波長(zhǎng)處采集熒光信號(hào)。選取到合適的細(xì)胞及視野后，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。compound48/80在第二張圖像采集后加入。通過圖3可以看出，經(jīng)抗原刺激后，細(xì)胞內(nèi)部熒光顆粒在不同時(shí)間點(diǎn)有比較明顯的向細(xì)胞外運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象，說明我們觀察到了細(xì)胞內(nèi)被熒光標(biāo)記的囊泡向細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)的過程。4. 3無關(guān)刺激后TIRFM觀察細(xì)胞膜表面熒光顆粒變化圖4轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入無關(guān)刺激后TIRF成像結(jié)果轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm, 500-600nm波長(zhǎng)處采集熒光信號(hào)。選取到合適的細(xì)胞及視野后，切換至TIRF采集狀態(tài)。EM-CCD工作狀態(tài)-60°C，圖像大小512X512，采集時(shí)間0. ls，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。TIRF圖像采集在加入無關(guān)刺激劑(細(xì)胞培養(yǎng)液)后立即開始。通過圖4可以看出，經(jīng)無關(guān)刺激后，細(xì)胞膜表面在不同時(shí)間點(diǎn)基本無新增熒光顆粒出現(xiàn)，說明沒有被熒光標(biāo)記的囊泡運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞膜表面。圖5無關(guān)刺激后共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)部熒光顆粒運(yùn)動(dòng)變化轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液。37°C孵育30min后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng) 488nm，500-600nm波長(zhǎng)處采集熒光信號(hào)。選取到合適的細(xì)胞及視野后，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。無關(guān)刺激劑(細(xì)胞培養(yǎng)液)在第二張圖像采集后加入。通過圖5可以看出，經(jīng)無關(guān)刺激后，細(xì)胞內(nèi)部熒光顆粒在不同時(shí)間點(diǎn)在做隨機(jī)運(yùn)動(dòng)，說明我們對(duì)無關(guān)刺激細(xì)胞未觀察到細(xì)胞內(nèi)被熒光標(biāo)記的囊泡向細(xì)胞膜運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。討論⑶63是一種分子量為50_60kDa的四次跨膜的糖蛋白，表達(dá)于靜止的嗜堿性顆粒、 肥大細(xì)胞和血小板的嗜堿性顆粒膜的表面[1，2].嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞抗原激活后， 胞漿內(nèi)的顆粒與細(xì)胞漿膜融合，使顆粒內(nèi)的炎癥介質(zhì)如組胺連續(xù)釋放，引起過敏或類過敏反應(yīng)。研究表明[3]，用抗IgE抗體激活人嗜堿性粒細(xì)胞后，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表面的CD63表達(dá)增加，說明肥大細(xì)胞脫顆粒的過程是細(xì)胞內(nèi)嗜堿性顆粒運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞膜表面， 與細(xì)胞膜融合后，釋放出顆粒內(nèi)的活性物質(zhì)的過程，CD63的表達(dá)與脫顆粒呈正相關(guān)W]。為了監(jiān)測(cè)肥大細(xì)胞脫顆粒的動(dòng)態(tài)過程，2001年，Amano T.等用GFP轉(zhuǎn)染大鼠RBL-2H3細(xì)胞的 CD63基因，獲得CD63-GFP融合表達(dá)細(xì)胞[5]，動(dòng)態(tài)觀察了細(xì)胞內(nèi)的熒光顆粒在IgE介導(dǎo)的I 型超敏反應(yīng)過程中細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的運(yùn)動(dòng)過程，但對(duì)于非IgE介導(dǎo)的類過敏反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程尚有待研究。嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)的機(jī)理不盡相同，例如嗜堿性粒細(xì)胞釋放介質(zhì)時(shí)，每個(gè)介質(zhì)顆粒分別與細(xì)胞膜融合，形成各自的出口而被排出，而肥大細(xì)胞的大多數(shù)介質(zhì)顆粒先在細(xì)胞內(nèi)融合，然后經(jīng)共同的通道排出W]。因此，對(duì)細(xì)胞表面脫顆粒過程的監(jiān)測(cè)能更精確的反應(yīng)出肥大細(xì)胞脫顆粒的進(jìn)程。^rtSMMitIt (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRF) 是近年來新興的一種光學(xué)成像技術(shù)，是利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標(biāo)記樣品的極薄的區(qū)域，觀測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍通常在200nm以下。 因?yàn)榧ぐl(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景噪音，因此，此項(xiàng)技術(shù)非常適合觀察細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。本發(fā)明用GFP-CD63轉(zhuǎn)染肥大細(xì)胞株，使囊泡具有可識(shí)別的熒光標(biāo)識(shí)，用TIRF觀察它在表面出現(xiàn)的機(jī)率，直接評(píng)估藥物刺激肥大細(xì)胞脫顆粒的特性，從而為類過敏反應(yīng)的檢測(cè)提供新的檢測(cè)手段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在無關(guān)抗原刺激下，細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，囊泡幾乎靜止不動(dòng)，在抗原的刺激下，囊泡向膜表面運(yùn)動(dòng)，并在細(xì)胞表面檢測(cè)到瞬間出現(xiàn)的熒光信號(hào)，激光共聚焦掃描的結(jié)果與全內(nèi)反射顯微鏡檢測(cè)到的結(jié)果一致。本發(fā)明建立了一種通過追蹤肥大細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)動(dòng)狀態(tài)反映其脫顆粒狀況的方法， 并通過實(shí)際應(yīng)用充分說明了本方法的快速、靈敏性及可靠性。該方法克服了傳統(tǒng)方法的不足，可應(yīng)用于類過敏原的早期快速篩查及鑒定，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。參考文獻(xiàn)1. 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圖IA左為熒光圖，右為透射圖GFP對(duì)照細(xì)胞，圖IB左為熒光圖，右為透射圖⑶63-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞圖2compound 48/80刺激后，細(xì)胞膜表面TIRF結(jié)果3細(xì)胞經(jīng)Compound 48/80刺激后激光共聚焦成像結(jié)果圖4轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入無關(guān)刺激后TIRF成像結(jié)果圖5無關(guān)刺激后共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)部熒光顆粒運(yùn)動(dòng)變化
具體實(shí)施例方式通過以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例方式通過以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1、測(cè)定方法步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時(shí)加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2IOOg,加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. Og)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入測(cè)試藥后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在?；蛘卟襟E1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時(shí)加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入測(cè)試藥后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集 20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。實(shí)施例2、過敏物質(zhì)測(cè)定方法步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時(shí)加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入待測(cè)疑似過敏物質(zhì)后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。 選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在?；蛘卟襟E1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時(shí)加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHC03500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 IOOg,加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. Og)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入疑似待測(cè)過敏物質(zhì)后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。實(shí)施例3、中藥注射劑過敏物質(zhì)測(cè)定方法步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時(shí)加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入中藥注射劑后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在?；蛘卟襟E1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(MEM培養(yǎng)液 MEM粉9. 4g，L-谷氨酰胺0. ^2g，NaHCO3 2. 2g加三蒸水1000ml，用時(shí)加入10%胎牛血清， 青、鏈霉素10萬單位)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿(直徑3cm，玻璃底厚度 0. 17 μ m) 37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液(配制方法NaC1400mg，KCl IOOmg, MgCl2 50mg, NaHCO3 500mg, NaH2PO4 32. 5mg, CaCl2 100g，加蒸餾水至 1000ml,臨用前加葡萄糖 1. 0g)， 37 °C 孵育 30min ；步驟3，加入中藥注射劑后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像， 共采集20min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
權(quán)利要求
1.一種通過肥大細(xì)胞脫顆粒的直接監(jiān)測(cè)測(cè)定過敏物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞和過敏物質(zhì)放到一起培養(yǎng)， 步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，孵育；步驟3，加入過敏物質(zhì)用顯微鏡掃描采集圖像，步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，將轉(zhuǎn)染了 CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h ； 步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像， 共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。 或步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞放到MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)Mh ； 步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入過敏物質(zhì)后移至全內(nèi)反射顯微鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集20min。 步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)包括但不限于以下物質(zhì)藥物，花粉，食物，螨蟲，細(xì)菌，微生物，植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為藥物注射劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為中藥注射劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的過敏物質(zhì)為雙黃連注射劑、清開靈注射劑、穿琥寧注射劑、參麥注射劑、魚腥草注射劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟1，將轉(zhuǎn)染了CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入測(cè)試藥后移至激光掃描共聚焦顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每IOs采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集40min。步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，步驟1，將轉(zhuǎn)染了⑶63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3 細(xì)胞用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代三次后，將細(xì)胞接種至共聚焦培養(yǎng)皿37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后；步驟2，將培養(yǎng)液換為臺(tái)氏液，37°C孵育30min ；步驟3，加入測(cè)試藥后移至全內(nèi)反射顯微鏡100X油鏡下觀察。選取細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好且無互相重疊的視野后開始連續(xù)掃描采集圖像，每Is采圖一張，連續(xù)采集圖像，共采集 20mino步驟4，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種通過肥大細(xì)胞脫顆粒的直接監(jiān)測(cè)測(cè)定過敏物質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，轉(zhuǎn)染了CD63-GFP質(zhì)粒的RBL-2H3細(xì)胞和過敏物質(zhì)放到一起培養(yǎng)，步驟2，用顯微鏡掃描采集培養(yǎng)物的圖像，步驟3，根據(jù)圖像中顯示的熒光顆粒的存在和運(yùn)動(dòng)確定過敏物質(zhì)的存在。
文檔編號(hào)G01N21/84GK102156113SQ201010585029
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者于友華, 侯燕鳴, 張倩, 李連達(dá), 王丹巧, 王毅, 胡劍江, 雷洪濤 申請(qǐng)人:中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心