專利名稱：一種利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低聚木糖的測定方法，特別涉及一種利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法。
背景技術(shù)：
低聚木糖是一類聚合度為2 8的β -1，4-木糖苷鍵連接而成的低聚糖的總稱， 作為一種新型功能性的低聚糖，低聚木糖是一種高效的人體和動物的雙歧因子和免疫增強(qiáng)劑，具有良好的調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)和激活機(jī)體免疫功能等多種保健促生功能，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料和飼料等行業(yè)。低聚木糖的制備方法主要有木聚糖定向酶降解、蒸汽爆破等方法，所得到的產(chǎn)品中均為包括一系列聚合度不同的各種低聚木糖組分的混合物。目前，低聚木糖的糖組分分析和含量測定主要采用下述幾種方法
(1)將低聚木糖經(jīng)強(qiáng)酸加熱水解后生成木糖，再以顯色劑或高效液相色譜儀測木糖量，然后換算成低聚木糖，所采用的色譜柱主要有Nova-Pak 250X3.9 (4ym)(見 CN100422736C)、Bio-Rad Aminex HPX-87H (見 GB/T23747-2009)或 HPX-87P 等；
(2)采用活性炭柱層析、硅膠薄層析(見CN101632877A)或高效液相色譜法分離和測定低聚木糖中各種糖組分，主要采用的色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-42A ；
(3)采用氣質(zhì)聯(lián)動法測定。其中，高效液相色譜法是當(dāng)前低聚木糖產(chǎn)品分析和檢測應(yīng)用較為廣泛的一種方法。方法(1)采用強(qiáng)酸加熱水解法將所有的低聚木糖均水解成木糖，無法區(qū)分和定量測定不同代聚木糖組分；方法(2)由于低聚木糖的各種糖組分的分子結(jié)構(gòu)相近、分子量差異較小，現(xiàn)有的薄層析和高效液相色譜法都難以實(shí)現(xiàn)聚合度相鄰的低聚木糖組分的直接有效分離，也難以對不同低聚木糖組分進(jìn)行定量測定；方法(3)的需要對糖進(jìn)行衍生化處理， 操作復(fù)雜，測試成本較高。同時(shí)，由于缺乏木七糖等聚合度更高的低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，對產(chǎn)品中這些低聚木糖組分定性和定量分析較為困難。上述各種低聚木糖的測定方法均存在著操作步驟繁瑣、糖組分的分離度不高、結(jié)果重現(xiàn)性差或檢測成本昂貴等不足；
因此，研究和開發(fā)一種準(zhǔn)確和快速的低聚木糖的定性分析和定量測定方法，對于該類產(chǎn)品的檢驗(yàn)評價(jià)和推廣應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高效液相離子交換色譜定性分析和定量測定低聚木糖的方法，以實(shí)現(xiàn)對低聚木糖樣品，尤其是木糖至木八糖類糖組分的快速高效定性分析和精確定量檢測。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 一種利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，包括以下步驟(1)高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件
美國Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，采用CarboPacTM 4200 (3乂250111)色譜柱帶保護(hù)柱(3X5(toim)，柱溫30°C，自動上樣，進(jìn)樣體積10. O μ L ；以500mmol/L醋酸鈉禾口 IOOmmol/ L氫氧化鈉為淋洗液進(jìn)行二元梯度淋洗，流速為0. 3mL/min,在O 40min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為O 120mmol/L ；電化學(xué)檢測器檢測模式為金工作電極和pH_Ag/AgCl復(fù)合型參比電極，采用積分脈沖安培檢測法和色譜峰面積積分法測定糖組分的含量；
(2)低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)工作方程的測定
將木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成0. 5 10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用步驟(1)中的色譜條件測定木糖至木六糖的標(biāo)準(zhǔn)工作方程和RT ；
(3)木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間的確定
以木糖至木六糖的NDP與步驟(2)測定的RT，進(jìn)行線性回歸計(jì)算出RT與NDP之間的線性關(guān)系式為RT (min)=2. 5785XNDP+1. 97 ，相關(guān)系數(shù)R2=O. 9952 ；由該線性關(guān)系式計(jì)算出木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間；
(4)低聚木糖成分的分析與測定
將低聚木糖待測樣品充分溶解于25 30°C的蒸餾水中，定容并調(diào)節(jié)待測低聚木糖組分的濃度1. O 8. Omg/L,在IOOOOrpm條件下離心5min后以0. 2 μ m微濾膜過濾上清液得樣品液，采用步驟(1)中的色譜條件進(jìn)行色譜檢測；采用步驟(2)和(3)進(jìn)行木二糖至木六糖的定量測定，及木七糖和木八糖的定性分析。
步驟(2)中，所述的標(biāo)準(zhǔn)工作方程為
木糖 A=3. 5218Cl - 0. 0193 ；
木二糖 A=3. 0798C2 - 0. 1026 ；
木三夢IA=1.5199C3-0.0031木四IFIA=1.7209C4-0.1158木五IFIA=1.3676C5-0.1513木六夢IA=1.0952c6-0.1537
上述標(biāo)準(zhǔn)工作方程中，A表示色譜峰面積(nC min)，c表示糖組分的濃度(mg/L)。步驟(3)中，木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間分別為20. 023min和22. 60Imin。高效離子交換色譜法主要將高效液相色譜技術(shù)與離子交換技術(shù)相結(jié)合，以具有大孔或薄殼型或多孔表面層結(jié)構(gòu)的離子交換樹脂作為色譜填料，借助物質(zhì)在離子樹脂與淋洗液之間的解離和分配差異達(dá)到迅速、連續(xù)、高效和靈敏分離檢測的效果。高效離子交換色譜柱具有廣PH范圍、易再生和使用壽命長的優(yōu)點(diǎn)，對分析樣品的適用性強(qiáng)，廣泛應(yīng)用于離子、 有機(jī)物的定性分析和定量測定。糖類分子本身含有多羥基，具有電化學(xué)活潑性和解離能力， 如中性糖類(解離常數(shù)PKa)在pH12 14的強(qiáng)堿溶液中即可以解離成弱酸根離子化狀態(tài)，因此在高PH值的淋洗液中它們部分或全部以陰離子形式存在，可以在陰離子交換柱上被保留并得到分離。聚合度相近的聚糖類組分的分子量彼此相近，分子結(jié)構(gòu)相同，在普通的色譜中容易形成共洗脫，難于實(shí)現(xiàn)高效分離，而在高效液相離子色譜系統(tǒng)中可根據(jù)它們不同的離解行為，通過梯度淋洗改變流動相的PH值，使之達(dá)到各種糖組分相應(yīng)的pK值從而實(shí)現(xiàn)有效的分離。同時(shí)，離子色譜法檢測糖所使用的金電極脈沖安培檢測器(PAD)，檢測的靈敏度可達(dá)到pmol / L糖，并且不需衍生反應(yīng)和復(fù)雜的樣品純化處理。因而，高效離子交換色譜相對于普通的高效液相色譜而言，更適宜于低聚糖類的分離和檢測。本發(fā)明的利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，正是基于上述的高效離子交換色譜法本身特點(diǎn)和糖類本身的性質(zhì)郵寄結(jié)合，將木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的標(biāo)準(zhǔn)品配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液后，在給定的高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件下測出木糖至木六糖的標(biāo)準(zhǔn)工作方程，然后將低聚木糖待測樣品在同樣的高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件下進(jìn)行測定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作方程換算獲得待測樣品的定量測定值。有益效果本發(fā)明的利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，與現(xiàn)有的木糖測定方法相比，具有的優(yōu)點(diǎn)包括首次建立了高效液相離子交換色譜精確定量測定低聚木糖的方法，采用Carbc^acTM PA200 (3X250m)色譜柱，通過醋酸鈉和氫氧化鈉二元梯度洗脫顯著提高了木糖及各種低聚木糖組分之間的分離度及檢測效率，實(shí)現(xiàn)對低聚木糖樣品，尤其是木二糖至木六糖組分的精確定量測定，及對木七糖和木八糖類糖組分的定性分析，對于低聚木糖產(chǎn)品的檢測評價(jià)和推廣應(yīng)用具有重要的意義。


圖1為木糖至木六糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相離子交換色譜測定的圖譜。圖中橫坐標(biāo)表示木糖和低聚木糖各種組分的保留時(shí)間RT (min)，縱坐標(biāo)表示電化學(xué)檢測器所檢測得到脈沖安培信號(nC)。圖2為木糖至木六糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜峰保留時(shí)間與它們的聚合度之間的線性關(guān)系，圖中橫坐標(biāo)表示木糖至木六糖的聚合度NDP，縱坐標(biāo)表示木糖至木六糖各種組分的色譜峰保留時(shí)間RT (min)0圖3為低聚木糖實(shí)際樣品的高效液相離子交換色譜測定的圖譜。圖中橫坐標(biāo)表示木糖和低聚木糖各種組分的保留時(shí)間RT (min)，縱坐標(biāo)表示電化學(xué)檢測器所檢測得到脈沖安培信號(nC)。圖4是木糖至木六糖高效液相離子交換色譜標(biāo)準(zhǔn)工作方程測定數(shù)據(jù)表。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明最進(jìn)一步的解釋。實(shí)施例1高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件
高效液相離子交換色譜系統(tǒng)美國Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，配備雙泵(DP) 內(nèi)置真空脫氣模塊、電化學(xué)檢測器(ED)和自動進(jìn)樣器(AS40)，色譜系統(tǒng)的運(yùn)行軟件采用 Chromeleon 6. 70色譜工作站，色譜條件色譜柱CarboPacTM PA200 (3X250m)色譜柱帶保護(hù)柱(3Χ50_)；柱溫30°C ；進(jìn)樣體積10. 0 μ L ；
淋洗條件以500 mmol/L醋酸鈉和lOOmmol/L氫氧化鈉為淋洗液進(jìn)行二元梯度淋洗， 流速為0. 3mL/min，在(T40min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為(Tl20 mmoL·信號檢測電化學(xué)檢測器檢測模式為金工作電極和pH-Ag/AgCl復(fù)合型參比電極， 采用積分和脈沖安培檢測法和色譜峰面積積分法測定木糖至木六糖的含量，木糖和低聚木糖組分測定的標(biāo)準(zhǔn)四電位波形如表1所示。表1木糖和低聚木糖組分測定的標(biāo)準(zhǔn)四電位波形
權(quán)利要求
1.一種利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件美國Dionex ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，采用CarboPacTM 4200 (3乂250111)色譜柱帶保護(hù)柱(3X5(toim)，柱溫30°C，自動上樣，進(jìn)樣體積10. O μ L ；以500mmol/L醋酸鈉禾口 IOOmmol/ L氫氧化鈉為淋洗液進(jìn)行二元梯度淋洗，流速為0. 3mL/min,在O 40min內(nèi)醋酸鈉溶液淋洗的濃度梯度為O 120mmol/L ；電化學(xué)檢測器檢測模式為金工作電極和pH_Ag/AgCl復(fù)合型參比電極，采用積分脈沖安培檢測法和色譜峰面積積分法測定糖組分的含量；(2)低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)工作方程的測定將木糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成0. 5 10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用步驟(1)中的色譜條件測定木糖至木六糖的標(biāo)準(zhǔn)工作方程和RT ；(3)木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間的確定以木糖至木六糖的NDP與步驟(2)測定的RT，進(jìn)行線性回歸計(jì)算出RT與NDP之間的線性關(guān)系式為RT (min)=2. 5785XNDP+1. 97 ，相關(guān)系數(shù)R2=O. 9952 ；由該線性關(guān)系式計(jì)算出木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間；(4)低聚木糖成分的分析與測定將低聚木糖待測樣品充分溶解于25 30°C的蒸餾水中，定容并調(diào)節(jié)待測低聚木糖組分的濃度1. O 8. Omg/L,在IOOOOrpm條件下離心5min后以0. 2 μ m微濾膜過濾上清液得樣品液，采用步驟(1)中的色譜條件進(jìn)行色譜檢測；采用步驟(2)和(3)進(jìn)行木二糖至木六糖的定量測定，及木七糖和木八糖的定性分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，其特征在于，步驟(2)中，所述的標(biāo)準(zhǔn)工作方程為木糖 A=3. 5218Cl - 0. 0193 ； 木二糖 A=3. 0798C2 - 0. 1026 ；木三夢IA=1.5199C3-0.0031木四IFIA=1.7209C4-0.1158木五IFIA=1.3676C5-0.1513木六夢IA=1.0952c6-0.1537上述標(biāo)準(zhǔn)工作方程中，A表示色譜峰面積(nC min)，c表示糖組分的濃度(mg/L)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，其特征在于，步驟(3)中，木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間分別為20. 02;3min和22. 60Imin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法。該方法包括高效液相離子交換色譜系統(tǒng)與色譜條件的確定、低聚木糖標(biāo)準(zhǔn)工作方程的測定、木七糖和木八糖的色譜保留時(shí)間確定和低聚木糖成分的分析與測定。本發(fā)明的利用高效液相離子交換色譜測定低聚木糖的方法，首次建立了高效液相離子交換色譜精確定量測定低聚木糖的方法，采用CarboPacTMPA200(3×250m)色譜柱，通過醋酸鈉和氫氧化鈉二元梯度洗脫顯著提高了木糖及各種低聚木糖組分之間的分離度及檢測效率，實(shí)現(xiàn)對低聚木糖樣品，尤其是木二糖至木六糖組分的精確定量測定，及對木七糖和木八糖類糖組分的定性分析，對于低聚木糖產(chǎn)品的檢測評價(jià)和推廣應(yīng)用具有重要的意義。
文檔編號G01N30/02GK102288688SQ201010570158
公開日2011年12月21日 申請日期2010年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月2日
發(fā)明者余世袁, 勇強(qiáng), 徐勇, 范麗 申請人:南京林業(yè)大學(xué)