專利名稱：一種抗重金屬鋅的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗重金屬鋅的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
隨著科技的進步和工業(yè)的發(fā)展，人們的生活水平有了很大的提高。但是在工業(yè)高 速發(fā)展的同時，也帶來了一系列環(huán)境問題。1931-1972年發(fā)生于日本富山縣神通川流域的 痛痛病和1953年發(fā)生于日本熊本縣水魚灣漁村的水俁病都是由食物受到重金屬污染引發(fā) 的，這些悲劇事件引發(fā)了人們對環(huán)境中重金屬污染的關(guān)注。什么是重金屬呢？重金屬系指密度4. 0以上約60種元素或密度在5. 0以上的45 種元素。環(huán)境污染方面所指的重金屬主要是指生物毒性顯著的汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷， 也包括具有一定毒性的金屬，如鋅、銅、鎳、錫等元素。重金屬不能被微生物降解為無害物， 它們在水體中富集起來，造成水體污染，最終危害人類身體健康。目前最引起人們注意的是 汞、鎘、鉻等。砷和錫是非金屬，但它們的毒性類似于重金屬，一般都算作重金屬。有些重金 屬元素是人體和其它生物體必需的元素，但是其濃度超過一定范圍就會引起中毒。許多重金屬屬于生命體必須的微量元素。一旦缺少某種或某幾種，就會使生命體 健康受到威脅。但無論必須元素還是有毒元素，人體對它的忍受都要有一定的限度，超過這 個限度后便會對生命造成危害。隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅猛發(fā)展，重金屬在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，人們在制造⑶P 和財富的同時，人為活動引起的環(huán)境污染也在加劇。其中鉛、汞、鎘污染最為劇烈。它通過 被浸透的土壤和生長在其上的植物，經(jīng)過食物鏈對動物和人體產(chǎn)生毒害作用。對重金屬的常規(guī)性檢測方法已經(jīng)有很多種，有些也已經(jīng)是非常成熟的技術(shù)，但因 為重金屬離子存在的范圍很廣，根據(jù)檢測精度、方便程度和檢測成本，每種技術(shù)都有它們的 局限性，同時還需合適的場所，因此都不利于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。建立更快速、更經(jīng)濟的免 疫分析法檢測汞離子是生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展的需要。鋅參與體內(nèi)200多種酶的合成和活化，是動物生長發(fā)育及維持正常生理機能所必 須的微量元素，對動物的生長發(fā)育、生產(chǎn)性能、繁殖和免疫功能等方面均有著重要的影響， 但攝入過量的鋅會導致機體代謝紊亂。肝臟、腎臟、胰臟、骨和心肌貯存鋅的能力較強。過 量的鋅是一種作用迅速的中樞神經(jīng)毒素，通過對神經(jīng)細胞的直接損害及對體內(nèi)各種物質(zhì)的 拮抗而影響腦功能。有報道鸚鵡因啃咬鍍鋅鐵絲制成的鳥籠而普遍出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。高鋅 還可明顯抑制紅細胞的免疫功能，造成雛雞肝、脾的結(jié)構(gòu)和功能受損(Cui HM, Zhao CY，Li DB, et al. Effect of high Zinc on immune function in chicken. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2005，36 (3) :240_245)。日糧鋅(ZnS04)添加為 1300mg/kg 時， 會導致雛鴨患白肌病，肌胃、小腸平滑肌、骨骼肌和心肌受損(Cui HM, Peng X, Fang J, et al.Studies on pathologyof Zinc toxicity in ducklings. Acta Veterinaria etZootechnica Sinica,2004,35(2) :217_221)?？傊亟饘偈且环N很危險的污染物。污染環(huán)境中存在的高濃度重金屬，對生物的生理活動能產(chǎn)生多種影響，使一些生物發(fā)生病害甚至死亡，最終使生態(tài)系統(tǒng)平衡被破壞、生態(tài)環(huán)境惡化。重金屬通過食物鏈可以在人體中積累，引起多種疾病甚至癌癥，而且危害還可 以遺傳到下一代。因此，痕量重金屬的定量分析在食品和環(huán)境檢測等方面都是非常重要的。 傳統(tǒng)的重金屬離子檢測方法主要有原子吸收光譜法(AtomicAbsorption Spectroscopy)、 紫外分光光度法(Ultra-violet Spectroscopy)、陽極溶出伏安法(Anodic Stripping Voltammeter)、示波極譜法(Oscillopolarography)和各種儀器聯(lián)用技術(shù)，如電感耦合等 離子體質(zhì)譜法(Inductively Coupled Plasma-MassSpectrometry)、電感耦合等離子體原 子發(fā)身寸光譜分析(Inductively CoupledPlasma-Atomic Emission Spectrometry)、氧化物 發(fā)生-原子吸收法(HydrideGeneration-Atomic Absorption Spectrometry)等。檢測儀器 昂貴，樣品要經(jīng)過濕法消解或微波消解，逐個測定單種重金屬濃度，測量精度雖可達到mg/ kg或更高，但檢測步驟繁瑣，檢測成本高，需耗時2天左右，難以適應(yīng)環(huán)境及市場產(chǎn)品的現(xiàn) 場抽查及產(chǎn)品進出口快速通關(guān)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供雜交瘤細胞株及其分泌的抗重金屬鋅的單克隆抗體。本發(fā)明所提供的雜交瘤細胞株為雜交瘤細胞株Z1A5，其保藏編號為CCTCC NO C200942。由雜交瘤細胞株Z1A5 CCTCC NO :C200942分泌得到的單克隆抗體也屬于本發(fā)明的 保護范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種抗原。本發(fā)明所提供的抗原是按照包括如下步驟的方法制備得到1)將可溶性鋅鹽溶液與螯合劑溶液混合，進行絡(luò)合反應(yīng)，得到鋅離子與螯合劑的 絡(luò)合物；2)在步驟1)的基礎(chǔ)上，再加入載體蛋白和偶聯(lián)緩沖液，進行偶聯(lián)反應(yīng)，得到載體 蛋白與所述絡(luò)合物的偶聯(lián)物，即為抗原。所述步驟1)中，所述可溶性鋅鹽與所述螯合劑的投料比滿足如下條件所述可溶 性鋅鹽中的Zn2+與所述螯合劑的投料的物質(zhì)的量比為1 1;所述步驟2)中，所述螯合劑與所述載體蛋白的投料比滿足如下條件所述螯合劑 與所述載體蛋白中的賴氨酸的投料的物質(zhì)的量的比為5 1。所述步驟1)中，所述絡(luò)合反應(yīng)在PH值為7. 4的條件下進行；所述步驟2)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)在pH值為9. O的條件下進行。所述步驟1)中，所述絡(luò)合反應(yīng)的溫度為25°C，所述絡(luò)合反應(yīng)的時間為10分鐘；所述步驟2)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度為25°C，所述偶聯(lián)反應(yīng)的時間為12小時。所述步驟1)中，所述螯合劑的分子式為C22H28N4OltlS · 3HC1 ；所述步驟1)中，所述可溶性鋅鹽溶液按照包括如下步驟的方法制備得到將鋅粉 溶于濃度為68% (體積百分含量)的HNO3水溶液中，且使鋅粉完全反應(yīng)，得到所述可溶性 鋅鹽溶液；所述步驟1)中，所述螯合劑溶液按照包括如下步驟的方法制備得到將所述螯合 劑加入到PH值為9. 73、濃度為1. 4165g/50mL的HEPES緩沖液中，得到所述螯合劑溶液；
所述步驟2)中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或匙孔血藍蛋白；所述步驟2)中，所述偶聯(lián)緩沖液為pH9. 73、濃度為1. 4165g/50mL的HEPES緩沖 液。本發(fā)明的另一個目的是提供一種不完全包被原。本發(fā)明所提供的不完全包被原，按照包括如下步驟的方法制備得到將螯合劑、載體蛋白和反應(yīng)緩沖液混合，在PH至9. 0、25°C的條件下反應(yīng)12小時，得到不完全包被原。上述不完全包被原中，所述反應(yīng)緩沖液為pH值為9. 73的HEPES緩沖液；上述不完全包被原中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白；上述不完全包被原中，所述螯合劑的分子式為C22H28N4OltlS · 3HC1 ；上述不完全包被原中，所述螯合劑與所述載體蛋白中的賴氨酸的投料的物質(zhì)的量 的比為5 1。上述單克隆抗體在檢測樣品中是否含有鋅中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述單克隆抗體在檢測樣品中鋅的含量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的抗重金屬鋅的單克隆抗體的效價高。利用本發(fā)明的抗體可以用于鋅離子 殘留的免疫學檢測。并利用其快速、廉價、靈敏和特異性強的優(yōu)點，發(fā)展便于現(xiàn)場檢測的便 攜方法，從而適用于農(nóng)畜產(chǎn)品的抽樣檢測及進出口通關(guān)的快速檢驗。對提高風險評估工作 的效率和質(zhì)量，保障食品安全有重要現(xiàn)實意義。


圖1為Zn螯合劑包被抗原的紫外掃描圖譜；圖2為Zn螯合劑免疫抗原的紫外掃描圖譜；圖3為細胞株Z1A5分泌抗體與p-SCN-Bn-DTPA結(jié)合系數(shù)測定結(jié)果；圖4為雜交瘤細胞株Z1A5分泌抗體的亞型；圖5為單克隆抗體效價的檢測；圖6為細胞株Z1A5分泌抗體特異性鑒定；圖7為Z1A5分泌抗體的穩(wěn)定性；圖 8 為 Zn-DTPA-BSA，DTPA-BSA 及載體蛋白 BSA 的 SDS-PAGE 電泳圖；圖 9 為 Zn-DTPA-KLH，載體蛋白 KLH 的 SDS-PAGE 電泳具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、抗原和不完全包被原的制備一、制備p-SCN-Bn-DTPA 購自美國 Macrocyclics，貨號為 B-305。產(chǎn)品名p-SCN-Bn-DTPA。英文名2~(4-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriaminepentaaceticacid別名:S-2-(4-Isothiocyanatobenzyl)-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid分子式=C22H28N4OltlS· 3HC1。
pH值為9. 73的HEPES緩沖液1. 4165g HEPES，去離子水溶解，用10mol/L的K0H 水溶液調(diào)PH至9. 73，去離子水定容至50mL，過濾除菌，4°C保存。濃度為1. 4165g/50mL。pH值為7. 4的HEPES緩沖液14. 165g HEPES，去離子水溶解，用10mol/L的K0H水 溶液調(diào)pH至7. 4，去離子水定容至500mL。濃度為1. 4165g/50mL。A液30mg鋅粉溶于200uL 68% (體積百分含量)的濃HN03水溶液中，得到濃度 為 150mg/mL 的 Zn(N03)2 溶液。B 液10. 668mg p-SCN-Bn-DTPA，加入 0. 4mL pH9. 73 的 HEPES 緩沖液，終濃度為 26.67mg/mL。C液20mg BSA溶于0. 4mL pH7. 4的HEPES緩沖液，得到濃度為50mg/mL的溶液。B1 液稱取 10mg p-SCN-Bn-DTPA 溶于 0. 6mL pH9. 73 的 HEPES 緩沖液，得到濃度 為16. 67mg/mL的溶液。C1液濃度為5. 9mg/mL的匙孔血藍蛋白(KLH)溶液；共1. 695mL。C1 液購自 Sigma，貨號H8283。中文名匙孔血藍蛋白(KLH)。產(chǎn)品英文名:Hemocyanin from Megathura crenulata(keyhole limpet)。1、Zn-DTPA-BSA 和 Zn-DTPA-KLH 的制備Zn-DTPA-BSA的制備(1)取0. 4mL的B液加入反應(yīng)器，再加入7 u LA液，在pH為 7. 4、室溫(25 °C)下反應(yīng)10分鐘，得到Zn-DTPA母液；(2)再向其中加入1.2mL pH9. 73 的HEPES緩沖液、C液0. 4mL,調(diào)節(jié)pH至9. 0，室溫(25 V )下攪拌，反應(yīng)12小時，得到 Zn-DTPA-BSA。步驟(1)中，Zn(N03)2中的Zn2+與p-SCN-Bn-DTPA的投料的物質(zhì)的量比為 1:1。步驟(2)中，p-SCN-Bn-DTPA與BSA中的賴氨酸的投料的物質(zhì)的量的比為5 1。Zn-DTPA-KLH (1)取0. 133mL的B1液加入反應(yīng)器，再加入A液7. 5 y L，在pH為 7. 4、室溫(25°C )下反應(yīng)10分鐘，得到Zn-DTPA母液；(2)再向其中加入0. 14mL pH9. 73 的HEPES緩沖液、C1液1. 695mL,調(diào)節(jié)pH至9. 0，室溫(25°C )下攪拌，反應(yīng)12小時。步驟 ⑴中，Zn(N03)2中的Zn2+與p-SCN-Bn-DTPA的投料的物質(zhì)的量比為1 1。步驟(2)中， p-SCN-Bn-DTPA與KLH中的賴氨酸的投料的物質(zhì)的量的比為5 1。CentriconYM-30超濾離心管預先用0. lmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)溶液浸泡 過夜，然后用PH9. 73的HEPES緩沖液充分沖洗。偶聯(lián)反應(yīng)后，用CentriconYM-30超濾離心 管對蛋白質(zhì)復合物進行分離純化，即用CentriconYM-30過濾除去沒有參與反應(yīng)的過量的 金屬離子Zn2+和螯合劑DTPA及Zn-DTPA，分離純化時先用pH9. 73的HEPES緩沖液洗滌超 濾管一次，再用PH7. 4的HEPES緩沖液洗滌兩次。2、DTPA_BSA 的制備DTPA-BSA的制備取0. 4mL的B液加入反應(yīng)器，再向其中加入1. 2mL pH9. 73的 HEPES緩沖液、C液0. 4mL,再加pH9. 73的HEPES緩沖液將調(diào)節(jié)pH至9. 0，室溫(25°C )下 攪拌，反應(yīng)12小時，得到DTPA-BSA。反應(yīng)中p-SCN-Bn-DTPA與BSA中的賴氨酸的投料的物 質(zhì)的量的比為5 1。分離純化步驟同步驟1。純化后所得的抗原分裝于-20°C保存，長期保存存于-80°C。二、抗原的鑒定
1、抗原的濃度測定參照BCA試劑盒步驟，用BCA法構(gòu)建濃度檢測標準曲線。蛋白濃度測定標準曲線 的繪制在聚苯乙烯微孔板上，分別將2mg/mL的BSA標準蛋白稀釋至濃度為1000 y g/mL、 500 u g/mL、250 u g/mL、125 u g/mL、25 u g/mL,0u g/mL。用 BCA 蛋白定量試劑盒測定 570nm 的光吸收值。以吸收值減去空白值得到的數(shù)值對BSA含量作圖，繪出標準曲線。KLH的標準 曲線繪制原理同BSA?？乖瓭舛鹊臏y定將分離純化后的抗原樣品適當稀釋，用BCA蛋白定 量試劑盒測定570nm的光吸收值，通過標準曲線計算樣品溶液中抗原濃度。結(jié)果表明，利用BCA法檢測分離純化后的的Zn-DTPA-BSA、Zn-DTPA-KLH、DTPA-BSA 中蛋白的實際濃度依次為 25. 155 士 0. 038mg/mL，4. 195 士 0. 014mg/mL，9. 242 士 0. 015mg/ mL(見表1)。表1. BCA法檢測抗原中蛋白濃度
權(quán)利要求
雜交瘤細胞株Z1A5，其保藏編號為CCTCC NOC200942。
2.由雜交瘤細胞株Z1A5CCTCC NO :C200942分泌得到的單克隆抗體。
3.—種抗原，按照包括如下步驟的方法制備得到1)將可溶性鋅鹽溶液與螯合劑溶液混合，進行絡(luò)合反應(yīng)，得到鋅離子與螯合劑的絡(luò)合物；2)在步驟1)的基礎(chǔ)上，再加入載體蛋白和偶聯(lián)緩沖液，進行偶聯(lián)反應(yīng)，得到載體蛋白 與所述絡(luò)合物的偶聯(lián)物，即為抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗原，其特征在于所述步驟1)中，所述可溶性鋅鹽與所述螯合劑的投料比滿足如下條件所述可溶性鋅 鹽中的Zn2+與所述螯合劑的投料的物質(zhì)的量比為1 1;所述步驟2)中，所述螯合劑與所述載體蛋白的投料比滿足如下條件所述螯合劑與所 述載體蛋白中的賴氨酸的投料的物質(zhì)的量的比為5 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的抗原，其特征在于所述步驟1)中，所述絡(luò)合反應(yīng)在PH值為7. 4的條件下進行； 所述步驟2)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)在pH值為9. 0的條件下進行。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的抗原，其特征在于所述步驟1)中，所述絡(luò)合反應(yīng)的溫度為25°C，所述絡(luò)合反應(yīng)的時間為10分鐘； 所述步驟2)中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的溫度為25°C，所述偶聯(lián)反應(yīng)的時間為12小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的抗原，其特征在于所述步驟1)中，所述螯合劑的分子式為C22H28N401(iS 3HC1 ；所述步驟1)中，所述可溶性鋅鹽溶液按照包括如下步驟的方法制備得到將鋅粉溶于 濃度為68% (體積百分含量)的HN03水溶液中，且使鋅粉完全反應(yīng)，得到所述可溶性鋅鹽 溶液；所述步驟1)中，所述螯合劑溶液按照包括如下步驟的方法制備得到將所述螯合劑加 入到PH值為9. 73、濃度為1. 4165g/50mL的HEPES緩沖液中，得到所述螯合劑溶液； 所述步驟2)中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或匙孔血藍蛋白； 所述步驟2)中，所述偶聯(lián)緩沖液為pH9. 73、濃度為1. 4165g/50mL的HEPES緩沖液。
8.一種不完全包被原，按照包括如下步驟的方法制備得到將螯合劑、載體蛋白和反 應(yīng)緩沖液混合，在pH至9.0、25°C的條件下反應(yīng)12小時，得到不完全包被原。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的不完全包被原，其特征在于所述反應(yīng)緩沖液為pH9.73、濃度 為 1. 4165g/50mL 的 HEPES 緩沖液；和/或，所述載體蛋白為牛血清白蛋白； 和/或，所述螯合劑的分子式為C22H28N401QS 3HC1 ；和/或，所述螯合劑與所述載體蛋白中的賴氨酸的投料的物質(zhì)的量的比為5 1。
10.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在檢測樣品中是否含有鋅中的應(yīng)用；權(quán)利要求2所述 單克隆抗體在檢測樣品中鋅的含量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗重金屬鋅的單克隆抗體。該單克隆抗體是由雜交瘤細胞株Z1A5 CCTCC NOC200942分泌得到的。本發(fā)明的抗重金屬鋅的單克隆抗體的效價高。利用本發(fā)明的抗體可以用于鋅離子殘留的免疫學檢測。并利用其快速、廉價、靈敏和特異性強的優(yōu)點，發(fā)展便于現(xiàn)場檢測的便攜方法，從而適用于農(nóng)畜產(chǎn)品的抽樣檢測及進出口通關(guān)的快速檢驗。對提高風險評估工作的效率和質(zhì)量，保障食品安全有重要現(xiàn)實意義。
文檔編號G01N33/577GK101979511SQ201010533200
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者劉丹, 李霞, 楊慧, 趙麗 申請人:北京市農(nóng)林科學院