專利名稱：一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食用菌種的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是是一種系統(tǒng)、簡便與高效的斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，包括所需原料、配方、滅菌、接種、培養(yǎng)、光譜分析、整合定量評價這一系列過程。
背景技術(shù)：
菌種質(zhì)量是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本。然而，隨著我國食用菌產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展，菌種質(zhì)量問題日益突出，漸已成為阻礙我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。近年來，我國食用菌菌種質(zhì)量監(jiān)管體系與質(zhì)量控制體系建設(shè)不斷完善，為規(guī)范食用菌菌種選育、生產(chǎn)、經(jīng)營與管理等工作提供了日漸有力的制度保障。然而，相應(yīng)科研工作依然較為薄弱，基礎(chǔ)與應(yīng)用研究尚難以滿足行業(yè)發(fā)展要求，從而使得菌種質(zhì)量評價缺乏系統(tǒng)的技術(shù)支撐。因此，開發(fā)科學(xué)、規(guī)范、有效的食用菌菌種質(zhì)量評價方法，是我國食用菌業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的必然要求。斑玉蕈肉厚質(zhì)嫩，味純鮮香，具頗高的食用價值。同時，斑玉蕈富含17種氨基酸， 尤以賴氨酸及精氨酸含量最高，對嬰幼兒童以至青少年的智力發(fā)育均具一定的促進(jìn)作用。 此外，斑玉蕈亦含有多酚類、多糖類物質(zhì)，具有清除人體內(nèi)自由基、提高人體免疫力等功效。斑玉蕈是已經(jīng)實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)的主要食用菌之一，是我國能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的重要食用菌之一，2008年產(chǎn)量已達(dá)10585t，在工業(yè)化生產(chǎn)的食用菌中產(chǎn)量僅次于金針菇與杏鮑菇。然而，其生育周期約為105d，較金針菇與杏鮑菇分別延長65d與45d。因此，對系統(tǒng)、簡便、有效的斑玉蕈菌種質(zhì)量評價方法的需求愈顯迫切。目前，對于菌種質(zhì)量的評價，以結(jié)實性試驗方法最具說服力，然而此方法存在周期長、易受環(huán)境因素與人為因素影響等缺點。對廣大斑玉蕈生產(chǎn)企業(yè)及個體經(jīng)營者而言，時間即是效益，時間即是競爭力。因此，以實踐生產(chǎn)角度衡量，此法存有頗大局限性。近年來，同工酶、RAPD、RFLP等分子生物學(xué)技術(shù)在食用菌科研領(lǐng)域中得到逐步應(yīng)用，然而，上述方法在評價的準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)性、可操作性、尤其是可預(yù)判性等方面依然不盡理想。因此，亟需構(gòu)建一種系統(tǒng)、簡便、有效的斑玉蕈菌種質(zhì)量評價方法，通過評價斑玉蕈菌種質(zhì)量的預(yù)判性指標(biāo)，來評價斑玉蕈菌種質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種改進(jìn)的斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，即系統(tǒng)、簡便、有效的斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的監(jiān)測方法，它可克服既有方法準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)性、可操作性較差等一些不足。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法， 其特征在于所述的評價方法包括如下步驟a、采集菌種菌絲體；b、取去皮馬鈴薯200g，煮沸浸汁，去渣，加水定容至1L，在上述馬鈴薯溶液中加入營養(yǎng)原料形成培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)基質(zhì)的pH為7. 0 ；C、在實驗瓶中放入60-80mL的評價用培養(yǎng)基質(zhì)，再接種0. 8-1. 5cm2菌種菌絲體，于25°C溫度條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)；d、培養(yǎng)7-8d或靜置培養(yǎng)14-16d后提取培養(yǎng)液，然后進(jìn)行可見光譜分析，獲取脫色率的數(shù)值；e、對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價，安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選。使用時本發(fā)明方法的使菌種質(zhì)量評價結(jié)果同單瓶產(chǎn)量、有效子實體數(shù)與單個子實體重量等產(chǎn)量性狀間相關(guān)性達(dá)極顯著水平，同試管栽培培養(yǎng)基中菌絲生長速度相關(guān)性達(dá)一般顯著水平，可用于對上述指標(biāo)的單獨評價。同時，以上述各評價指標(biāo)為組成部分，首次通過此評價方法對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價，實現(xiàn)了對斑玉蕈菌種質(zhì)量的系統(tǒng)、簡便與高效評價。此外，此評價方法為其它食用菌菌種質(zhì)量的評價提供了有力的參考。


圖1為本發(fā)明的評價方法步驟流程圖
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。本發(fā)明所述的評價方法包括如下步驟a、采集菌種菌絲體；b、取去皮馬鈴薯 200g,煮沸浸汁，去渣，加水定容至1L，在上述馬鈴薯溶液中加入營養(yǎng)原料形成培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)基質(zhì)的pH為7. 0 ；C、在實驗瓶中放入60-80mL的評價用培養(yǎng)基質(zhì)，再接種0. 8-1. 5cm2菌種菌絲體，于25°C溫度條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)；d、培養(yǎng)7-8d或靜置培養(yǎng)14-16d后提取培養(yǎng)液，然后進(jìn)行可見光譜分析，獲取脫色率的數(shù)值；e、對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價， 安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選。a步驟中，待評價的菌種菌絲體采用商業(yè)化生產(chǎn)條件下的各級菌種菌絲體、菌種選育條件下的出發(fā)菌株或各衍生菌株菌絲體，或者組織分離獲得的斑玉蕈菌種純培養(yǎng)物。b步驟中，每升馬鈴薯溶液中加入下列營養(yǎng)原料 20. 0 克乳糖、2. 0 克 ΝΗ4Ν03、0· 5 克 MgSO4 ·7Η20、1· 5 克 KH2PO4 和 0. 06 克溴百里酚蘭(BTB)， 充分混合后形成培養(yǎng)基質(zhì)。c步驟中，培養(yǎng)基質(zhì)在121 °C、150KPa條件下高壓滅菌后，待瓶體完全冷卻，在容量為IOOmL的三角實驗瓶內(nèi)加入60-80mL評價用培養(yǎng)基質(zhì)，將a步驟中采取的待評價的菌種菌絲體置于勻漿器中，勻漿30s后取1. Ocm2菌種菌絲體接種入三角實驗瓶內(nèi)，進(jìn)行液體培養(yǎng)。d步驟中，提取培養(yǎng)液500 μ 1，置于Eppendorf centrifuge 5810R離心機中離心(5000rpm，4°C，15min)，移取 2. 0μ 1 上清液，滴注于 NanoDrop 10003. 6. 0 光譜分析系統(tǒng)中，全波段掃描分析后，由系統(tǒng)自動采集615nm處吸收峰值數(shù)據(jù)，并導(dǎo)入脫色率 (Decolorization Ratio) ^M-Tj ^ :DR= [I" (A615 of strain/A615 of blank) ] X 100 (DR L^l 百分?jǐn)?shù)表示)，獲得脫色率數(shù)值。e步驟中，將脫色率(DR)值導(dǎo)入脫色率與菌種質(zhì)量加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)擬合方程Ydk =-221. 26X2+490. 75X-210. 75，以數(shù)值的形式對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價，并安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選，加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值越趨近1，指示菌種質(zhì)量越好；當(dāng)數(shù)值小于0.9時，即應(yīng)慎用或棄用；越趨近0，指示菌種質(zhì)量越差。觀察液體培養(yǎng)基顏色的變化黃色一黃綠一綠色一藍(lán)綠一藍(lán)色，為菌種質(zhì)量由優(yōu)至劣，將顯色反應(yīng)對應(yīng)數(shù)值導(dǎo)入顯色反應(yīng)與菌種質(zhì)量加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)擬合方程Yai = 7. 7379X-1. 7118，即可對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行評價，并安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選，加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值越趨近5，指示菌種質(zhì)量越好；當(dāng)數(shù)值小于5時，即應(yīng)慎用或棄用；數(shù)值越趨近1，指示菌種質(zhì)量越差。 需要強調(diào)的是，在進(jìn)行斑玉蕈菌種質(zhì)量評價過程中，DR值評價適用于條件較好，對評價結(jié)果要求較高的菌種生產(chǎn)部門或大中型斑玉蕈工業(yè)化生產(chǎn)企業(yè)；而顯色反應(yīng)評價較適于條件相對有限，對評價結(jié)果要求相對較低的斑玉蕈菌種或商業(yè)化生產(chǎn)單位或個人。
實施例本發(fā)明首先針對待評價菌種建立基準(zhǔn)參數(shù)，測定培養(yǎng)液顯色反應(yīng)與吸光度值；以上述參數(shù)為基準(zhǔn)，對待評價菌種進(jìn)行整合定量評價。本發(fā)明實施例依照以下四步進(jìn)行。1.待評價菌種待評價斑玉蕈菌株見表1，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建斑玉蕈菌種質(zhì)量整合定量評價標(biāo)準(zhǔn)體系。表1供試真姬菇菌株
權(quán)利要求
1.一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于所述的評價方法包括如下步驟a、采集菌種菌絲體；b、取去皮馬鈴薯200g，煮沸浸汁，去渣，加水定容至1L，在上述馬鈴薯溶液中加入營養(yǎng)原料形成培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)基質(zhì)的pH為7. 0 ；C、在實驗瓶中放入60-80mL 的評價用培養(yǎng)基質(zhì)，再接種0. 8-1. 5cm2菌種菌絲體，于25°C溫度條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)；d、 培養(yǎng)7-8d或靜置培養(yǎng)14-16d后提取培養(yǎng)液，然后進(jìn)行可見光譜分析，獲取脫色率的數(shù)值； e、對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價，安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于a步驟中，待評價的菌種菌絲體采用商業(yè)化生產(chǎn)條件下的各級菌種菌絲體、菌種選育條件下的出發(fā)菌株或各衍生菌株菌絲體，或者組織分離獲得的斑玉蕈菌種純培養(yǎng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于b步驟中，每升馬鈴薯溶液中加入下列營養(yǎng)原料20. 0克乳糖、2. 0克ΝΗ4Ν03、0. 5克MgSO4 · 7H20、 1. 5克KH2PO4和0. 06克溴百里酚蘭(BTB)，充分混合后形成培養(yǎng)基質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于c步驟中，培養(yǎng)基質(zhì)在121°C、150Iffa條件下高壓滅菌后，待瓶體完全冷卻，在容量為IOOmL的三角實驗瓶內(nèi)加入60-80mL評價用培養(yǎng)基質(zhì)，將a步驟中采取的待評價的菌種菌絲體置于勻漿器中，勻漿30s后取0. 8-1. 5cm2菌種菌絲體接種入三角實驗瓶內(nèi)，進(jìn)行液體培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于d步驟中，提取培養(yǎng)液 500 μ 1，置于 Eppendorf centrifuge5810R 離心機中離心(5000rpm，4°C， 15min)，移取2. 0 μ 1上清液，滴注于NanoDrop 10003. 6. 0光譜分析系統(tǒng)中，全波段掃描分析后，由系統(tǒng)自動采集615nm處吸收峰值數(shù)據(jù)，并導(dǎo)入脫色率(DecolorizationRatio)換算方程DR= [1-(A615 of strain/A615 of blank) ] X 100 (DR 以百分?jǐn)?shù)表示)，獲得脫色率數(shù)值。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于e步驟中，將脫色率(DR)值導(dǎo)入脫色率與菌種質(zhì)量加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)擬合方程^ik =-221. 26X2+490. 75X-210. 75，以數(shù)值的形式對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價，并安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選，加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值越趨近1，指示菌種質(zhì)量越好；當(dāng)數(shù)值小于0.9時，即應(yīng)慎用或棄用；越趨近0，指示菌種質(zhì)量越差。7、根據(jù)權(quán)利要求1 所述的一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，其特征在于:e步驟中，觀察液體培養(yǎng)基顏色的變化黃色一黃綠一綠色一藍(lán)綠一藍(lán)色，為菌種質(zhì)量由優(yōu)至劣，將顯色反應(yīng)對應(yīng)數(shù)值導(dǎo)入顯色反應(yīng)與菌種質(zhì)量加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)擬合方程Yai = 7. 7379X-1. 7118，即可對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行評價，并安照評價結(jié)果對菌種菌絲體進(jìn)行質(zhì)量優(yōu)劣的篩選，加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值越趨近 5，指示菌種質(zhì)量越好；當(dāng)數(shù)值小于5時，即應(yīng)慎用或棄用；數(shù)值越趨近1，指示菌種質(zhì)量越差。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種斑玉蕈菌種質(zhì)量優(yōu)劣的檢測方法，它可克服既有食用菌菌種質(zhì)量評價方法所難以克服的系統(tǒng)性、簡便性與高效性等問題。本發(fā)明使評價結(jié)果同單瓶產(chǎn)量、有效子實體數(shù)與單個子實體重量等產(chǎn)量性狀間相關(guān)性達(dá)極顯著水平，同試管栽培培養(yǎng)基中菌絲生長速度相關(guān)性達(dá)一般顯著水平，就此可通過此法對上述菌種質(zhì)量評價指標(biāo)進(jìn)行單獨評價。同時，以上述各評價指標(biāo)為組成部分，首次通過此評價方法對斑玉蕈菌種質(zhì)量進(jìn)行整合定量評價，實現(xiàn)了對斑玉蕈菌種質(zhì)量的系統(tǒng)、簡便與高效評價。此外，此評價方法為其它食用菌菌種質(zhì)量的整合定量評價提供了有力參考。
文檔編號G01N21/25GK102405762SQ201010292360
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者馮志勇, 劉洋, 汪虹, 陳明杰, 陳輝 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院