專利名稱：人乳頭瘤58型病毒l1蛋白的線性抗原表位最小基序肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥與生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及導(dǎo)致婦女宮頸癌發(fā)生的高危 型人乳頭瘤病毒(HPV) 58型主要衣殼蛋白Ll的全部線性B細(xì)胞表位(B cell epitope, BCE,或稱抗原表位或決定簇)及其最小基序肽，以及這些表位基序肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化學(xué)合成肽疫苗，曾被期待能成為人類應(yīng)用疫苗發(fā)展史上繼滅活病毒疫苗和病毒 亞單位疫苗之后的第三個(gè)里程碑。但一或二個(gè)表位組成的預(yù)防性合成肽疫苗研制，由于都 缺乏充分有效的保護(hù)作用，從70年代起至今未有一例被批準(zhǔn)人臨床應(yīng)用。因此，為達(dá)到符 合人臨床應(yīng)用充分的保護(hù)有效性，合成肽疫苗原應(yīng)組合盡可能多的線性抗原表位不言而喻 (可通過生物工程制備多表位肽免疫原)。另外，作為病毒感染的血清抗體檢測用抗原，由 于天然病毒蛋白等稀有抗原的不可獲得性，一般都使用15-20肽的單表位肽。已知線性抗 原表位通常由3-8肽組成，因而長表位肽上也可能存在能被含成千上萬不明抗體的正常人 血清識別的其他抗原表位，進(jìn)而不可避免地易產(chǎn)生有時(shí)甚至很高的假陽性檢測結(jié)果。為了 提高病毒感染檢測用表位肽抗原的特異性和靈敏度，研制組合一個(gè)或蛋白家族中多個(gè)靶抗 原上盡可能多的線性表位，特別是基于它們最小基序的表位肽檢測抗原顯然也無疑是今后 研制的一個(gè)新方向。因?yàn)橐粋€(gè)抗原的免疫應(yīng)答必然產(chǎn)生抗其蛋白上全部或絕大多數(shù)表位 抗體，所以通過并用多個(gè)特異表位抗原而富集檢測多種特異抗體，勢必將成幾何級數(shù)(1 χ 2η，η=表位數(shù))地大大提高檢測靈敏度。顯而易見，多表位肽疫苗或檢測用抗原這方面研究 能否取得突破性進(jìn)展，乃取決于一靶抗原上全部線性抗原表位及其最小基序的鑒定。大量研究資料證明，子宮頸癌在全球女性癌癥死亡率中位居第二，其中90%與高 危型諸如HPV16、18、31和45型等人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)生殖 MJli^ii^^^c(Tovar JM, et al. Human papillomavirus, cervical cancer, and the vaccine. Postgrad Med, 120: 79-84，2008)。目前美國 Merck 和英國 GlaxoSmithKline (GSK) 二家公司已分別開發(fā)了由HPV6、11、16和18型Ll蛋白以及由HPV16 和18型Ll蛋白構(gòu)成的預(yù)防性HPV疫苗。相關(guān)HPV多肽疫苗的研究也很多，但尚無成功上 市的報(bào)道。鑒于大多數(shù)HPV感染者一般都可以自發(fā)清除感染HPV病毒，而只有持續(xù)性HPV 感染才會導(dǎo)致子宮頸癌這一事實(shí)，開發(fā)價(jià)廉且方便實(shí)施的HPV感染血清學(xué)檢測Kit尤為重 要，因?yàn)檫@一篩查可以確定需要進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性HPV疫苗接種對象以及確定接種 何種特異HPV型疫苗，其意義不言而喻。但由于之前抗原表位鑒定方法學(xué)的限制，即無法鑒 定出一靶蛋白上全部線性抗原表位，特別是最小基序(可提高這一檢測的準(zhǔn)確率，即可避免 與正常人血清中成千上萬不明抗原抗體發(fā)生交叉反應(yīng))，至今尚無特異靈敏的HPV感染的血 清學(xué)檢測方法，盡管早期也有許多利用HPV感染者血清以圖發(fā)現(xiàn)HPV感染血清學(xué)檢測特異 標(biāo)志物(Dillner J, et al. Int J Cancer, 45: 529—535，1990; Dillner J, et al. Int J Cancer, 46: 703-711， 1990; Bleul C, et al. J Clin Microbiol, 29: 1579-1588，
41991; Jenison S, et al. J Virol, 65: 1208-1218， 1991)。HPV58也是緊隨16和18型之后的高危型HPV病毒之一(Lungu 0，et al. Obstet Gynecol, 47: 337-342，1995)。最近的研究資料也表明HPV58型在我國江西、上海、河北、 山西、陜西、北京、香港和臺灣等地區(qū)等子宮頸癌患者中的檢出陽性率相當(dāng)高(Lin QQ, et al. Int J Cancer, 75: 484-485， 1998; Huang S, et al. Int J Cancer, 70: 408-411， 1997; Cai HB, et al. Oncol, 76: 157-161， 2009; Dai Μ, et al. Br J Cencer, 95: 96-101, 2006;高艷娥等.中華腫瘤雜志，26: 543-546，2004; Zhao R, et al. Br J Cancer, 101: 1635—1640， 2009; Lai HC, et al. Int J Cancer, 84: 553—557， 1999; Chan PK, et al. J Med Virol, 59: 232-238， 1999; Bao YP, et al. Int J STD AIDS, 19: 106-111，2008)，有的地區(qū)檢出率甚至僅次于HPV16型，高于HPV18型(李潔等.中華 實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，10: 50-55，1996;劉寶印等.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志， 10: 118-121， 1996)。鑒于以上所述高危型HPV58在我國許多地區(qū)高流行性，以及HPV疫苗和檢測標(biāo)志 性表位肽研制和國內(nèi)外尚未開展HPV58型Ll蛋白線性抗原表位鑒定研究的現(xiàn)狀，為了研制 具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的預(yù)防性HPV58型多表位肽疫苗和/或HPV58型感染多表位肽檢測 抗原，我們用大腸桿菌表達(dá)HPV58型LlN端或LlC端蛋白(兩者相互重疊8個(gè)氨基酸殘基) 并制備了兔抗重組LlN和LlC蛋白抗血清，結(jié)合采用申請人改良的生物合成肽策略(Xu，et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein—4 using peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009)，對HPV58 型Ll衣殼蛋白進(jìn)行了完整且精細(xì)的線性抗原表位掃描作圖定位。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供人乳頭瘤病毒(HPV)58型Ll蛋白的抗原表位最小基序肽， 并提供含有所述最小基序肽的短肽，同時(shí)提供含所述基序肽的應(yīng)用。本發(fā)明提供的人乳頭瘤58型病毒Ll蛋白上最小基序肽，共有16個(gè)。所述最 小基序肽具有SEQ. ID No. 1所示氨基酸序列，記為HPV58L1-138—43 ;或者具有SEQ. ID N0.2所示氨基酸序列，記為HPV58L1-21°H12;或者具有SEQ. ID No. 3所示氨基酸序列， 記為HPV58L1-3 154—157 ;或者具有 SEQ. ID No. 4所示氨基酸序列，記為HPV58Ll-42°8_211 ； 或者具有SEQ. ID No. 5所示氨基酸序列，記為HPV58L1-5213—217;或者具有SEQ. ID No. 6 所示氨基酸序列，記為HPV58L1-6222—227 ;或者具有SEQ. ID No. 7所示氨基酸序列，記為 HPV58L1-7228—231 ；或者具有SEQ. ID No. 8所示氨基酸序列，記為HPV58L1-8236—242 ；或者 具有SEQ. ID N0.9所示氨基酸序列，記為HPV58Ll-9245-249 ;或者具有SEQ. ID No. 10所 示氨基酸序列，記為HPV58L1-10298-3(I1;或者具有SEQ. ID No. 11所示氨基酸序列，記為 HPV58L1-1 1331—335 ；或者具有 SEQ. ID No. 12 所示氨基酸序列，記為 HPV58L1-12378—381 ；或者 具有SEQ. ID No. 13所示氨基酸序列，記為HPV58L1-13383—388 ；或者具有SEQ. ID No. 14 所示氨基酸序列，記為HPV58L1-14462—465 ；或者具有SEQ. ID No. 15所示氨基酸序列，記為 HPV58L1-15500"506 ；或者具有 SEQ. ID No. 16 所示氨基酸序列，記為 HPV58L1-165°8_51°。本發(fā)明提供的分別含有上述最小表位基序肽的短肽，具有SEQ. ID No. 17所示氨 基酸序列，記為L1-1，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或用其他殘基替代X編號殘基；或 者
具有SEQ. ID No. 18所示氨基酸序列，記為L1-2，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 19所示氨基酸序列，記為L1-3，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 20所示氨基酸序列，記為L1-4，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 21所示氨基酸序列，記為L1-5，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 22所示氨基酸序列，記為L1-6，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 23所示氨基酸序列，記為L1-7，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 24所示氨基酸序列，記為L1-8，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 25所示氨基酸序列，記為L1-9，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨 基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或 用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No.26所示氨基酸序列，記為L1-10，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定 氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No.27所示氨基酸序列，記為L1-11，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定 氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No.28所示氨基酸序列，記為L1-12，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定 氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No.29所示氨基酸序列，記為L1-13，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定 氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No.30所示氨基酸序列，記為L1-14，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No. 31所示氨基酸序列，記為L1-15，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定 氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基；或者
具有SEQ. ID No.32所示氨基酸序列，記為L1-16，其序列中帶有下標(biāo)X編號代表特定 氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除， 或用其他殘基替代X編號殘基。本發(fā)明提供的人乳頭瘤病毒(HPV)58型Ll蛋白上申請人第一次鑒定的16個(gè)BCE 肽的最小基序，以及它們可化學(xué)合成或與GST載體蛋白融合表達(dá)的含各BCE最小基序8肽 或長于8肽抗原。前者可單個(gè)或組合用作設(shè)計(jì)研制治療性HPV多表位疫苗的抗原肽，后者 8肽或其融合蛋白可用于普查正常婦女或子宮頸癌患者血清中是否存在抗HPV58L1抗體的 檢測抗原。特別是HPV58L1-1 表位最小基序 38_43(YLPPVP)與 HpvieLl38-4^HpvSlLl12-1In HPV33L112-17, HPV58L1-3 基序肌-112 (PNKFGF)與 HPV31L181-86 和 HPV73L178-83，HPV58L1-3 基 序 154_157 (DDTE)與 HPV16L1153-156、HPV18L1188-191、HPV30L1134-137、HPV31L1128_131、HPV33L1128-131、 HPV39L112"30 和 HPV73L112h28，HPV58L1-6 基序 222-227(EDGDMV)與 HPV18L125卜262、HPV33L1196-201 和 HPV45L1223-228，HPV58L1-7 基序 228-231 (DTGF)與 HPV31L12CI3-2CI6、HPV33L1202"205 和低危 型 HPV6bLl198_2(l1，HPV58L1-9 基序 24^249 (DVPID)與 HPV33L1219—223、HPV73L1217—221 和低危型 HPV6bLl215-2Q9，HPV58Ll-10 基序 298_3(l1 (PDDL)與 HPV16L1298-3(I1、HPV33L1272-275 和 HPV73L127°_273， HPV58L1-11 基序 331-335 (QLFNK)與 HPV18L13.371、HPV30L1312-316、HPV33L1305"310, HPV45L1334-339 和低危型 HPVebLl3 ，HPV58L1-14 基序 462^465 (KEDP)與 HPV30L1443—446、HPV31L1438—441 和 HPV33L1436—439，以及 HPV58L1-16 基序 508^510(SAP)與 HPV18L1548-550、HPV30L嚴(yán)-一-艦 和HPV31L1487_489的序列之間是100%保守的，也就是說用以上基序短肽構(gòu)建的多表位 肽疫苗對上述提及的高危型HPVs都有一定程度的交叉抗感染保護(hù)作用。而HPV58L1-4 (ATDC208"211 )> -5 (PLELF213-217)、-8 (FGTLQAM236-242 )、-12 (GTYK378-381 )、-13 (DNFKEY383"388) 和-15 (KAKPRLK5°°_5°6)是HPV58L1蛋白特異表位，可單獨(dú)和/或組合用作HPV58型特異感 染的血清學(xué)檢測表位肽標(biāo)志物。本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)一步具體描述如下
1，HPV58 型病毒基因組克隆(Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427，1991)市購。用常規(guī)PCR方法從購得的HPV58型病毒基 因組中擴(kuò)增出全長HPV58型Ll的編碼cDNA的N端和C端兩個(gè)片段(LlN和L1C)，然后重組 插入pRSET C融合表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)而純化在大腸桿菌中熱誘導(dǎo)表達(dá)的重組L1N36_233和L1C226_524 蛋白，最后主動免疫新西蘭白兔獲得兔抗重組HPV58L1N和LlC蛋白抗血清。2，先前申請人已構(gòu)建了專門用于抗原表位掃描作圖的短肽生物合成的PXXGST-I 融合表達(dá)質(zhì)粒(Xu et al. J Reprod Immunol, 81: 9-16, 2009)，其大分子蛋白載體是 截?cái)嗟挠?88個(gè)氨基酸殘基組成的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GST, GST188)。因此，首先運(yùn)用DNA重組技術(shù)(化學(xué)合成編碼DNA正負(fù)鏈片段經(jīng)退火復(fù)性，重組插 入表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)宿主菌，重組克隆測序驗(yàn)證插入片段DNA序列，以及 熱誘導(dǎo)表達(dá)目的GST-18肽融合蛋白等步驟)，表達(dá)了跨越LlN蛋白36_233序列相互重疊10個(gè)
7氨基酸殘基的系列24個(gè)18肽(編號Pl P24，最后1個(gè)P24為15肽)-GST融合蛋白， 以及跨越LlC蛋白226_524序列的36個(gè)系列18肽-GST融合蛋白(編號P25 P60，最后1個(gè) P60為19肽)。表達(dá)短肽融合蛋白(P1-P60)轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜上后，用兔抗重組HPV58L1N 和LlC蛋白多抗對Ll蛋白進(jìn)行表位掃描作圖，分別鑒定出LlN蛋白上的10個(gè)和LlC蛋白 上 13 個(gè)印跡反應(yīng)陽性 BCE 表位肽(PI, P9-P10, P14-P16, P21-P24 以及 P25-P27, P33-P34, P 37-P38, P43-P44, P53-P54 和 P59-P60)(圖 1)。進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)了以GST188為載體的跨越LlN的Pl (P61-P71)、P9 (P72-P82)、 P14-P15-P16(P83-P103,),P22 (P104_P114)，P24 (P115-P122),P25-P26(P123-P138), P27 (P139-P149),P33(P150-160),P37(P161-P171), P43-P44(P172-P190)，P47(P191-P201)， P53-P54 (P202-P217)和P59-P60 (P218-P237)序列相互重疊7個(gè)殘基的系列融合表達(dá)8 肽(印跡陽性18肽相鄰片段一般先合成它們中一個(gè)系列11個(gè)8肽編碼片段進(jìn)行印跡鑒定， 如果兩個(gè)相鄰片段非共享一個(gè)表位最小基序，再依據(jù)其左或右18肽片段合成其去除相互 重疊三個(gè)8肽片段的5/8個(gè)片段，最終統(tǒng)一編號為P61-P237)，繼而用兔抗重組L1N/L1C多 抗對各系列八肽融合蛋白進(jìn)行最小基序鑒定。結(jié)果根據(jù)各表位肽印跡反應(yīng)陽性8肽之間共 同的氨基酸序列，確定了 Ll蛋白上共16個(gè)表位最小基序。在所鑒定的23個(gè)18肽陽性片 段中，有的如Pl僅含1個(gè)表位(YLPPVP38_43)，有的如P9和PlO共享1個(gè)表位(PNKFGF1OT_112)， 有的如P59含獨(dú)有1個(gè)表位(KAKPRLK5°°_5°6)并與P60共享1個(gè)表位(SAP5°8_51°)，有的如P25 分別與P24和P26各共享1個(gè)表位(DTGF228_231和FGTLQAM236_242 )。圖2顯示了 P27印跡陽性 18肽的11個(gè)系列8肽的最小基序鑒定結(jié)果。以上HPV58型Ll蛋白16個(gè)表位肽最小基序的鑒定表明，本發(fā)明所述的HPV58型 Ll蛋白16個(gè)抗原表位最小基序和/或擴(kuò)展的8肽可作為制備包含B細(xì)胞抗原表位肽的預(yù) 防性多價(jià)HPV58肽疫苗候選肽段，其中6個(gè)HPV58型特異表位與GST188等載體融合表達(dá)后， 可單獨(dú)或組合用作HPV58型病毒感染檢測試劑盒中的標(biāo)志性抗原肽段。


圖1 HPV58L1蛋白線性抗原表位掃描定位圖(A-D)。其中1_24，用抗重組LlN 抗血清(A)和免疫前正常兔血清(B)為探針的LlN端相互重疊10 aa的系列GST-18肽 (P1-P24)融合蛋白免疫印跡結(jié)果；25-60，用抗重組LlC抗血清(C)和(D)為探針的LlC端 相互重疊10 aa的系列GST-18肽(P25-P60)融合蛋白印跡結(jié)果(C)；圖1A、C和D中箭頭 分別指示印跡陽性18肽融合蛋白和能被正兔血清識別的對照蛋白(與GST188融合表達(dá)的 HPV58E6-1373-87)。圖2 HPV58L1C的P27表位肽最小基序的免疫印跡圖。A 用兔抗重組LlC多抗與 P139-P149融合蛋白(Lane 1_11)的印跡結(jié)果，箭頭分別指示印跡反應(yīng)陽性的條帶；B:陰影 部分顯示印跡陽性肽(P139-P142)共有最小基序的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明可進(jìn)一步通過下列實(shí)例描述。這些例子并不意味限制本發(fā)明所涉及的范 圍，該范圍在之前的描述中已被充分陳述闡明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法， 均按照常規(guī)條件以及[美]J.薩姆布魯克和D. W.拉塞爾編著黃培堂等翻譯的第三版“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊”(科學(xué)出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.萊恩編著沈關(guān)心等翻譯的 “抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南”(科學(xué)出版社，2002)中所述的步驟，或按照生產(chǎn)銷售商建議的條件進(jìn) 行。實(shí)施例1 人乳頭瘤病毒58型(HPV58) Ll蛋白線性BCE掃描作圖 材料和方法
1. HPV58基因克隆(pLink322/HPV58質(zhì)粒)市購。pRSET C質(zhì)粒購自美國Invitrogen 公司。熱誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒PXXGST-I由本專利發(fā)明人構(gòu)建(專利申請?zhí)?00710173305.2)。 大腸桿菌BL21 (DE3)菌株市購。2.限制性內(nèi)切酶EcoR I.BamH I.Sal I、Taq酶和T4 DNA連接酶購自日本TaKaRa Biotechnology公司，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(IgG /HRP) 上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司。ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒購自GE Healthcare UK公司。0. 2 μ m硝酸纖維素膜購自Whatman Gmbh Hahnestr公司。6 X His單抗購自上海睿星生物技 術(shù)有限公司。3. QIAprep spin miniprep Kit質(zhì)粒抽提試劑盒、QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒 和quick凝膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司。4.新西蘭白兔購自上海BK實(shí)驗(yàn)動物有限公司。5.兩端分別為BamH I和Sal I粘性末端，中間為P1-P237編碼DNA序列加TAA 終止密碼子的正負(fù)鏈DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。6.抗HPV58L1N1—和LlC _524蛋白抗血清制備依據(jù)HPV58病毒Ll基因序列公開 信息(Kirii Y, et al. Human papillomavirus type 58 DNA sequence. Virol, 185: 424-427，1991)和參照文獻(xiàn)方法(宋力雯等.人卵透明帶蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原 性及其抗血清體外抑制人精子-半透明帶結(jié)合.生理學(xué)報(bào)，57: 682-688，2005)。制備過 程摘要如下從pLink322/HPV58質(zhì)粒中PCR擴(kuò)增出兩端為BamH I和EcoR I覆蓋全長Ll 蛋白序列相互重疊8個(gè)氨基酸殘基的兩個(gè)L1N36_233和L1C226_524編碼基因；雙酶切后重組插 入pRSET C質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌；誘導(dǎo)表達(dá)的重組含6 X His標(biāo)簽LlN和LlC蛋白用6 X His單抗鑒定后，用純化的重組LlN和LlC蛋白免疫新西 蘭白兔，加強(qiáng)免疫二次后抽取它們的抗血清備用。HPV58病毒Ll蛋白線性抗原表位掃描作圖的具體步驟如下
1.依據(jù)HPV58型Ll基因序列公開信息，設(shè)計(jì)跨越L1N36_233 (刪除了信號肽)和L1C226_524 全序列的系列相互重疊10個(gè)氨基酸殘基的18肽(編號P1-P60)編碼DNA正負(fù)鏈片段(正 鏈 5，-端加 5，-gatcc, 3'-端加 taag-3，；負(fù)鏈 5，-端加 5，_tcgactta，3，-端加 g_3，)， 外送DNA合成。2.將1或2個(gè)OD的互補(bǔ)正負(fù)鏈片段用ddH20溶解成20 mmol/ml儲存液(根據(jù)DNA 合成報(bào)告單數(shù)據(jù));各取10 ml儲存液和20 ddH20于1.5 ml Eppendorf管中，94°C水浴加熱 5 min,自然降至室溫后，在15 ml反應(yīng)體積中吸入2 ml退火片段、1 ml約200 ng/ml經(jīng) BamH I和Sal I雙酶切的pXXGST_l質(zhì)粒、1 ml T4 DNA連接酶和其1. 5 ml緩沖液，連接過 夜；連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21 (DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37°C培養(yǎng)過夜；第 二天挑取氨芐LB平板上長出的單克隆轉(zhuǎn)接3 ml LB培養(yǎng)液誘導(dǎo)表達(dá)，以由pXXGST_2表達(dá) 的GST188蛋白為對照，各表達(dá)的GST188-18肽(P1-P60)融合蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE分析確認(rèn)(與對照蛋白電泳遷移率相差約2 kDa)，挑取各重組克隆外送進(jìn)行DNA測序；
3.將插入片段測序結(jié)果正確的克隆接種加入Amp的3ml LB培養(yǎng)液中，于30°C振蕩 培養(yǎng)過夜，翌日晨按1/50比例轉(zhuǎn)接新鮮含Amp的LB培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)2 3 h至 菌體濃度達(dá)到0.6 0.8 OD后，調(diào)高溫度至42°C熱誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，加上樣裂解 液煮沸5 min備用；
4.將誘導(dǎo)的細(xì)菌總蛋白樣品同時(shí)走15%SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，一塊凝膠用考馬斯 亮藍(lán)染色，二塊凝膠進(jìn)行硝酸纖維素膜電(100 mA)轉(zhuǎn)移2 h，用麗春紅染色轉(zhuǎn)印跡膜2 min, 數(shù)碼相機(jī)拍照后用水沖洗掉麗春紅染色；
5.印跡膜用PBS緩沖液反復(fù)洗滌四次，用5%脫脂奶粉封閉過夜，PBS緩沖液洗滌四 次，分別在8 10 ml反應(yīng)液中加入30 ml—抗兔抗重組L1N/L1C血清或正兔血清，室溫 反應(yīng)2 h，PBS緩沖液洗滌后加入5 ml 二抗羊抗兔IgG /HRP (1: 2000稀釋)，室溫反應(yīng)1 h，用PBS緩沖液洗滌后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色后曝光于X光膠片(圖1A-D)。6.依據(jù)用抗L1N/L1C血清(圖1A)和正兔血清(圖1C)印跡結(jié)果，確定HPV58型Ll 蛋白上存在23個(gè)線性BCE肽。實(shí)施例2 HPV58病毒LlC蛋白P27表位肽最小基序鑒定 材料和方法
見實(shí)施例1相應(yīng)部分。P27表位肽最小基序鑒定的具體步驟如下
1.依據(jù)實(shí)施例1中LlC蛋白抗原表位掃描定位結(jié)果，以P27表位肽為例實(shí)施其最 小基序鑒定。設(shè)計(jì)跨越P27表位肽的18肽序列相互重疊7個(gè)氨基酸殘基的系列8肽 (P139-P149)編碼DNA正負(fù)鏈片段(正鏈5，-端加5，-gatcc, 3，-端加taag-3，；負(fù)鏈5，-端 加 5，-tcgactta，3，-端加 g_3，)，外送 DNA 合成。2-4操作步驟同實(shí)施例1中的2-4步驟。5.印跡膜用PBS緩沖液反復(fù)洗滌四次，用5%脫脂奶粉封閉過夜，PBS緩沖液洗滌 四次，分別在8 10 ml反應(yīng)液中加入30 ml —抗兔抗人重組LlC血清(1:200稀釋)，室 溫反應(yīng)2 h，PBS緩沖液洗滌后加入5 ml 二抗羊抗人IgG /HRP (1: 2000稀釋)，室溫反應(yīng) 1 h，用PBS緩沖液洗滌后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色(圖2A)。6.依據(jù)4個(gè)印跡陽性連續(xù)片段(P139-P142)共有殘基序列(圖2B，Lane 1_4)，確 定其表位最小基序?yàn)镈VPID。盡管本發(fā)明描述了 HPV58/L1致癌性蛋白共16個(gè)抗原表位最小基序，以及可單獨(dú) 和/或組合用含最小基序的8肽或8肽融合蛋白研制治療性HPV58多表位疫苗，或可單獨(dú) 和/或組合用作檢測人HPV58型特異感染的抗原肽(或化學(xué)合成或融合表達(dá))，但有一點(diǎn)對 于相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù)人員來說是顯而易見的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下， 可對本發(fā)明的表位肽基序和擴(kuò)展的含最小基序8肽融合蛋白作各種變化改動。因此，所附 權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
權(quán)利要求
一種HPV58型L1蛋白上最小表位基序肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ. ID No.1所示，記為HPV58L1 138 43；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.2所示，記為HPV58L1 2107 112；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.3所示，記為HPV58L1 3154 157；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.4所示，記為HPV58L1 4208 211；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.5所示，記為HPV58L1 5213 217；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.6所示，記為HPV58L1 6222 227；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.7所示，記為HPV58L1 7228 231；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.8所示，記為HPV58L1 8236 242；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.9所示，記為HPV58L1 9245 249；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.10所示，記為HPV58L1 10298 301；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.11所示，記為HPV58L1 11331 335；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.12所示，記為HPV58L1 12378 381；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.13所示，記為HPV58L1 13383 388；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.14所示，記為HPV58L1 14462 465；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.15所示，記為HPV58L1 15500 506；或者氨基酸序列如SEQ. ID No.16所示，記為HPV58L1 16508 510。
2. 一種含如權(quán)利要求1所述的最小表位基序肽的短肽，其特征在于氨基酉I序列如SEQ.IDNo.17所示，記為L1-1，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.18所示，記為L1-2，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.19所示，記為L1-3，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.20所示，記為L1-4，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.21所示，記為L1-5，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.22所示，記為L1-6，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.23所示，記為L1-7，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.24所示，記為L1-8，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.25所示，記為L1-9，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.26所示，記為L1-10，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.27所示，記為Ll-11，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.28所示，記為L1-12，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.29所示，記為L1-13，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.30所示，記為L1-14，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.31所示，記為L1-15，或者氨基酉I序列如SEQ.IDNo.32所示，記為L1-16 ；上述序列中，帶下標(biāo)的X編號代表特定氨基酸殘基，在化學(xué)合成或融合表達(dá)最小基序 或含最小基序8肽的場合，可刪除或不刪除，或用其他殘基替代該X編號殘基。
3.如權(quán)利要求1所述的HPV58型Ll蛋白上最小基序肽，在制備包含B細(xì)胞表位肽待預(yù) 防性多價(jià)HPV58肽疫苗中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求1所述的HPV58型Ll蛋白上最小基序肽，與GST188載體融合表達(dá)的單獨(dú)或組合表位肽作為標(biāo)志性抗原肽段在HPV58病毒感染血清學(xué)檢測試劑盒中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求2所述的含最小基序的短表位肽，在制備包含B細(xì)胞表位肽的預(yù)防性多 價(jià)HPV58肽疫苗中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求2所述的含最小基序的短表位肽，與GST188載體融合表達(dá)的單獨(dú)或組合 表位肽作為標(biāo)志性抗原肽段在HPV58病毒感染血清學(xué)檢測試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥與生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種人乳頭瘤(HPV)58型L1結(jié)構(gòu)蛋白的抗原表位(Bcellepitope)最小基序肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了16個(gè)含最小基序表位肽(包括可與截?cái)郍ST188等載體蛋白表達(dá)的8肽序列)的氨基酸序列，它們可作為抗原單獨(dú)或組合用于特異檢測HPV58型病毒感染患者血清，以及用作研制同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫的預(yù)防性HPV58多表位肽疫苗。這些HPV58型L1抗原表位最小基序肽和短肽的氨基酸序列如SEQIDNo.1~SEQIDNo.32所示。
文檔編號G01N33/569GK101962400SQ20101029224
公開日2011年2月2日 申請日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者何亞萍, 唐海平, 孫志達(dá), 季朝能, 徐萬祥, 王健, 謝毅, 顧少華 申請人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所;復(fù)旦大學(xué)