專利名稱：一種硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測方法，尤其指一種硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，屬于 食品安全檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
硝基呋喃類(Nitrofurans)是一類合成的抗菌藥物，它們作用于微生物酶系統(tǒng)， 抑制乙酰輔酶A，干擾微生物糖類的代謝，從而起抑菌作用。因價格較低廉且療效佳，廣泛用 于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，用以治療由大腸桿菌或沙門式桿菌所引起之腸炎，養(yǎng)殖魚之疥瘡、 潰瘍病等，于飼料中添加或養(yǎng)殖藥浴使用。由于硝基呋喃類抗菌劑及其代謝物對人體長期 食入有致癌、致畸胎及安全之顧慮，1995年起歐盟(European Union)禁止硝基呋喃類抗菌 劑在食用之畜禽及水產(chǎn)動物使用，并嚴格執(zhí)行對輸入之食用魚、蝦及禽類進行硝基呋喃的 殘留檢測。硝基呋喃類抗菌劑原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速無法檢測；而其代謝物因和蛋白 質(zhì)結(jié)合而相當穩(wěn)定，故利用代謝物的檢測可反應(yīng)硝基呋喃類抗菌劑的殘留狀況。硝基呋喃 類抗菌劑常見有以下四種藥物——呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因。代謝物分別 為 AOZ (3-amino-2-oxazolidinone)、AMOZ (3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidino ne)、SEM(semicarbazide)、AHD(1-aminohydantoin)。硝基呋喃類藥物、氯霉素、環(huán)丙沙星 等在國際國內(nèi)均為禁用漁藥。人體長期大量攝入硝基呋喃類化合物，存在致癌的可能性。 同時，魚體內(nèi)大量的抗生素藥物殘留，會使食用者產(chǎn)生耐藥性，降低此類藥物的臨床治療效 果，對人體的潛在危害不容忽視。當前檢測硝基呋喃類代謝物的方法主要有兩種液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免 疫法。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理時間需要16小時，且操作繁瑣費時；酶聯(lián)免疫法前處 理時間需要16小時，且檢測方法單一，一次只能檢測其中的一種，檢測試劑昂貴，成本高， 提取操作繁瑣費時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測硝基呋喃類代謝物的檢測方法，其檢測試劑以及檢測成本 低，具體技術(shù)方案如下面所描述一種硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，包括(1)樣品取樣；(2)將樣品與提取 劑混合均勻并獲取上清液；(3)加入提取劑重新提取并獲得混合提取液；(4)在混合提取液 之中加入衍生化試劑以及催化劑并混合均勻；(5)將所述混合液冷至室溫；(6)將混合后的 提取液調(diào)節(jié)到中性，并加入乙酸乙酯進行萃取；(7)重復操作后，合并乙酸乙酯層；(8)將其 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干并加入甲醇溶液溶解殘渣；(9)激活凈化柱將甲醇溶解液過柱并獲取洗脫液 吹干；(10)殘留物加入乙腈水溶液以及異辛烷溶解并獲取下層乙腈水層；(11)將上述乙腈 水層過微孔濾膜；(12)分析并測定硝基呋喃類代謝物的成分以及含量。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述⑴樣品取樣是按照下列方法進行處理的魚，去 鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蝦，去頭、去殼，取肌肉部分；蟹、甲魚等取可食部分以及樣品切成小塊后，用打漿機打碎并將其均質(zhì)混勻。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述步驟(2)中，獲取上清液是按照下列方法獲得的 通過將樣品與提取劑混合并放置于搖床振搖或超聲，再離心處理。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述步驟(4)中，在混合提取液之中加入衍生化試劑以 及催化劑并混合均勻以后，再放置于搖床振搖或超聲，取出冷至室溫。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述步驟(12)中采取高效液相儀器進行測定硝基呋喃 類代謝物。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述提取劑為酸性氧化鋁、硅膠C18鍵合材料和吸附型 離子交換樹脂按30 40 30比例混合。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述提取劑所述提取劑為三氯乙酸-甲醇溶液。進一步地，優(yōu)選的方法是，所述衍生化試劑為100 μ L鄰氯苯甲醛、5mL冰乙酸和 20mL甲醇混合液。本發(fā)明在采取了上述檢測方法以后，將前處理時間縮短到了 7小時以內(nèi)，解決了 前處理時間長的問題；能同時檢測AOZ、AMOZ、SEM、AHD四種硝基呋喃類代謝物，解決了檢測 項目單一的問題；檢測成本低，解決了檢測試劑昂貴、成本高的問題；簡化提取以及衍生的 操作，解決了操作過程繁瑣的問題。并且檢測方法準確、可靠、靈敏度高，具有較佳的技術(shù)效^ ο


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行詳細的描述，以使得本發(fā)明的上述優(yōu)點更加明確。圖1是本發(fā)明硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法的流程圖。
具體實施例方式下面，結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細的描述。首先，進行獲取樣品的樣品取樣過程，在該取樣步驟之中，魚，去鱗、去皮，沿脊背 取肌肉；蝦，去頭、去殼，取肌肉部分；蟹、甲魚等取可食部分，樣品切成小塊后，用打漿機打 碎，均質(zhì)混勻，備用。接下來，將樣品與提取劑混合均勻并獲取上清液；接著加入提取劑重新提取并獲 得混合提取液。稱取已搗碎的樣品IOg (精確到0. Olg)，置于50mL離心管中，先后加入提取 劑1及IOmL提取劑2，漩渦混合后于40°C搖床振搖或超聲30min，于6000r/min離心IOmin ； 取出上清液，再加入IOmL提取劑2，重復提取一遍，合并提取液于50mL離心管中，上述步驟 完成以后，提取步驟完成。接下來，在混合提取液之中加入衍生化試劑以及催化劑并混合均勻；將所述混合 液冷至室溫，從而完成衍生化步驟。我們將在提取步驟中提取的混合液之中，加入衍生化試 劑0. 5mL及催化劑0. 5mL后混勻，于40°C搖床振搖或超聲60min，取出冷至室溫。接下來，進行反萃步驟，我們將將混合后的提取液調(diào)節(jié)到中性，并加入乙酸乙酯進 行萃取；重復操作后，合并乙酸乙酯層；將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干并加入甲醇溶液溶解殘渣。將冷卻后的上清液用10mol/L和lmol/L的氫氧化鈉調(diào)pH到7. 0 (士0. 1)，加入 15mL乙酸乙酯萃取，4000r/min離心后，取出乙酸乙酯層于梨形瓶中，再加入IOmL乙酸乙酯，重復上述操作兩次，合并乙酸乙酯層，于35°C水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入5%的甲 醇溶液5mL溶解殘渣。接下來，進入到凈化步驟，激活凈化柱并獲取洗脫液；殘留物加入乙腈水溶液以及 異辛烷溶解并獲取下層乙腈水層；將上述乙腈水層過微孔濾膜；分析并測定硝基呋喃類代 謝物的成分以及含量。將凈化柱C18-CN復合柱依次用5mL甲醇、5mL水激活后，加入旋蒸后的溶解液正壓 或負壓以2 3mL/min速度過柱，流凈后加5mL蒸餾水洗滌，擠干，棄去流出液，用2mL甲醇 以2 3mL/min速度洗脫，接收全部洗脫液，40°C沙浴中氮氣吹干。殘留物用1. OmL乙腈水 溶液及2mL異辛烷溶解，振蕩混勻，5000r/min離心分離，取下層乙腈水層過微孔濾膜供高 效液相儀器測定。其中，一種提取劑采取酸性氧化鋁、硅膠C18鍵合材料和吸附型離子交換樹脂按 30 40 30比例混合。另一種提取劑采取三氯乙酸-甲醇溶液，稱取55. 4g三氯乙酸溶 于500mL水中，加入500mL甲醇混合。衍生化試劑可以吸取100 μ L鄰氯苯甲醛，溶解于5mL 冰乙酸和20mL甲醇混合液中。一種前處理柱為C18-CN混合柱；200mg，3mL。可用效能相當 的柱子替代。一種前處理柱為PCX柱，200mg，3mL。可用性能相當?shù)闹犹娲?。上述具體實施例僅僅是示例性的，在本發(fā)明的上述教導下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 在上述實施例的基礎(chǔ)上進行各種改進和變形，而這些改進或者變形落在本發(fā)明的保護范圍 內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，上面的具體描述只是為了解釋本發(fā)明的目的，并非用于限制 本發(fā)明。本發(fā)明的保護范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
一種硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，包括(1)樣品取樣；(2)將樣品與提取劑混合均勻并獲取上清液；(3)加入提取劑重新提取并獲得混合提取液；(4)在混合提取液之中加入衍生化試劑以及催化劑并混合均勻；(5)將所述混合液冷至室溫；(6)將混合后的提取液調(diào)節(jié)到中性，并加入乙酸乙酯進行萃??；(7)重復操作后，合并乙酸乙酯層；(8)將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干并加入甲醇溶液溶解殘渣；(9)激活凈化柱將甲醇溶解液過柱并獲取洗脫液吹干；(10)殘留物加入乙腈水溶液以及異辛烷溶解并獲取下層乙腈水層；(11)將上述乙腈水層過微孔濾膜；(12)分析并測定硝基呋喃類代謝物的成分以及含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，所述(1)樣 品取樣是按照下列方法進行處理的魚，去鱗、去皮，沿脊背取肌肉；蝦，去頭、去殼，取肌肉 部分；蟹、甲魚等取可食部分以及樣品切成小塊后，用打漿機打碎并將其均質(zhì)混勻。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，所述步驟 (2)中，獲取上清液是按照下列方法獲得的通過將樣品與提取劑混合并放置于搖床振搖 或超聲，再離心處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，所述步驟 (4)中，在混合提取液之中加入衍生化試劑以及催化劑并混合均勻以后，再放置于搖床振搖 或超聲，取出冷至室溫。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，所述步驟 (12)中采取高效液相儀器進行測定硝基呋喃類代謝物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，所述提取 劑為酸性氧化鋁、硅膠C18鍵合材料和吸附型離子交換樹脂按30 40 30比例混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，所述提取 劑為三氯乙酸-甲醇溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，其特征在于，衍生化試 劑為100 μ L鄰氯苯甲醛、5mL冰乙酸和20mL甲醇混合液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種硝基呋喃類代謝物前處理檢測方法，包括(1)樣品取樣；(2)將樣品與提取劑混合均勻并獲取上清液；(3)加入提取劑重新提取并獲得混合提取液；(4)在混合提取液之中加入衍生化試劑以及催化劑并混合均勻；(5)將所述混合液冷至室溫；(6)將混合后的提取液調(diào)節(jié)到中性，并加入乙酸乙酯進行萃??；(7)重復操作后，合并乙酸乙酯層；(8)將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干并加入甲醇溶液溶解殘渣；(9)激活凈化柱將甲醇溶解液過柱并獲取洗脫液吹干；(10)殘留物加入乙腈水溶液以及異辛烷溶解并獲取下層乙腈水層；(11)將上述乙腈水層過微孔濾膜；(12)分析并測定硝基呋喃類代謝物的成分以及含量。所述方法準確可靠、靈敏度高，具有較佳的技術(shù)效果。
文檔編號G01N30/02GK101949897SQ20101021317
公開日2011年1月19日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者王亞軍, 賈東芬 申請人:北京六角體科技發(fā)展有限公司