專利名稱：一種新型的動物乳腺炎檢測方法及檢測儀的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于泌乳動物乳腺炎檢測的技術(shù)，更具體的說是泌乳動物亞臨床乳腺炎的早期檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
乳腺炎是泌乳家畜中最常見的疾病，每年都會給乳業(yè)帶來具大的經(jīng)濟(jì)損失，表現(xiàn)為患病家畜的奶質(zhì)量和奶產(chǎn)量顯著降低，治療費(fèi)和管理費(fèi)增加。乳腺炎根據(jù)其臨床程度分為臨床型和亞臨床型。臨床乳腺炎造成乳房紅腫，或伴有全身和乳房局部癥狀。產(chǎn)出有凝塊、絮片以及水樣奶，可以用肉眼立即檢出；而亞臨床型(或非臨床)乳腺炎的檢出則需要借助儀器或其它化學(xué)方法。家畜亞臨床乳腺炎占乳房炎發(fā)病率的90%，是危害泌乳家畜的重要疾病之一。及時檢測出亞臨床乳腺炎，就可以及時控制疾病的進(jìn)一步發(fā)展，提高治療效果。從而降低個體病畜對整體畜群感染的機(jī)會，減小經(jīng)濟(jì)損失。乳腺炎的診斷方法有乳液的細(xì)胞學(xué)檢查，電導(dǎo)率測定，pH值的檢查，乳清電泳診斷法，酶檢測法，PCR檢測法等。加州乳腺炎檢測法(CMT)是目前使用較普遍的一種簡便、快速的方法，但此法僅可用于臨床乳腺炎的定性檢測，由于其靈敏度差，假陽性的檢出率可高達(dá)50%，不能用于亞臨床乳腺炎的檢測。實(shí)驗(yàn)室用一種叫流式細(xì)胞儀來檢測乳液的體細(xì)胞數(shù)，其原理是當(dāng)乳液樣品通過儀器的單細(xì)胞通道時，儀器可自動記錄通過的體細(xì)胞數(shù)，但是這種儀器價(jià)格昂貴，體積大，不能用于現(xiàn)場的病牛檢測。市場上曾有一種使用檢測牛奶電導(dǎo)率的裝置(MSA-D-Tec)來檢測乳腺炎，此方法是根據(jù)牛奶中的電解質(zhì)(Na+和Cl—)隨著奶中的體細(xì)胞數(shù)增加而升高的原理而設(shè)計(jì)的，此方法簡便、快速。但靈敏度比較差，假陽性的檢出率也高，而且每次測定都需要用被測牛的奶樣進(jìn)行儀器校正，另外，實(shí)驗(yàn)證明并非所有感染乳腺炎牛奶的電導(dǎo)率均會升高，而牛奶導(dǎo)電性的升高也并非完全來自于患有乳腺炎的奶牛。近年來，出現(xiàn)了一種使用檢測奶樣中髓過氧化酶(myoloperoxidase，ΜΡ0)的技術(shù)來診斷亞臨床乳腺炎，它是根據(jù)奶樣中的體細(xì)胞數(shù)和MPO的濃度有較群強(qiáng)的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)值0.91)，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對奶樣中的MPO的檢測來判斷乳房內(nèi)中性粒細(xì)胞的活性狀態(tài)，可對奶牛的亞臨床乳腺炎做出早期診斷，但此技術(shù)操作復(fù)雜，費(fèi)時，僅局限于實(shí)驗(yàn)室的檢測。牛奶體細(xì)胞電子測定儀(PortaSCC)是近來出現(xiàn)在國內(nèi)市場診斷臨床和亞臨床乳腺炎的一美國產(chǎn)品，此儀器的設(shè)計(jì)來源于人體白細(xì)胞的體外檢測技術(shù)，即通過測定體細(xì)胞膜表面生物酶與特異底物的反應(yīng)，這種反應(yīng)能夠使試紙顏色發(fā)生變化，牛奶樣品中的體細(xì)胞數(shù)越多，顏色越深。此儀器的特點(diǎn)是，現(xiàn)場實(shí)施，操作簡便；但儀器成本高，檢測需時長，樣本的測試條件要求嚴(yán)格。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種技術(shù)設(shè)計(jì)新穎、操作簡便、檢測迅速、成本低的泌乳動物乳腺炎的檢測技術(shù)，可以克服上述乳腺炎檢測技術(shù)的缺陷。本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容如下測定把在患病家畜奶液中加入反應(yīng)試劑后形成的混合凝膠通過一層纖維過濾膜的時間，來檢測患病家畜奶液中的體細(xì)胞數(shù)，從而進(jìn)一步評估家畜感染乳腺炎的程度。它的原理是，家畜感染乳腺炎后，奶中體細(xì)胞數(shù)隨之增加。將一種帶負(fù)電皂化物(SDS)與奶樣混合，奶中體細(xì)胞的核酸DNA會釋放出來，并與此種帶負(fù)電皂化物相互反應(yīng)結(jié)合形成凝膠，體細(xì)胞的數(shù)量越多則凝膠形成越多，導(dǎo)致奶液的粘稠度增加，通過纖維過濾膜的時間便長。以本發(fā)明所提供的方法而設(shè)計(jì)的檢測儀可以定量地測出奶中的體細(xì)胞數(shù)，快速辯別臨床和亞臨床乳腺炎。裝置設(shè)計(jì)由圖1至圖5組成本發(fā)明提供的檢測方法是通過樣本容器和微處理器共同完成的。本設(shè)計(jì)是通過直接采用電信號中斷記時的方法對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測試的一種設(shè)計(jì)，也可以通過其他的信號中斷如電容、電磁、光、等信號中斷記時的方法對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測
試ο


裝置設(shè)計(jì)總體組裝圖如圖1和圖2所示。包括1.儀器盒上蓋；2.電源開關(guān)；3.樣本容器信號輸入輸出端與微處理器接口件a ;4.儀器盒底座；5.樣本容器臺；6.儀器盒底座上接口件(3，7)的安裝孔；7.樣本容器信號輸入輸出端與微處理器接口件b;8.樣本容器組合；9.微處理器控制板；10重新計(jì)數(shù)健；11.顯示器。樣本容器組合如圖3和圖4所示組成，包括12.樣本容器上蓋；13.信號輸入輸出端與儀器接口件a，14.信號傳導(dǎo)通路a，15.樣本凝膠纖維過濾膜.16.底座，17.底座上的過濾薄膜支撐架，18.信號傳導(dǎo)通路b，19.信號輸入輸出端與儀器接口件b，20.樣本接受部漏斗，21.傳感器監(jiān)視口，22.樣本容器把手，23.樣本容器和信號輸入輸出端與儀器接口件的裝配孔。微處理器控制示意圖如圖5所示。
圖6、圖7和圖8圖為實(shí)施例1-4結(jié)果示意圖，分別為不同體細(xì)胞濃度下，牛奶樣本形成的混合凝膠通過不同孔徑樣本凝膠纖維過濾膜(樣本接受部漏斗20，傳感器監(jiān)視口 21.)的時間與體細(xì)胞數(shù)呈線性增長的關(guān)系，圖6、圖7、圖8的橫坐標(biāo)為體細(xì)胞數(shù)，縱坐標(biāo)為時間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的操作過程如下把樣本牛奶和反應(yīng)試劑按比例均勻混合30-60秒后，形成混合凝膠，將形成的混合凝膠倒入樣本容器(樣本容器組合8)內(nèi)，混合凝膠從樣本容器的漏斗狹窄口(樣本接受部漏斗20)經(jīng)過纖維過濾膜(樣本凝膠纖維過濾膜15)。在混合凝膠從樣本容器的下端漏斗狹窄口(傳感器監(jiān)視口 21)經(jīng)過時，傳感器就會產(chǎn)生反應(yīng)信號， 該信號由信號輸入輸出端與儀器接口件(13禾Π 19)經(jīng)信號傳導(dǎo)通路(14禾Π 18)傳入微處理器(9)，微處理器開始記錄時間，當(dāng)混合凝膠從樣本容器的漏斗狹窄口全部流過時，傳感器端的反應(yīng)信號就會消失，微處理器把混合凝膠經(jīng)過過濾器的記錄時間進(jìn)行處理并計(jì)算出細(xì)胞數(shù)，并在微型顯示器(11)上顯示出來。傳感器可以采用各種電感，電容，電磁，光傳感器， 等開關(guān)信號。本發(fā)明使用試劑SDS的濃度一般為-5%，較好為3%，優(yōu)選為2%。奶樣本與試劑SDS的比例為1 0.5-3，較好為1 0.75-2，優(yōu)選為1 1。本發(fā)明使用的纖維過濾膜的平均孔徑為1-20 μ m,較好為1-10 μ m,優(yōu)選為1-5 μ m。本發(fā)明可用于現(xiàn)場患病個體牲畜的奶樣的檢測，也可用于大罐儲存奶液含體細(xì)胞
4數(shù)的檢測，從而鑒定儲存奶液的質(zhì)量。本發(fā)明的檢測方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于儀器設(shè)計(jì)簡單，成本低，檢測時間短，精確度高，便于樣本的準(zhǔn)備和樣本容器的清洗，同時對待測奶樣本來源，如保存時間長短，樣本雜質(zhì)含量均無嚴(yán)格要求。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1配制已知體細(xì)胞數(shù)的模擬乳腺炎牛奶。收集500ml新鮮牛血液，然后轉(zhuǎn)入含有抗血凝因子的離心管內(nèi)，冰上靜置10分鐘，離心300Xg(4°C )，倒掉血情，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞，使用Ficoll-Isopaque方法分離白細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器測定細(xì)胞含量。選市場出售的優(yōu)質(zhì)牛奶(體細(xì)胞數(shù)低于5萬/ml)，用流式細(xì)胞儀來檢測此牛奶的體細(xì)胞數(shù)，然后將分離好的白細(xì)胞(體細(xì)胞)按量加到牛奶中，制成含有已知體細(xì)胞數(shù)的模擬乳腺炎樣本牛奶，樣本牛奶應(yīng)4 °C保存。實(shí)施例2取Iml含體細(xì)胞數(shù)25萬/ml的模擬乳腺炎牛奶于玻璃試管一內(nèi)，從玻璃試管一內(nèi)取0. 5ml含體細(xì)胞數(shù)25萬/ml的模擬乳腺炎牛奶于玻璃試管二內(nèi)，加0. 5 ml體細(xì)胞數(shù)低于5萬/ml的優(yōu)質(zhì)牛奶于玻璃試管二內(nèi)，混合均勻，此試管二內(nèi)的體細(xì)胞數(shù)為12. 5萬/ml， 從試管二內(nèi)取0. 5ml樣本加到玻璃試管三內(nèi)，加0. 5ml體細(xì)胞數(shù)低于5萬/ml的優(yōu)質(zhì)牛奶于玻璃試管三內(nèi)，混合均勻，此試管三內(nèi)的體細(xì)胞數(shù)為6. 25萬/ml，從試管三內(nèi)取0. 5ml樣本，棄掉。加0.5ml體細(xì)胞數(shù)低于5萬/ml的優(yōu)質(zhì)牛奶于玻璃試管四內(nèi)，樣本試管四為空白對照(零)，將上述每一樣本試管內(nèi)加0. 5ml的2%試劑SDS，混合均勻1分鐘。將孔徑為 3 μ m的樣本凝膠纖維過濾膜通過檢測部件放入拿出幫助口放入樣本容器內(nèi)，開啟檢測儀， 將樣本試管混合物倒入樣本容器內(nèi)進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。實(shí)施例3參照實(shí)施例2制備含不通體細(xì)胞數(shù)的模擬乳腺炎牛奶，分別為，8百萬/ml，6百萬 /ml，4百萬/ml，2百萬/ml和1百萬/ml，加0. 5ml每一樣本于一玻璃試管內(nèi)，加0. 5ml體細(xì)胞數(shù)低于5萬/ml的優(yōu)質(zhì)牛奶于一玻璃試管內(nèi)，作為空白對照(零)，將上述每一樣本試管內(nèi)加0. 5ml的2%試劑SDS，混合均勻1分鐘。將孔徑為8 μ m的樣本凝膠纖維過濾膜通過檢測部件放入拿出幫助口放入樣本容器內(nèi)，開啟檢測儀，將樣本試管混合物倒入樣本容器內(nèi)進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。實(shí)施例4參照實(shí)施例3制備含不通體細(xì)胞數(shù)的模擬乳腺炎牛奶，分別為，2. 4千萬/ml，1. 2 千萬/ml和0. 6千萬/ml，加0. 5ml每一樣本于一玻璃試管內(nèi)，加0. 5ml體細(xì)胞數(shù)低于5萬 /ml的優(yōu)質(zhì)牛奶于一玻璃試管內(nèi)，作為空白對照(零)，將上述每一樣本試管內(nèi)加0. 5ml的 2%試劑SDS,混合均勻1分鐘。將孔徑為15 μ m的樣本凝膠纖維過濾膜通過檢測部件放入拿出幫助口放入樣本容器內(nèi)，開啟檢測儀，將樣本試管混合物倒入樣本容器內(nèi)進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測泌乳家畜乳腺炎，包括臨床和亞臨床乳腺炎的新方法，其特征在于，將反應(yīng)試劑SDS加入患病家畜奶液中，反應(yīng)試劑SDS與奶液中體細(xì)胞的DNA相互作用，改變了奶液的粘稠度，通過測定反應(yīng)奶液被樣本容器纖維膜吸附的時間來檢出乳腺炎。使用微處理器來自動計(jì)錄時間，算出奶液中的體細(xì)胞數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，其中試劑SDS的濃度為-5%。
3.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，其中樣本纖維過濾膜的孔徑為1-20μ m。
4.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，其中樣本容器為漏斗狀，可以是各種漏斗形狀，不限于圖3和圖4所示的圓形。其中樣本容器樣本通過孔徑00)為l-10mm。
5.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，其中測定反應(yīng)奶液被樣本容器纖維膜吸附的時間，所采用的方法可以是任何電磁、電容中斷、光感中斷等信號，不限于如圖3和圖4所示的直接采用電流中斷的方法。
6.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，包括樣本容器。其中樣本容器有快速連接件 (信號輸入輸出端與儀器接口件13和19)，可以和測量裝置快捷的連接。
7.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，包括樣本容器。其中樣本容器有過濾膜支撐件，支撐件和樣本收容器底端有通口，可以使過濾液體通過。
8.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，包括測量裝置。其中測量裝置有快速連接件 (樣本容器信號輸入輸出端與微處理器接口件3和7)，可以和樣本容器快捷的連接。
9.如權(quán)利要求1所述的乳腺炎檢測方法，測量裝置上有樣本放置臺(樣本容器臺5)， 樣本容器放置于樣本放置臺上，樣本容器可以方便取放，便于樣本的準(zhǔn)備和樣本容器的清洗。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測泌乳家畜乳腺炎，包括臨床和亞臨床乳腺炎的新方法，它是通過測定把在患病家畜奶液中加入反應(yīng)試劑后形成的混合凝膠通過一層纖維過濾膜的時間，來檢測患病家畜奶液中的體細(xì)胞數(shù)，從而進(jìn)一步評估家畜感染乳腺炎的程度。它的原理是，奶中體細(xì)胞的核酸DNA與一種帶負(fù)電的皂化物(SDS)結(jié)合形成凝膠，體細(xì)胞的數(shù)量越多則凝膠形成越多，從而導(dǎo)致奶液的粘稠度增加，通過纖維膜的時間也成比例延長。以本發(fā)明所提供的方法而設(shè)計(jì)的檢測儀可以快速定量得測出奶中的體細(xì)胞數(shù)，從而為快速辨別臨床和亞臨床乳腺炎，早期有效的控制乳腺炎在家畜群中的蔓延，提供簡捷有效的方法和工具。
文檔編號G01N33/50GK102213715SQ201010161970
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者張全有, 李其昌, 陳克紅, 陳永波 申請人:內(nèi)蒙古碩高生物科技有限責(zé)任公司