專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)重金屬脅迫下核仁c23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測(cè)重金屬脅迫下核仁蛋白質(zhì)變 化的定位方法。更具體的說(shuō)是一種檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫 熒光方法。該方法為研究重金屬毒害植物細(xì)胞機(jī)理提供新的技術(shù)支持。
背景技術(shù)：
隨著近代工業(yè)的發(fā)展，由此引發(fā)的環(huán)境污染問(wèn)題日益突出。加之化肥和農(nóng)藥的不 合理施用，"三廢"和城市生活垃圾的排放，加快重金屬(As、 Cd、 Co、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni、 Pb、 Zn等)的污染物通過(guò)各種途徑進(jìn)入環(huán)境，并且通過(guò)食物鏈危害動(dòng)物和人體健康，導(dǎo)致大氣 和水環(huán)境質(zhì)量的進(jìn)一步惡化。目前，全球性的重金屬污染狀況日益嚴(yán)重，如何控制和減輕重 金屬對(duì)環(huán)境的污染和危害，已成為環(huán)境、土壤及相關(guān)學(xué)科科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)課題。 一些研 究表明了低濃度重金屬對(duì)植物的生長(zhǎng)有積極的剌激作用，但當(dāng)環(huán)境中重金屬濃度過(guò)高，則 對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用，引發(fā)植物生理、生化的變化；抑制植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收；損 傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；影響植物正常生長(zhǎng)代謝。 核仁(nucleolus)是真核細(xì)胞間期核內(nèi)高度緊密的結(jié)構(gòu)，它是rDNA轉(zhuǎn)錄和核糖體 亞基組裝的場(chǎng)所。核仁不僅是細(xì)胞內(nèi)通訊和核糖體RNA加工的中心，隨著細(xì)胞周期對(duì)細(xì)胞 增殖和衰老起重要的調(diào)控作用；一般來(lái)說(shuō)，核仁的化學(xué)成分主要由DNA、 RNA、蛋白質(zhì)和酶類(lèi) 等組成。其中以蛋白質(zhì)占干重的80%。 RNA約占干重的10X，多與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白的 形式存在。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法已鑒定了 350中核仁蛋白，這些蛋白質(zhì)與核仁的功能密切 相關(guān)。從生理生化、分子和細(xì)胞生物學(xué)手段，研究重金屬對(duì)核仁蛋白質(zhì)合成、分布及功能的 影響，已引起相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)家的關(guān)注。本發(fā)明人利用此技術(shù)研究了不同重金屬(Al、 Cd、 Cr、 Cu、 Hg、Mn、 Ni、 Pb、 Zn)脅迫
對(duì)蠶豆、大蒜、洋蔥及玉米等植物幼苗根尖細(xì)胞核仁的影響，這些研究結(jié)果表明重金屬脅 迫能夠損傷核仁結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致核仁中銀染蛋白物質(zhì)外溢到細(xì)胞質(zhì)中。其他學(xué)者如李曉玲、張義 賢，用不同濃度氯化鎳處理綠豆和大麥，通過(guò)銀染的方法也觀察到Ni2+能夠誘導(dǎo)綠豆和大 麥根尖細(xì)胞核仁銀染蛋白顆粒數(shù)量明顯增加。因此，利用銀染技術(shù)研究對(duì)重金屬對(duì)植物細(xì) 胞核仁結(jié)構(gòu)的影響，具有一定的科學(xué)價(jià)值。但是，銀染技術(shù)只能鑒定重金屬脅迫后，從細(xì)胞 核外溢到細(xì)胞質(zhì)中的銀染顆粒是核仁蛋白，不能鑒定是哪些種核仁蛋白受到重金屬脅迫的 影響，對(duì)深入研究重金屬毒害機(jī)理有一定的局限性。 近些年來(lái)，熒光免疫分析技術(shù)的發(fā)展尤為迅速，已在生命科學(xué)領(lǐng)域中廣泛地用于 測(cè)定生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)定位、核酸分析、神經(jīng)遞質(zhì)等方面研究。核仁蛋白C23是真核細(xì)胞核 仁的重要的蛋白組份之一，在調(diào)控核糖體的生物合成與成熟，細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、胚胎發(fā)生、胞 質(zhì)分裂、染色質(zhì)復(fù)制與核仁的發(fā)生等過(guò)程發(fā)揮重要作用。但是，利用免疫熒光技術(shù)研究重金 屬脅迫對(duì)核仁周期過(guò)程中C23蛋白質(zhì)的功能和動(dòng)態(tài)變化的影響尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫 熒光方法，為研究逆境脅迫下細(xì)胞中蛋白質(zhì)定位及變化特征提供了簡(jiǎn)易、準(zhǔn)確、快速的方法。
本發(fā)明人結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期工作，發(fā)明了一種檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23 蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法。該技術(shù)的主要原理是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與 熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)，研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光 可在熒光顯微鏡下檢出，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。 特別是本發(fā)明涉及的壓片方法的改革，能夠提高觀察細(xì)胞數(shù)目，可適用于其它細(xì)胞生物學(xué) 研究。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案 —種檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其特征在 于，按如下的步驟進(jìn)行 (1)切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細(xì)胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h ;經(jīng) PBS緩沖液洗； (2)采用2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶酶液于37t:溫箱酶解；經(jīng)PBS緩沖液洗滌 后壓片； (3)將植物根尖轉(zhuǎn)至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)， 用滴管吸取約0. 1-0. 2ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干后 備用； (4)將(3)得到的載玻片放在1 % TritonX-100浸泡15-20分鐘；經(jīng)PBS緩沖液洗 滌； (5)在(4)得到的載片上滴入15-20 iU配好的一抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育 lh-l. 5h ;再經(jīng)PBS緩沖液洗滌； (6)再將(5)得到的載片上滴入15-20 iU配好的二抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育 45min-lh ;經(jīng)PBS緩沖液洗滌； (7)再將(6)的載玻片上滴加15-20 ii 1 DAPI，蓋上蓋玻片；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5-10 ii 1防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用 指甲油將蓋玻片四周封好，l-2h后在熒光顯微鏡下觀察。 本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，
其中步驟(2)中酶解所用時(shí)間是指在鏡檢時(shí)如果觀察到大部分細(xì)胞均分散開(kāi)，成一層球
形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)解體，只剩下細(xì)胞核時(shí)，即結(jié)束酶解。 本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，
其中步驟(2)中所述的壓片是指酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴在載
玻片上，不蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。 本發(fā)明所述的PBS緩沖液洗是指采用PBS緩沖液洗3次，每次10-15分鐘。
本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法， 其中的一抗為鼠抗C23單克隆抗體，其濃度為0. 2mg/ml。 二抗為T(mén)RITC-山羊抗鼠IgG其 濃度為1. 5mg/ml。 本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法， 其中DAPI (4， 6- 二胺-2苯基吲哚-二鹽酸)的濃度為1 y g/ml。
本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法， 其中的1% Triton X-100為聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。 本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法， 其中的防淬滅劑為lOXlml。 本發(fā)明所述的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法， 其中的重金屬為Al、 As、 Cd、 Co、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni、 Pb或Zn。優(yōu)選As、 Cd、 Co、 Al、 Cr、 Cu、 Hg，特別優(yōu)選Al、Cd和Pb。 本發(fā)明的檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其中 所述的植物細(xì)胞包括蠶豆、洋蔥、玉米和洋蔥根尖細(xì)胞中核仁C23蛋白質(zhì)的變化。
本發(fā)明酶解所需的時(shí)間，要根據(jù)樣品酶解的具體情況而定。根據(jù)本發(fā)明人的經(jīng)驗(yàn)， 在鏡檢時(shí)觀察到大部分細(xì)胞均分散開(kāi)，成一層球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已經(jīng) 解體，只剩下細(xì)胞核時(shí)結(jié)束酶解，獲得的效果最佳。酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然 后，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。這種方法減去了常規(guī)壓片中蓋 片和揭片兩個(gè)步驟，避免了在這兩個(gè)步驟的操作中對(duì)細(xì)胞的損傷。
本發(fā)明更加詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟如下 以植物根尖為實(shí)驗(yàn)材料，待根生長(zhǎng)長(zhǎng)度約1. 5cm左右時(shí)，進(jìn)行不同重金屬脅迫實(shí) 驗(yàn)。
(1)切取重金屬處理后的根尖分生組織細(xì)胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h。
(2) PBS緩沖液(pH7. 0)中洗3次(每次10分鐘)。 (3)2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶，371:溫箱酶解，根據(jù)細(xì)胞酶解情況確定時(shí)間。
(4) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (5)將根尖轉(zhuǎn)至0. 5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約0. 1-0. 2ml樣品液，均勻涂于載片 上分散成單個(gè)細(xì)胞，不蓋蓋玻片，用記號(hào)筆在載片的無(wú)樣品面標(biāo)記，自然風(fēng)干后備用。
(6)將要標(biāo)記的切片放在1% TritonX-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)浸泡 20分鐘。 (7) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (8)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 y 1)配好的一抗(與C23核仁蛋白 結(jié)合)至載玻片的樣品處，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育lh-1.5h。需要強(qiáng)調(diào)的是購(gòu)買(mǎi)的抗 體要盡快分裝，分裝可以最大程度地降低反復(fù)凍融對(duì)抗體活性的損害，同時(shí)也降低了由于 多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (10)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 ii 1)配好的二抗(與一抗結(jié)構(gòu)的 熒光素)至載玻片的樣品上，蓋上蓋玻片。37t:溫箱孵育45min-lh。
(ll)PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (12) DAPI (DNA染料)染色用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 y 1) DAPI蓋 上載玻片。 (13)PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (14)用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(10 ii 1)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。 (15)熒光顯微鏡觀察核仁C23蛋白用藍(lán)光450 490nm(TRITC)激發(fā)呈橙紅色 熒光。DNA(細(xì)胞核和染色體)用紫外光355 425nm(DAPI)激發(fā)呈藍(lán)色熒光。
本發(fā)明所用到主要試劑的配置及保存 (1) 一抗鼠抗C23單克隆抗體(mouse monoclonal anti-C23 antibody)，購(gòu)自 SantaCruz (美國(guó))公司。 一抗?jié)舛葹?. 2mg/ml ，每個(gè)包裝為lml 。購(gòu)買(mǎi)后按每管10 y L分裝 于1. 5ml離心管中，-2(TC保存。待用時(shí)解凍。使用前用PBS緩沖液(pH7. 4)稀釋至1. 5ml 即可(相當(dāng)于稀釋了 150倍)，4t:保存。 (2) 二抗TRITC-山羊抗鼠IgG (Tritc-conj卿ted rabbit anti-Mouse
IgG(H+L))，購(gòu)自Jackson(美國(guó))公司。原裝進(jìn)口為凍干粉，2. 0ml ;進(jìn)口分裝為液體，
0. lml(另加O. lml甘油)。按每管10iiL分裝于0.5ml離心管中，-2(TC避光保存。待用時(shí)
解凍，用PBS buffer (pH7. 6)稀釋至0. 5ml即可(相當(dāng)于稀釋了 50倍)，4。C避光保存待用 (3) DAPI (4， 6_ 二胺_2苯基吲哚_ 二鹽酸)DAPI主要染核酸中DNA，儲(chǔ)存液用無(wú)離
子水配成lmg/ml濃度，4t:避光保存?zhèn)溆?，使用終濃度為1 y g/ml，4t:避光保存。紫外光激
發(fā)，細(xì)胞核和染色體呈藍(lán)色熒光。(4)磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液) NaCl 0. l頓0. 0082g/LKC12. 7mM 0. 2013g/LNa2HP04 8 . 0mM 2.8651g/L NaH2P04 1. 5mM 0. 2041 g/L 加無(wú)離子水至1L，用0. 1M NaH2P04調(diào)pH至7. 0 (5)固定劑4%多聚甲醛(paraformaldehyde in PBS buffer):購(gòu)自Sigma(美 國(guó))公司。稱(chēng)多聚甲醛白色粉末lg，量取25ml PBS buffer于燒杯中，蓋蓋兒，放置在通風(fēng) 櫥中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)，冷卻至室溫后，倒入棕色瓶中，4t:保存待用。固定 劑4%多聚甲醛，主要是殺死細(xì)胞，維持細(xì)胞在活體時(shí)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)。 (6)酶液(2. 5% Cellulase纖維素酶+2. 5 % Pectolase果膠酶)購(gòu)自Yakult Honsha(日本)公司。 一般配制5ml酶液，分別稱(chēng)0. 125g Cellulase和0. 125g Pectolase， 于5ml無(wú)離子水中，充分溶解后，分裝于4支1. 5ml的離心管中，_24°0保存?zhèn)溆谩Ｖ饕饔?去除細(xì)胞壁(纖維素和果膠)。 (7)1% Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司。 一般配25ml，取O. 25ml Triton X-100加到25ml PBS buffer中，現(xiàn)用現(xiàn)配。這是一種優(yōu)異
的表面活性劑、潤(rùn)濕及洗滌劑，破細(xì)胞膜，即在細(xì)胞膜上打孔，使抗體進(jìn)入。 (8)抗熒光淬滅封片液(Antifade mounting medium):購(gòu)自上海杰美基因公司。 (9)指甲油市場(chǎng)購(gòu)置。 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問(wèn)題 (1)抗體的活性決定了使用效果，如果抗體保存得當(dāng)，大部分抗體活性都可以維持
數(shù)月甚至數(shù)年。因此，買(mǎi)來(lái)的抗體要盡快分裝，分裝可以最大程度的降低反復(fù)凍融對(duì)抗體活
性的損害，同時(shí)也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(2)本發(fā)明用到的用于固定樣品的多聚甲醛試劑屬危險(xiǎn)化學(xué)品，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。多聚甲醛在冷水中不易溶解，配制時(shí)要放置在通風(fēng)櫥中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明
色)，冷卻至室溫后，倒入棕色瓶中，4t:保存待用。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于 (1)本發(fā)明檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，能 夠?qū)χ亟饘倜{迫后，細(xì)胞內(nèi)核仁C23蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行精確定位。其中的酶解是本實(shí)驗(yàn)關(guān) 鍵的步驟之一，酶解時(shí)間依細(xì)胞具體情況而定。例如在鏡檢時(shí)如果觀察到大部分細(xì)胞均分 散開(kāi)，成一層球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)解體，只剩下核時(shí)結(jié)束酶解。
(2)本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)的制片方法進(jìn)行了改革。酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然 后，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。這種方法減去了常規(guī)壓片中蓋 蓋片和揭片兩個(gè)步驟，避免了在這兩個(gè)步驟的操作中對(duì)細(xì)胞的損傷。 (3)本發(fā)明的檢測(cè)技術(shù)具有特異性高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，特別是對(duì)常規(guī)壓片方 法的改革，使操作步驟更加簡(jiǎn)便易行、大大提高了觀察細(xì)胞數(shù)目等優(yōu)點(diǎn)。該方法為研究重金 屬等逆境脅迫下對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的影響提供科學(xué)依據(jù)。為探討重金屬毒害細(xì)胞機(jī)理提供了 精確的檢測(cè)方法，其方法具有廣闊的應(yīng)用前景。 本發(fā)明通過(guò)免疫熒光定位技術(shù)，對(duì)重金屬脅迫后的核仁C23蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行精 確定位。我們利用上述方法已經(jīng)觀察了在A1、 Cd、和Pb脅迫下，洋蔥和蠶豆根尖細(xì)胞中核 仁C23蛋白質(zhì)的變化，取得了很好的結(jié)果。


圖1包括 圖示A1-A3為未經(jīng)重金屬脅迫的細(xì)胞中核仁C23蛋白質(zhì)的分布。其中Al :橙紅色 熒光顯示C23蛋白；A2 :藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ;A3 :合成圖。 圖示B-C為重金屬脅迫后細(xì)胞中核仁C23蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位。B、C顯示細(xì)胞 核中的C23蛋白在重金屬的脅迫下外溢到細(xì)胞質(zhì)中，并隨著重金屬處理濃度的升高和處理 時(shí)間的延長(zhǎng)，C23蛋白量逐漸增多。其中 Bl :橙紅色熒光顯示C23蛋白；B2 :藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ;B3 :合成圖；
Cl :橙紅色熒光顯示C23蛋白；C2 :藍(lán)色熒光顯示細(xì)胞核(DNA) ;C3 :合成圖； 圖2為銀染(AgN03染色)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。未經(jīng)重金屬脅迫的細(xì)胞核仁呈深棕色(圖 2a)。 CcT處理后，發(fā)現(xiàn)一些與核仁銀染反應(yīng)相同的細(xì)小顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖2b)。這 些銀染顆粒的數(shù)量隨著CcT濃度升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增多(圖2c)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例用來(lái)幫助理解本發(fā)明，并且不用于也不應(yīng)被解釋為以任何方式對(duì)
所列出的權(quán)利要求中發(fā)明的限制。特別加以說(shuō)明的是，本發(fā)明所用到的各種試劑均有市售。
實(shí)施例1 材料培養(yǎng)以蠶豆為例蠶豆主(側(cè))根根長(zhǎng)約1.5cm時(shí)，用10 ii M、50 ii M、 100 ii M 的AP處理24h、48h、72h。 (1)切取重金屬處理后的蠶豆植物根尖分生組織細(xì)胞，于4%多聚甲醛中固定2h ; 經(jīng)PBS緩沖液洗；
(2)采用2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶酶液于37。C溫箱酶解；經(jīng)PBS緩沖液洗滌 后壓片； (3)將蠶豆植物根尖轉(zhuǎn)至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀 態(tài)，用滴管吸取約O. lml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干后備 用； (4)將(3)得到的載玻片放在1 % TritonX-100浸泡15分鐘；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(5)在(4)得到的載片上滴入15 配好的一抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育lh ; 再經(jīng)PBS緩沖液洗滌； (6)再將(5)得到的載片上滴入15iU配好的二抗，蓋上蓋玻片，37。C溫箱孵育 45min-lh ;經(jīng)PBS緩沖液洗滌； (7)再將(6)的載玻片上滴加15 1 DAPI，蓋上蓋玻片；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；
(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5 1防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指 甲油將蓋玻片四周封好，lh后在熒光顯微鏡下觀察。 (9)熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 熒光顯微鏡觀察，Pixera Pro 600CL CCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的 后期處理利用Photoshop 7.0軟件排版。C23蛋白由TRITC標(biāo)記，藍(lán)光450 490nm激發(fā)， 呈紅色熒光(見(jiàn)圖1中A1，B1，C1)，細(xì)胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激發(fā)，呈藍(lán)色 熒光(見(jiàn)圖1中A2， B2， C2)。圖1中A3， B3， C3為合成圖。
實(shí)施例2 材料培養(yǎng)以大蒜為例，大蒜不定根根長(zhǎng)約l. 5cm時(shí)，用10iiM、50iiM、100iiM的Pb"
處理24h、48h、72h。 實(shí)驗(yàn)步驟 (1)切取重金屬處理后的根尖約2mm，于4%多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩沖液(pH7. 0)中洗3次(每次10分鐘)。 (3)2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶，371:溫箱酶解，在酶解過(guò)程中隨時(shí)鏡檢，直到有
大量的球形原生質(zhì)體產(chǎn)生結(jié)束酶解。 (4) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (5)將根尖轉(zhuǎn)至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約O. 2ml樣品液，均勻涂于載片上分 散成單個(gè)細(xì)胞，不蓋蓋玻片，用記號(hào)筆在載片的無(wú)樣品面標(biāo)記，自然風(fēng)干后備用。
(6)將要標(biāo)記的切片放在1% Triton X-100中抽提20min。
(7) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (8)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，用經(jīng)PBS稀釋的一抗(鼠抗C23單克隆抗體，
工作濃度i : 150)37t:孵育lh或4t:孵育過(guò)夜。 (9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (10)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 ii 1)配好的二抗(山羊抗鼠IgG， 工作濃度l : 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育45min-lh。
(ll)PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (12)DAPI染色用濾紙吸干多余 PBS緩沖液，滴一滴(20 iU)DAPI，蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (14)用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(10 iU)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻 片，用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。 (15)熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 熒光顯微鏡觀察，Pixera Pro 600CL CCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的 后期處理利用Photoshop 7. 0軟件排版。C23蛋白由TRITC標(biāo)記，藍(lán)光450 490nm激發(fā)， 呈紅色熒光(見(jiàn)圖1中A1，B1，C1)，細(xì)胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激發(fā)，呈藍(lán)色 熒光(見(jiàn)圖1中A2， B2， C2)。圖1中A3， B3， C3為合成圖。
實(shí)施例3 洋蔥根尖細(xì)胞中核仁C23蛋白質(zhì)的變化材料培養(yǎng)以洋蔥為例洋蔥不定根根長(zhǎng)約1.5cm時(shí)，用10iiM、50iiM、100iiM的 CcT處理24h、48h、72h。
實(shí)驗(yàn)步驟 (1)切取重金屬處理后的根尖約2mm，于4X多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩沖液(pH7. 0)中洗3次(每次15分鐘)。 (3)2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶，371:溫箱酶解，在酶解過(guò)程中隨時(shí)鏡檢，直到有
大量的球形原生質(zhì)體產(chǎn)生結(jié)束酶解。 (4) PBS緩沖液洗3次(每次15分鐘)。 (5)將根尖轉(zhuǎn)至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約O. lml樣品液，均勻涂于載片上分 散成單個(gè)細(xì)胞，不蓋蓋玻片，用記號(hào)筆在載片的無(wú)樣品面標(biāo)記，自然風(fēng)干后備用。
(6)將要標(biāo)記的切片放在1% Triton X-100中抽提20min。 [cm3] (7)PBS緩沖液洗3次(每次15分鐘)。 (8)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，用經(jīng)PBS稀釋的一抗(鼠抗C23單克隆抗體，
工作濃度i : 150)37t:孵育lh或4t:孵育過(guò)夜。 (9)PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (10)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20iU)配好的二抗(山羊抗鼠IgG， 工作濃度l : 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育45min。
(11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (12)DAPI染色用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20iU)DAPI蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (14)用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(lOiU)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻 片，用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。 (15)熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 熒光顯微鏡觀察，Pixera Pro 600CL CCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的 后期處理利用Photoshop 7. 0軟件排版。C23蛋自由TRITC標(biāo)記，藍(lán)光450 490nm激發(fā)， 呈紅色熒光(見(jiàn)圖1中Al，Bl，Cl)，細(xì)胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激發(fā)，呈藍(lán)色 熒光(見(jiàn)圖1中A2， B2， C2)。圖1中A3， B3， C3為合成圖。
實(shí)施例4
銀染技術(shù)(Ag-N0R染色技術(shù))與本發(fā)明技術(shù)的比較試驗(yàn) 銀染原理Ag-NOR染色技術(shù)能夠特異地與細(xì)胞中核仁形成區(qū)(NOR)染色。當(dāng)位于 此處的18S、28S核糖體RNA的基因(rDNA)具有轉(zhuǎn)錄活性時(shí)，應(yīng)用銀染技術(shù)可使NOR特異性 著色(棕黃色)。現(xiàn)已進(jìn)一步證明銀染物質(zhì)不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區(qū)特異 的蛋白質(zhì)，即和rRNA轉(zhuǎn)錄相聯(lián)系的酸性蛋白。 材料培養(yǎng)以蠶豆為例，蠶豆根長(zhǎng)約1.5cm時(shí)，用10iiM、50iiM、100iiM的Ccf+處理
24h、48h、72h。 實(shí)驗(yàn)步驟 (1)切取重金屬處理后的根尖約2mm，于固定液(酒精醋酸=3 : 2)中固定lh。
(2)無(wú)離子水中洗3次(每次10分鐘)。 (3)置于6(TC恒溫水浴鍋中，用水解液(1NHC1 :酒精醋酸=5:3:2)水解 9min。 (4)無(wú)離子水中洗3次(每次10分鐘)。 (5)根尖用45%乙酸壓片，室溫下干燥過(guò)夜，揭片。 (6)在干燥切片上加入1滴2 %明膠溶液和2滴50 % AgN03水溶液，混勻，加蓋片，
室溫下浸染。 (7)待核仁呈棕黃色、細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色時(shí)，用蒸餾水將染色液淋洗干凈。
(8)在0. 001%亞甲基蘭水溶液復(fù)染，至染色質(zhì)呈綠色。
(9)用蒸餾水將染色液淋洗干凈，室溫下干燥。
(10)光學(xué)樹(shù)脂封片，顯微鏡下觀察。 (11)顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用VANOX-AHB型Olympus顯微鏡(日本) 觀察，Pixera Pro 600CL CCD數(shù)碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的后期處理利 用Photoshop 7. 0軟件排版。經(jīng)AgN03染色，核仁呈棕黃色、細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色，染色體由亞 甲基蘭染色，呈綠色(見(jiàn)圖2)。 銀染實(shí)驗(yàn)結(jié)果未經(jīng)重金屬脅迫的細(xì)胞核仁呈深棕色(圖2a)。 CcT處理后，發(fā)現(xiàn) 一些與核仁銀染反應(yīng)相同的細(xì)小顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖2b)。這些銀染顆粒的數(shù)量隨著 CcT濃度升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增多(圖2c)。 采用本發(fā)明的方法測(cè)定及結(jié)果未經(jīng)重金屬脅迫的細(xì)胞中核仁C23蛋白質(zhì)位于核 仁內(nèi)(圖1A)。重金屬脅迫后細(xì)胞中核仁C23蛋白分布在核質(zhì)(圖1B)，并進(jìn)一步外溢到細(xì) 胞質(zhì)中(圖1C)。
兩種實(shí)驗(yàn)方法的比較 利用銀染技術(shù)研究對(duì)重金屬對(duì)植物細(xì)胞核仁結(jié)構(gòu)的影B向，具有一定的科學(xué)價(jià)值。 但是，銀染技術(shù)只能鑒定重金屬脅迫后，從細(xì)胞核外溢到細(xì)胞質(zhì)中的銀染顆粒是核仁中嗜 銀的酸性蛋白，不能鑒定是哪些種核仁蛋白受到重金屬脅迫的影響，對(duì)深入研究重金屬毒 害機(jī)理有一定的局限性。 本發(fā)明通過(guò)免疫熒光定位技術(shù)，對(duì)重金屬脅迫后的核仁C23蛋白質(zhì)的變化進(jìn)行精 確定位，具有特異性高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)一步深入檢測(cè)重金 屬對(duì)具體的核仁結(jié)構(gòu)成分造成的影響。該方法為研究重金屬等逆境脅迫下對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì) 的影響提供科學(xué)依據(jù)，為探討重金屬毒害細(xì)胞機(jī)理提供了精確的檢測(cè)方法，其方法具有廣闊的應(yīng)用前景。 在詳細(xì)說(shuō)明的較佳實(shí)施例之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述 申請(qǐng)專(zhuān)利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所 作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說(shuō)明 書(shū)中所舉實(shí)例實(shí)施方式的限制。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法，其特征在于，按如下的步驟進(jìn)行(1)切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細(xì)胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；經(jīng)PBS緩沖液洗；(2)采用2.5％纖維素酶+2.5％果膠酶酶液于37℃溫箱酶解；經(jīng)PBS緩沖液洗滌后壓片；(3)將植物根尖轉(zhuǎn)至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數(shù)細(xì)胞游離狀態(tài)，用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干后備用；(4)將(3)得到的載玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分鐘；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(5)在(4)得到的載片上滴入15-20μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h-1.5h；再經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(6)再將(5)得到的載片上滴入15-20μl配好的二抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育45min-1h；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(7)再將(6)的載玻片上滴加15-20μl DAPI，蓋上蓋玻片；經(jīng)PBS緩沖液洗滌；(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1-2h后在熒光顯微鏡下觀察。
2. 權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中步驟(2)中酶解所用時(shí)間是指在鏡檢時(shí)如果觀察到大部分細(xì)胞均分散開(kāi)，成一層球形原生質(zhì)體，其中少量細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)已經(jīng)解體，只剩下細(xì)胞核時(shí)，即結(jié)束酶解。
3. 權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中步驟(2)中所述的壓片是指酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴在載玻片上，不蓋蓋玻片，自然風(fēng)干后備用。
4. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中所述的PBS緩沖液洗是指采用PBS緩沖液洗3次，每次10-15分鐘。
5. 權(quán)利要求l所述的檢測(cè)方法，其中的一抗為鼠抗C23單克隆抗體，其濃度為0. 2mg/ml。
6. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中的二抗為T(mén)RITC-山羊抗鼠IgG其濃度為1. 5mg/ml。
7. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中DAPI的濃度為1 y g/ml。
8. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中的防淬滅劑為10Xlml。
9. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中的重金屬為Al、As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb或Zn。
10. 權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中所述的植物細(xì)胞包括蠶豆、洋蔥、大蒜、或玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)重金屬脅迫下植物細(xì)胞核仁C23蛋白質(zhì)定位的免疫熒光方法。它是切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細(xì)胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個(gè)細(xì)胞，標(biāo)記后自然風(fēng)干，放在1％TritonX-100浸泡15分鐘；然后滴入15μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，處理后滴加15μl DAPI，最后滴加5μl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1h后在熒光顯微鏡下觀察。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有特異性高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了觀察細(xì)胞數(shù)目等特點(diǎn)。該方法為探討重金屬毒害細(xì)胞機(jī)理提供了精確的檢測(cè)方法，其檢測(cè)方法具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N1/28GK101782573SQ20101003132
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者劉東華, 張慧敏, 張閃閃, 秦蓉 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)