專利名稱：大麻使用的檢測的制作方法
大麻使用的檢測發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了增強(qiáng)用于檢測大麻使用的免疫測定的方法。特別地，本發(fā)明涉及結(jié) 合伴侶，尤其是能夠結(jié)合四氫大麻酚(THC)和抗-THC-抗體之間的免疫復(fù)合物的抗體片段。 本發(fā)明還涉及包含該結(jié)合伴侶的測試試劑盒，以及所述結(jié)合伴侶用于檢測大麻使用的用 途。此外，本發(fā)明涉及免疫測定，其中使用了所述結(jié)合伴侶。再進(jìn)一步，本發(fā)明涉及編碼所 述結(jié)合伴侶的多核苷酸，和能夠表達(dá)該多核苷酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的
背景技術(shù)：
藥物濫用是個(gè)嚴(yán)重的威脅，尤其是對交通安全，并且因此已經(jīng)研發(fā)了各種試驗(yàn)用 于方便地測試濫用的藥物。這些測試中的許多是免疫測定，并且大部分是競爭性免疫測 定，其特異性通常低于非競爭性的免疫測定。Kerrigan和fillips已經(jīng)例如比較了 12 個(gè)可購得的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)，這些ELISA用于全血和尿液中的鴉片、脫氧麻黃 堿、古柯堿代謝產(chǎn)物、苯環(huán)己哌啶和大麻素(Kerrigan S.，&Phillips，W.，2001 Clinical Chemistry 47(3) :540-547)。測試形式是競爭性免疫測定，并且結(jié)果并不完全令人滿意，產(chǎn) 生了一些假的結(jié)果和不利的交叉反應(yīng)性。不僅可以從血液或尿液，而且可以從唾液測定藥物濫用，這是選擇用于路邊測試 的測試基質(zhì)。Lo Muzio等測試了用于檢測尿液中藥物的商業(yè)快速免疫篩選，并比較了兩種 生物基質(zhì)非常規(guī)的生物基質(zhì)，唾液，和傳統(tǒng)的生物基質(zhì)，尿液。他們發(fā)現(xiàn)唾液樣本在用于大 麻、THC、苯化重氮和三環(huán)抗抑郁藥的免疫學(xué)試驗(yàn)中是陰性的，盡管氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS) 分析揭示了其的低濃度，并且推斷在與唾液一起使用之前，必須改進(jìn)測試試劑盒(Lo Muzio L.等，2005, Int J ImmunopatholPharmacol. 18(3) :567-573)。WO 2004/046733公開了用于測定小分析物，如濫用的藥物的非競爭性免疫測定。 該測定使用了分析物特異性的一級抗體，一級抗體和分析物之間的免疫復(fù)合物(IC)特異 性的二級抗體和分析物，以提高測定的靈敏性和特異性。所用的抗-IC抗體通過下列方法 獲自天然人抗體片段噬菌體展示文庫用結(jié)合的一級抗體預(yù)培養(yǎng)展示噬菌體來挑選結(jié)合一 級抗體本身的那些，然后分離未結(jié)合的噬菌體并用分析物和固定的一級抗體的混合物培養(yǎng) 以選擇結(jié)合固定的一級抗體和分析物之間形成的免疫復(fù)合物但不結(jié)合抗體本身的噬菌體。 對于確定唾液中的嗎啡，獲得了非常好的結(jié)果。Δ 9-四氫大麻酚(Δ 9-THC)是大麻的母體藥物，并且其快速代謝成可以在尿液中 確定的ll-nor-A9-THC-C00H或11-0H-A9-THC。因此，優(yōu)選通過測定唾液中的A9_THC來 檢測大麻的使用，這是比當(dāng)在尿液中檢測該代謝產(chǎn)物時(shí)更好的最近使用的指示。然而，已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)對于這種分析物難以研發(fā)出快速測試，并且市場上的測試試劑盒還不夠靈敏。US 6，326，159 和 Ullman 等，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. 90 :1184-1189 描述了使 用用于增強(qiáng)一級抗體的親和性和特異性的抗-IC-抗體的免疫測定。在這些論文中，已經(jīng)研 發(fā)了第二種抗-IC抗體，其結(jié)合與分析物相結(jié)合的第一種抗分析物抗體，但是其不結(jié)合單 獨(dú)的一級抗體或分析物。公開了識別抗體與四氫大麻酚(THC)的免疫復(fù)合物的抗體。通過 以下方法獲得抗-IC抗體使用親和性標(biāo)記的抗-THC抗體作為免疫原并選擇其結(jié)合通過Δ 9THC的存在而增強(qiáng)的抗-IC抗體。觀察到與例如THC-代謝產(chǎn)物的一些交叉反應(yīng)性，這在 法醫(yī)藥物分析中是不利的。通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)制備了抗體，這使得它們太大，以致不能應(yīng) 用于同源性免疫測定中。Kintz P.等測試了用于測試唾液中藥物的商業(yè)藥物裝置，并將結(jié)果與GC-MC分 析結(jié)果相比較，并且發(fā)現(xiàn)該測試裝置鑒定出只有一位暴露于THC的駕駛員，而18位駕駛 員使用GC-MC被測試為陽性的。他們推斷目前使用這種樣本用于路邊測試的局限在于 缺少檢測足夠低濃度的母體化合物(THC)的合適免疫測定(Kintz P.等，2005. J. Anal. Toxicol. 29(7) :724-727)。目前用于確定大麻使用的免疫測定不令人滿意，大概是由于低特異性和靈敏度。 因此，仍然需要容易、快速和可靠的用于大麻使用的藥物測試，其可以用于，例如，路邊測 試，并優(yōu)選用于分析口腔流體樣本，這是非入侵性的、易于進(jìn)行，并可以在嚴(yán)密監(jiān)督下進(jìn)行。 本發(fā)明滿足了這些需求中的至少一部分。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種新的試劑，其有助于快速而可靠地檢測大麻使用。該試劑是能 夠特異性識別大麻素和抗-大麻素之間形成的免疫復(fù)合物的蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明提 供了包含抗體輕鏈和重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的結(jié)合伴侶，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO 3的氨基酸23-35、51-57和93-100的氨基酸序列，并且所述重鏈區(qū)具有SEQ IDNO 4的 氨基酸四-35、50-60和99-109的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含結(jié)合伴侶的測試試劑盒，以及結(jié)合伴侶用于檢測獲自待 測試已經(jīng)使用大麻的人的身體樣本中的大麻素的用途。由于高特異性和靈敏度，并且優(yōu)選 小尺寸，結(jié)合伴侶尤其適于非競爭性同源性免疫測定，這可以例如在路邊用于測試懷疑使 用大麻的駕駛員的唾液。再進(jìn)一步，本發(fā)明提供了用于檢測獲自身體的樣本中的分析物的免疫測定，由此 將樣本與試劑對反應(yīng)，該試劑對包含特異性結(jié)合分析物的第一結(jié)合伴侶和特異性結(jié)合分 析物和第一結(jié)合伴侶的復(fù)合物的第二結(jié)合伴侶，并且測定第二結(jié)合伴侶與所述復(fù)合物的結(jié) 合，由此表明樣本中分析物的存在，其中所述分析物是大麻素，并且所述第二結(jié)合伴侶包含 抗體輕鏈和重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO :3的氨基酸23-35、 51-57和93-100的氨基酸序列，并且所述重鏈區(qū)具有SEQ ID NO 4的氨基酸四-35、50_60 和99-109的氨基酸序列。此外，本發(fā)明提供了編碼結(jié)合伴侶的多核苷酸，和能夠表達(dá)結(jié)合伴侶的宿主細(xì)胞。 該多核苷酸是DNA或RNA。在從屬權(quán)利要求中列出了本發(fā)明的有利實(shí)施方案。本發(fā)明的其他目的、詳細(xì)內(nèi)容和優(yōu)點(diǎn)將從以下的附圖、詳述和實(shí)施例中變得清楚。附圖簡述

圖1顯示了抗-THC T3Fab輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)，和抗-THC T3 Fab VH-CHl重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。顯示了所述免疫球蛋白鏈各自的三個(gè)互補(bǔ)決定 區(qū) CDR1、CDR2 和 CDR3。圖2顯示了抗-T3+THC免疫復(fù)合物Fab 104輕鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO 3)， 和抗-T3+THC免疫復(fù)合物Fab 104重鏈的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。顯示了所述免疫球蛋白鏈各自的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3。圖3顯示了抗-THC T3 Fab結(jié)合抗-T3+THC免疫復(fù)合物Fab 104用于各種藥物和 藥物代謝產(chǎn)物獲得的THC TR-FRET測試結(jié)果。詳述大麻素是在大麻植物Cannabis sativa中發(fā)現(xiàn)的萜烯酚分子的總稱。更常見地， 其包括一組在結(jié)構(gòu)上與四氫大麻酚(THC)相關(guān)并結(jié)合大麻素受體的分子。THC是大麻的主 要心理活性大麻素，并且與Δ 9-四氫大麻酚(Δ9-ΤΗΟ和D9-四氫大麻酚(D9-THC)同義， 在此這些全部可以互換使用。THC在體內(nèi)代謝成ll-nor-D9-THC-C00H和11-0H-D9-THC，這 是其他大麻素的實(shí)例。本發(fā)明的結(jié)合伴侶特異性地識別THC和抗-THC之間的免疫復(fù)合物， 由此與代謝產(chǎn)物的反應(yīng)明顯較低。本發(fā)明的結(jié)合伴侶可以用于檢測樣本的THC的夾層試驗(yàn)中，由此將樣本與試劑對 反應(yīng)，該試劑對包含特異性結(jié)合THC的第一結(jié)合伴侶，和第二結(jié)合伴侶，其能夠特異性識別 THC和抗-THC之間的免疫復(fù)合物，并且其是本發(fā)明的結(jié)合伴侶。第二結(jié)合伴侶與第一結(jié)合 伴侶和THC之間的免疫復(fù)合物的結(jié)合指示樣本中存在THC。如在此所用的“結(jié)合伴侶”通常是蛋白質(zhì)或多肽，如包括具有所需結(jié)合特性的抗體 片段的抗體?？贵w是免疫球蛋白分子并且屬于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD中的任何一類；IgG 和IgM是最常用的。優(yōu)選，結(jié)合伴侶是包含配體-結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段，如Fab或scFv片 段。稱為Fab片段的片段(抗原結(jié)合片段)由通過二硫化物橋鍵連接免疫球蛋白重鏈的可 變和第一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白輕鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域組成。Fv (可變結(jié)構(gòu)域)意 思是負(fù)責(zé)配體結(jié)合的免疫球蛋白分子的可變區(qū)。ScFv (單鏈Fv)意思是其中抗體的重鏈和 輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域通過肽連接的分子，以從單鏈mRNA分子合成形成單個(gè)多肽鏈。免疫球蛋 白重鏈和輕鏈的可變區(qū)一起負(fù)責(zé)配體結(jié)合。配體是結(jié)合伴侶結(jié)合的物質(zhì)，對于抗體，其是抗 原或半抗原。使用重組噬菌體展示文庫可以方便地制備結(jié)合伴侶，例如，如WO 2004/046733中 所述的。當(dāng)已經(jīng)選擇第一結(jié)合伴侶時(shí)，其與其配體復(fù)合，并將該復(fù)合物用于從推薦文庫中選 擇第二結(jié)合伴侶。將沒有使用配體的第一結(jié)合伴侶用作反選擇。第二結(jié)合伴侶應(yīng)當(dāng)只識別 復(fù)合物，而不是識別第一結(jié)合伴侶，也不是識別游離抗原，不管是任何顯著的程度?？梢酝ㄟ^將免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域編碼cDNA克隆至合適的噬菌體展示載體中來構(gòu)建 噬菌體展示抗體文庫。將編碼百萬個(gè)抗體片段變體的DNA成批克隆至作為噬菌體外殼蛋白 一部分的載體中。通過在細(xì)菌中轉(zhuǎn)化載體可以獲得含有百萬個(gè)具有不同特異性的抗體片段 的大文庫。細(xì)菌的培養(yǎng)導(dǎo)致噬菌體展示抗體片段在其表面上的表達(dá)。在噬菌體基因組中 攜帶所展示抗體的基因，由此將基因型和表現(xiàn)型聯(lián)系起來。所展示蛋白及其DNA之間的物 理聯(lián)系使得可以通過稱為淘選(panning)的簡單體外選擇程序來篩選大量蛋白質(zhì)變體，各 自與其對應(yīng)的DNA相關(guān)。以其最簡單的形式，可以通過用已經(jīng)固定于載體上的目標(biāo)配體培 養(yǎng)噬菌體展示變體的集合來進(jìn)行淘選，并通過破壞與配體的結(jié)合來洗脫特異性結(jié)合的噬菌 體。然后洗脫的噬菌體在體內(nèi)擴(kuò)增。將該過程重復(fù)幾次，使得有利于最緊密集合序列的噬 菌體集合逐步富集。在約3至6輪選擇和擴(kuò)增后，將最好的克隆測序并轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中， 用于進(jìn)一步表達(dá)。宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞，例如，酵母、動(dòng)物、植物或昆蟲細(xì)胞或細(xì) 菌細(xì)胞。甚至可以是雜交瘤細(xì)胞，其在轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生重組單克隆抗體。重組結(jié)合伴侶或至少其一部分也可以合成產(chǎn)生。包含識別大麻素的第一結(jié)合伴侶和識別大麻素和所述第一結(jié)合伴侶之間的免疫 復(fù)合物的第二結(jié)合伴侶的試劑對使得用于大麻素的非競爭性夾層測定是可行的?？梢酝ㄟ^ 全部標(biāo)準(zhǔn)免疫測定來檢測夾層。一種伴侶可以固定于載體上，如微滴定孔或珠子。在分析 物和另一種結(jié)合伴侶的存在下形成夾層。例如，通過使用二級抗體或通過標(biāo)記至少一種結(jié) 合伴侶來檢測夾層。標(biāo)記可以是任何常規(guī)標(biāo)記，如放射活性標(biāo)記、酶或熒光化合物。該測定 可以是例如ELISA或FIA。包含本發(fā)明結(jié)合伴侶的試劑對很大的優(yōu)點(diǎn)在于其能夠進(jìn)行同源性免疫測定，即， 在溶液中進(jìn)行免疫測定。省去了固定和洗滌步驟使得試驗(yàn)非常簡單。同源性試驗(yàn)給路邊測 試提供了卓越且方便的工具，例如，由警察在抽查駕駛員等時(shí)使用。本發(fā)明提供的免疫測定 比目前市場上的競爭性測定靈敏高達(dá)10倍。待分析的樣本可以是任何流體樣本，如血液、 血清或尿液，但優(yōu)選是口腔流體，如唾液。分析物優(yōu)選是THC。優(yōu)選的同源性免疫測定是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的一種試驗(yàn)，對于綜述， 參見Sz61Hisi J 等，1998，Communications inClinical Cytometry，34 159-179。在 FRET 中，通過分子間的偶極子-偶極子偶聯(lián)，能量從熒光團(tuán)分子(供體)激發(fā)至高能量狀態(tài)并且 轉(zhuǎn)移至另一個(gè)熒光團(tuán)(受體)。這只有供體和受體之間的距離短(lo-iooAj以及供體的 熒光光譜和受體的吸收光譜部分重疊時(shí)才有可能。然后作為熒光變化來檢測能量轉(zhuǎn)移。通 常利用時(shí)間分辯熒光(Hemmila I.等，1988，Clin. Chem. 34 :2320-2322)。通過用形成FRET供體-受體對的熒光團(tuán)來標(biāo)記兩種結(jié)合伴侶(其優(yōu)選是抗體片 段)，可以將FRET應(yīng)用于本發(fā)明。當(dāng)結(jié)合伴侶和分析物是小的時(shí)候，熒光團(tuán)變得非常近，并 且獲得了可測量的FRET信號?；蛘?，用于大麻使用的免疫測定可以是例如常規(guī)的在微滴定孔中的夾層測試或側(cè) 流測試。本發(fā)明的結(jié)合伴侶可以包括在測試試劑盒中，其可以進(jìn)一步含有試驗(yàn)需要的任何 其他試劑和使用說明書。優(yōu)選，測試試劑盒還含有用于結(jié)合分析物的第一結(jié)合伴侶。更優(yōu) 選，所述結(jié)合伴侶包含抗體輕鏈和重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO 1的氨基酸M-35、51-57和90-98的氨基酸序列，所述重鏈區(qū)具有SEQID NO 2的氨基 酸27-36、51-66和99-107的氨基酸序列。優(yōu)選，測試試劑盒包含用于進(jìn)行非競爭性的同源 性試驗(yàn)的試劑，如例如，TR-FRET測試需要的試劑。試劑盒進(jìn)一步包含反應(yīng)溶液、緩沖劑、洗 滌溶液和檢測工具，如標(biāo)記物和任選的熒光團(tuán)。測試的性能可以使得試劑在微滴定平板的孔中，并加入連續(xù)稀釋的樣本。在優(yōu)選 的模式下，例如，用于警察領(lǐng)域使用，試劑是在容器中的干燥形式。加入唾液，其溶解了試劑 并且可以閱讀結(jié)果，而不需要進(jìn)一步處理。優(yōu)選，測試試劑盒包含用于測定多重藥物濫用的試劑，如用于測定，例如，嗎啡、可 待因、海洛因、安非他明、甲基苯丙胺、古柯堿、巴比妥酸鹽和苯并二氮。在這種情況下，測試 試劑盒可以包含物理上彼此分開的多重試劑對，例如，以微矩陣的形式，由此可以從單個(gè)唾 液樣本中同時(shí)測試多重藥物。本發(fā)明的結(jié)合伴侶包含具有SEQ ID NO 3的抗體輕鏈的三個(gè)⑶R和具有SEQ ID NO 4的抗體重鏈的三個(gè)CDR。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，該結(jié)合伴侶包含完整的可變區(qū)，即，所述輕鏈(VL)和重鏈(VH)的配體-結(jié)合部分。因此，其可以含有SEQ ID NO 3的氨基 酸1-111和SEQ ID NO :4的氨基酸1-120。特別地，所述結(jié)合伴侶包含SEQ ID N0:3和NO: 4的氨基酸序列。相應(yīng)地，第一結(jié)合伴侶包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的完整可變區(qū)， 即，SEQ ID NO :1的氨基酸1-108 JPSEQ ID NO :2的氨基酸1-118。特別地，其包含SEQ ID NO :1和NO 2的氨基酸。在說明書和權(quán)利要求中列出的任一個(gè)序列或子序列的小變化或改 進(jìn)仍然在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要它們沒有影響蛋白質(zhì)的結(jié)合活性。這樣的變化和改進(jìn)特別 包括保守性氨基酸取代。通過以下非限制性實(shí)施例說明了發(fā)明。實(shí)施例1抗-THCFab 的研發(fā)用弗氏佐劑中的THC綴合BSA(Fitzgerald)將小鼠免疫，并在第二次強(qiáng)化后測試 血清樣本，并且將在直接ELISA中顯示出最佳對抗抗原應(yīng)答的小鼠選定為抗體噬菌體展示 文庫的來源。如W02004/046733中所述的，構(gòu)建抗體片段噬菌體展示文庫，將THC-特異性 噬菌體富集，并將單個(gè)克隆的Fab基因片段分離、表達(dá)和表征。選擇抗-THC T3 Fab，用于進(jìn)一步測定。將抗-THC T3 Fab輕鏈的氨基酸序列列為SEQ ID N0:1，抗-THCT3 Fab VH-CH1鏈 的氨基酸序列列為SEQ ID NO :2。Fab輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3對應(yīng)于SEQ ID NO 1的 氨基酸24-35、51-57和90-98。Fab重鏈的CDR1、CDR2和CDR3對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基 酸27-36、51-66和99-107。SEQ ID N0:1的第1-108號氨基酸表示輕鏈可變區(qū)，而SEQ ID NO 2的第1-118號氨基酸表示重鏈可變區(qū)。SEQ ID NO=I的第109-215號氨基酸表示小鼠 κ輕鏈的恒定區(qū)，和SEQ ID NO 2的第119-221號氨基酸表示小鼠重量的恒定CH1區(qū)。圖 1中還顯示了抗-THC T3 Fab的氨基酸序列。實(shí)施例2抗-THC Fab和THC的免疫復(fù)合物的抗-免疫復(fù)合物抗體的研發(fā)從天然人scFv噬菌體展示文庫選擇免疫復(fù)合物特異性抗體用ImmunoRire Sulfo-NHS-LC-生物素試劑盒(Pierce)將 T3Fab 片段生物素化。 將生物素化抗體純化，并用Econo-Pac IODG柱(Bio-Rad，CA, USA)將緩沖劑換成PBS。用 10 μ 1抗生蛋白鏈菌素覆蓋的磁性珠(Dynal，Μ-280)和0. 5 μ g生物素化T3 Fab將BSA/ PBS中的200 μ 1天然scFv噬菌體展示文庫(κ或λ輕鏈)在+4 °C下預(yù)培養(yǎng)過夜。從集合 的50名健康個(gè)體的淋巴細(xì)胞構(gòu)建天然人scFv噬菌體展示文庫。估計(jì)文庫的大小為IxlO8 克隆。天然人scFv噬菌體展示文庫含有IgM特異性Vh-基因，結(jié)合κ或λ特異性基 因。從珠子分離出未結(jié)合的噬菌體，并用IOOng THC、500ng生物素化的T3 Fab和5 μ 1抗 生蛋白鏈菌素覆蓋的磁珠將100 μ 1噬菌體在振蕩器中在RT下培養(yǎng)1小時(shí)。以相似的方 式實(shí)施選擇程序的背景，但從結(jié)合反應(yīng)中省略了 THC。用0.5ml PBS將磁珠洗滌五次，并用 100 μ 1 HCl (ρΗ2. 2)將未結(jié)合的噬菌體洗脫30分鐘。用IM Tris中和洗脫的噬菌體并感染 Ε. coliXLl-藍(lán)細(xì)胞。按照WO 2004/046733所述的使細(xì)胞生長并將噬菌體純化。三次淘選 輪后，將洗脫噬菌體的量與背景對照孔的洗脫噬菌體的量相比，看到了富集。當(dāng)測試來自選 擇輪的洗脫噬菌體集合并分析單個(gè)scFV噬菌體克隆時(shí)，在噬菌體ELISA中也清楚地看到了 通過T3Fab和THC形成的免疫復(fù)合物的特異性結(jié)合劑的富集。
單個(gè)克隆的表征挑選單個(gè)特異性結(jié)合T3+THC復(fù)合物的scFv噬菌體克隆、測序、表達(dá)和測試。選 擇克隆104用于進(jìn)一步檢查。因?yàn)閟cFv傾向于在表達(dá)和純化過程中聚集，通過克隆人 λ輕鏈的基因區(qū)以及基因各自的IgGl CHl恒定區(qū)，將免疫復(fù)合物特異性克隆 104轉(zhuǎn)化成Fab片段。將含有六個(gè)組氨酸殘基的C-末端標(biāo)記物插入CHl的C-末端，用 于固定化金屬親和性色譜(IMAC)純化。將104Fab片段克隆至表達(dá)載體pKKtac中，并證 實(shí)序列。將抗-T3+THC免疫復(fù)合物Fab 104輕鏈的氨基酸序列列為SEQ ID NO 3, Fab VH-CHl-6His-Tag區(qū)的氨基酸序列列為SEQ ID NO :4。SEQ ID NO 3的第1-111號氨基酸 表示輕鏈的可變區(qū)，而SEQ ID NO :4的第1-120號氨基酸表示重鏈的可變區(qū)。SEQ ID NO: 3的第112-216號氨基酸表示人λ輕鏈的恒定區(qū)，而SEQID NO 4的第121-223號氨基酸 表示人重鏈CH1區(qū)的恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)C-末端的六個(gè)組氨酸殘基有助于通過固定化金 屬親和性色譜(IMAC)的Fab片段純化。104Fab的表達(dá)和純化將104 Fab片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E. coli)生產(chǎn)菌株RV308中。將細(xì)胞 接種于25ml含有100 μ g/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖的TB培養(yǎng)基中(酵母提取物12g/l， 大豆蛋白胨 24g/l,KH2P042. 31g/l，K2HP04 12. 54g/l，甘油 5g/l，ρΗ7· 1)，并在振蕩器上在 +37°C下培養(yǎng)過夜。從過夜培養(yǎng)物中，將6ml接種物加入兩個(gè)含有300ml TB的錐形瓶中，TB 中含有100 μ g/ml氨芐青霉素。將細(xì)胞在振蕩器上在+37°C下培養(yǎng)直至OD6tltl為4，此后將 0. 3ml IM IPTG和100 μ g/ml氨芐青霉素加入培養(yǎng)物中，然后將培養(yǎng)在振蕩器上+30°C下持 續(xù)過夜。將培養(yǎng)物培養(yǎng)基的上清液用于104 Fab片段的純化。將細(xì)胞在4000g和4°C下離 心20分鐘，并將上清液倒入干凈的燒瓶中。用ang/ml DNA酶I處理上清液以除去殘余的 染色體DNA，在+37°C下持續(xù)一小時(shí)。因?yàn)楸磉_(dá)的Fab 104在其C-末端具有6XHis_標(biāo)記， 可以通過固定化金屬親和性色譜(IMAC)純化。通過Ni2+螯合瓊脂糖(AmershamPharmacia Biotech)純化 Fab 104。用 SDS-PAGE 檢查 Fab 104 的純度。實(shí)施例3用于THC的同源性時(shí)間分辯熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)免疫測定通過LANCE Eu-ffl024 ITC螯合物試劑盒(Wallac)，用銪標(biāo)記抗-THC Fab片段T3。 將標(biāo)記的T3的緩沖液換成50mM Tris, ρΗ7· 8,0. 9% NaCl。通過Alexa Fluor蛋白質(zhì)標(biāo)記 試劑盒(MolecularProbes, Inc.)，用 Alexa Fluor 647 標(biāo)記抗-T3+THC 免疫復(fù)合物 Fab 片 段 104。將1 μ g Eu標(biāo)記的抗-THC T3Fab和1. 5 μ g Alexa Fluor 647標(biāo)記的抗免疫復(fù) 合物Fab 104加入到微滴定孔的60 μ 1唾液中。將用0,3. 75,7. 5、15、30、60和120ng/ ml的藥物刺激的40 μ 1唾液樣本加入到孔中，這些藥物為D9-THC、11-0H-D9-THC、 ll-nor-D9-THC-C00H、海洛因和安非他命。簡短混合后，通過Victor V熒光計(jì)(Perkin Elmerffallac)測量時(shí)間分辯熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)。結(jié)果顯示于圖3中。用THC刺激的唾液樣本產(chǎn)生了高熒光值，而THC代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了明顯較低的熒光 值，海洛因和嗎啡產(chǎn)生了接近從對照(標(biāo)記的T3和104片段，沒有任何添加的藥物)檢測 到的背景熒光的熒光值。Fabl04結(jié)合T3和THC之間形成的免疫復(fù)合物，具有非常高的特異 性和靈敏度。該測試能夠檢測遠(yuǎn)低于目前市場上快速測試的截留水平(唾液中20ng/ml)的 THC。 盡管已經(jīng)描述了用于提供本發(fā)明的試劑和測定的一種策略，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將 清楚多種改變和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.包含抗體輕鏈和重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的結(jié)合伴侶，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQID NO 3的氨基酸23-35、51-57和93-100的氨基酸序列，并且所述重鏈區(qū)具有SEQ ID NO 4 的氨基酸四-35、50-60和99-109的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合伴侶，其是抗體片段，優(yōu)選包含SEQIDNO :3的氨基酸1-111 和SEQ ID NO :4的氨基酸1-120，最優(yōu)選該片段是包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的Fab 104。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合伴侶，其特異性識別四氫大麻酚(THC)和抗-THC之間的免疫 復(fù)合物。
4.包含權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的結(jié)合伴侶的測試試劑盒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的測試試劑盒，進(jìn)一步包含另一種結(jié)合伴侶，其包含抗體輕鏈和重 鏈的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO :1的氨基酸對-35、51-57和90-98 的氨基酸序列，而所述重鏈區(qū)具有SEQ ID NO :2的氨基酸27-36、51-66和99-107的氨基酸 序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的測試試劑盒，包含用于非競爭性同源性免疫測定的試劑，優(yōu)選 用于時(shí)間分辯熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項(xiàng)的測試試劑盒，包含用于測定多重濫用藥物的試劑。
8.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的結(jié)合伴侶用于檢測取自待測試已經(jīng)使用大麻的人的身體樣 本中的大麻素的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中大麻素是THC。
10.用于檢測取自身體的樣本中的分析物的免疫測定，由此將樣本與試劑對反應(yīng)，該試 劑對包含特異性結(jié)合分析物的第一結(jié)合伴侶，和特異性結(jié)合分析物和第一結(jié)合伴侶的復(fù)合 物的第二結(jié)合伴侶，并測定第二結(jié)合伴侶與所述復(fù)合物的結(jié)合，由此指示樣本中分析物的 存在，其特征在于所述分析物是大麻素，并且所述第二結(jié)合伴侶包含抗體輕鏈和重鏈的互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQ ID NO 3的氨基酸23-35,51-57和93-100的氨 基酸序列，而所述重鏈區(qū)具有SEQ ID NO 4的氨基酸四-35、50-60和99-109的氨基酸序 列。
11.權(quán)利要求10的免疫測定，其是非競爭性的同源性免疫測定，優(yōu)選TR-FRET。
12.權(quán)利要求10或11任一項(xiàng)的免疫測定，其中待分析的樣本選自血液、尿液和口腔流體。
13.權(quán)利要求10的免疫測定，其中從唾液測定THC。
14.權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的免疫測定，其中第一結(jié)合伴侶包含抗體輕鏈和重鏈的互 補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，其中所述輕鏈區(qū)具有SEQID NO 1的氨基酸M_35、51_57和90-98的氨基 酸序列，而所述重鏈區(qū)具有SEQ ID NO 2的氨基酸27-36、51-66和99-107的氨基酸序列。
15.編碼權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的結(jié)合伴侶的多核苷酸。
16.能夠表達(dá)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的結(jié)合伴侶的宿主細(xì)胞。
全文摘要
公開了結(jié)合伴侶，尤其是特異性識別抗-THC和THC(四氫大麻酚)之間的抗原-抗體免疫復(fù)合物的抗體片段。結(jié)合伴侶有助于用于檢測大麻使用的非競爭性同源性免疫測定。還描述了包含該結(jié)合伴侶的測試試劑盒。優(yōu)選，將免疫測定應(yīng)用于路邊測試來自被懷疑駕駛員的唾液。
文檔編號G01N33/542GK102057277SQ200980121568
公開日2011年5月11日 申請日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者H·索德倫德, K·塔金納恩, T·普里 申請人:芬蘭技術(shù)研究中心