專利名稱：用于蛋白質(zhì)表征的高壓酶消化系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣泛地涉及分析方法和系統(tǒng)，更特別地涉及蛋白質(zhì)或者蛋白組學(xué)的大規(guī)模 分析。背景信息生物學(xué)中的現(xiàn)代科學(xué)方法已經(jīng)導(dǎo)致各種各樣的開(kāi)放技術(shù)例如基因組、蛋白組學(xué)、 代謝組學(xué)(metabolomics)，其已經(jīng)用于研究生物系統(tǒng)中的關(guān)聯(lián)和相互作用。這些方法和科 學(xué)研究還已經(jīng)大大地促進(jìn)臨床和生物技術(shù)分析的進(jìn)步。存在于這些科目中的問(wèn)題之一是制 備和處理樣品所需要的時(shí)間。雖然在減少分析時(shí)間方面已經(jīng)做出了各種進(jìn)步，但該工藝中 的關(guān)鍵瓶頸之一發(fā)生在樣品處理和制備周期期間。特別地，當(dāng)需要進(jìn)行大規(guī)模的研究和從 而大量樣品需要被處理時(shí)，更是如此。雖然已經(jīng)利用各種方案企圖通過(guò)加速樣品準(zhǔn)備過(guò)程 來(lái)提高樣品的處理量，但這些都沒(méi)有被認(rèn)為具有普遍吸引力。在蛋白組學(xué)中，典型樣品制備步驟包括消化復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品，通過(guò)與酶溫育，在緩 沖培養(yǎng)基中持續(xù)規(guī)定的一段時(shí)間，典型地過(guò)夜或者大約12小時(shí)。這一對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的要求使得 蛋白質(zhì)樣品的處理過(guò)程減速，并且使得蛋白質(zhì)消化成為蛋白質(zhì)分析工作流程中最耗時(shí)的步 驟之一。此外，因?yàn)檫@樣的制備過(guò)程通常是手動(dòng)進(jìn)行的，伴隨的涉及操作員誤差的風(fēng)險(xiǎn)還可 以消極地影響分析。另外，手工樣品處理可以引起較大的樣品/試劑消耗和提高由于所涉 及勞動(dòng)的成本。當(dāng)利用非常小的樣品尺寸進(jìn)行工作時(shí)，對(duì)于臨床應(yīng)用通常如此，自動(dòng)化和迅 速的蛋白質(zhì)表征是必需的以限制污染及其他操作員有關(guān)誤差源，和用于使用LC-MS分析達(dá) 到下一水平的有效性和生產(chǎn)力。因此，需要的是用于提高可以制備材料例如蛋白質(zhì)用于分析和分析材料的速度的 方法。還需要一種方法，其制備這些用于分析的材料，其不會(huì)消極地影響分析其所使用的工 作流程。還需要一種用于生物技術(shù)樣品的高通量系統(tǒng)，以及時(shí)的方式提供有效的、精確的、 和準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明滿足這些需要。本發(fā)明另外的優(yōu)點(diǎn)和新穎的特征將如下闡明，并且容易從本文所列出的描述和示 范裝置中顯而易見(jiàn)。因此，本發(fā)明的下列描述應(yīng)該被視為發(fā)明的說(shuō)明而非以以任何方式限 制。本文描述了本發(fā)明的各種的優(yōu)點(diǎn)和新穎的特征，并且進(jìn)一步本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)下列 詳細(xì)說(shuō)明將顯而易見(jiàn)。
概要本發(fā)明是用于獲得用于蛋白組分析的樣品的方法和系統(tǒng)，其利用壓力和預(yù)選的試 劑以獲得在比現(xiàn)有技術(shù)方法顯著短的一段時(shí)間內(nèi)處理樣品，并且維持通過(guò)準(zhǔn)備性處理處理 樣品的完整性。在本發(fā)明中，樣品受到預(yù)選的壓力典型地0. 5psi和IOOkpsi之間的某些， 持續(xù)選定的周期或者時(shí)間間隔，典型地在5和1800秒之間。通 過(guò)該加壓處理，各種的其他 的試劑例如化學(xué)制劑、酶、微波、聲、超聲、熱、光和其組合還可能與壓力結(jié)合以影響期望的 結(jié)果和產(chǎn)生具有期望特征的樣品。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，樣品和酶組合并進(jìn)行經(jīng)受壓力，優(yōu)選在0至35kpsi 之間變化的壓力循環(huán)，持續(xù)一段時(shí)間優(yōu)選小于60秒。該處理導(dǎo)致產(chǎn)生適于分析的樣品。該方法可以在用于蛋白組分析的系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)，該系統(tǒng)包括樣品制備裝置，其利用 壓力和預(yù)選的試劑處理蛋白質(zhì)樣品，其例子已經(jīng)在之前討論。然后樣品制備裝置可操作地 連接到分析儀器，其允許轉(zhuǎn)移處理的樣品至分析儀器用于發(fā)生分析。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施 方式中，分析儀器是具有加壓樣品回路的高壓液相色譜(LC)系統(tǒng)。然后該裝置可以與另外 的分析儀器連接在一起例如質(zhì)譜法儀器或者其他的裝置?？梢詫?duì)該系統(tǒng)進(jìn)行各種的修改和 改造以運(yùn)行其他的任務(wù)例如利用材料例如放射性同位素為處理樣品加標(biāo)簽。雖然已經(jīng)提供了這些實(shí)施例，但顯然地可以理解本發(fā)明不限于此，但可以替換地 根據(jù)需要和使用者的需要來(lái)進(jìn)行各種配置。上述簡(jiǎn)介的目的是整體上使得美國(guó)專利局和公眾特別是本領(lǐng)域中的科學(xué)家、工程 師和從業(yè)者(不熟悉專利或者法定期限或者術(shù)語(yǔ))能夠通過(guò)粗略研究本申請(qǐng)的技術(shù)公開(kāi)的 特征和實(shí)質(zhì)而實(shí)現(xiàn)迅速地測(cè)定。所述簡(jiǎn)介并不打算限定本申請(qǐng)的發(fā)明(由權(quán)利要求控制)， 也不打算以任何方式限制所述發(fā)明的范圍。該文描述了該發(fā)明的各種的優(yōu)點(diǎn)新穎的特征，并且進(jìn)一步該領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)下 列詳細(xì)說(shuō)明將顯而易見(jiàn)。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的前述和后續(xù)描述中，提供了執(zhí)行本發(fā)明 所設(shè)計(jì)的最佳方式的例證。正如能夠認(rèn)識(shí)到的，本發(fā)明能夠在各種的方面進(jìn)行修改而沒(méi)有 離開(kāi)本發(fā)明。因此，此后提出的優(yōu)選實(shí)施方案的圖和描述被認(rèn)為是實(shí)際上說(shuō)明性的，而不是 限制性的。附圖簡(jiǎn)要的說(shuō)明圖Ia和Ib顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的試驗(yàn)結(jié)果。圖2a和2B顯示發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的另外的試驗(yàn)結(jié)果。圖3a_3f顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的比較結(jié)果。圖4a_4c顯示本發(fā)明的實(shí)施方式的另外的比較結(jié)果。圖5a_5c顯示本發(fā)明的各種的實(shí)施方式。圖6a_6g顯示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式以及各種的結(jié)果和其修改。圖7a_7c顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的各種的結(jié)果。圖8a_8b顯示本發(fā)明的另外的實(shí)施方式。圖9a_9c顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的結(jié)果。圖IOa-IOb顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的結(jié)果。圖Ila-Ild顯示本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式的結(jié)果。

圖12顯示本發(fā)明的另外的實(shí)施方式。
圖13顯示利用圖12所示實(shí)施方式運(yùn)行的試驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是新的方法用于在高壓下迅速蛋白水解消化蛋白質(zhì)，其利用在5至35kpsi w范圍內(nèi)的壓力循環(huán)技術(shù)以制備樣品用于蛋白組分析，以及執(zhí)行這樣 的方法的系統(tǒng)。雖然已經(jīng)顯示了這些具體的實(shí)施例，但顯然地大概理解本發(fā)明不限于此，但 可以替換地根據(jù)需要和特別的使用者的需要來(lái)進(jìn)行各種具體化。在本發(fā)明的方法和系統(tǒng) 中，利用該方法成功地實(shí)現(xiàn)了在60s內(nèi)溶液消化單一的蛋白質(zhì)和復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，然 后通過(guò)反相液相色譜-電噴射離子化作用離子阱-質(zhì)譜法分析。通過(guò)該方法制備的樣品的 結(jié)果與通過(guò)傳統(tǒng)的現(xiàn)有技術(shù)方法制備的樣品的結(jié)果一致。然而，在本發(fā)明中描述的方法提 供了大大簡(jiǎn)化的樣品處理，容易執(zhí)行，沒(méi)有樣本間交叉污染和成本有效性。在后面描述的一組實(shí)驗(yàn)中，將本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式與常見(jiàn)的過(guò)夜消化處理進(jìn)行 比較。在該特別的應(yīng)用中，將牛血清清蛋白(BSA)用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)以在不同的條件下評(píng)價(jià) 本方法。首先，將6mgBSA在8M尿素中變性，并在25mM碳酸氫銨(pH 8. 25)在37°C用IOmM DTT還原1小時(shí)。添加碘乙酰胺達(dá)到最終濃度50mM，并將所得到的混合物在室溫下在黑暗 中溫育45分鐘。將12份50 μ g等分試樣稀釋4倍以降低尿素濃度，利用25mM碳酸氫銨、 20%11勸!1或者80%11勸!1。添加胰蛋白酶(蛋白酶與蛋白質(zhì)的比率1 50)，至最終容積 1. 4mL，并將溶液置于脈沖管中。從 Pressure Biosciences (West Bridgewater,MA,USA)獲 得Barocycler NEP-3229儀器和一次性聚丙烯PULSE管FT-500，并用于所有實(shí)驗(yàn)。將脈沖 管進(jìn)行Barocycler 程序，其使用4_8個(gè)壓力脈沖，持續(xù)每輪總計(jì)1分鐘。最后，將酶消化物 轉(zhuǎn)移至新離心管，酸化，用液氮冷凍以停止反應(yīng)。然后，通過(guò)離心蒸發(fā)干燥樣品，并在-20°C 儲(chǔ)存。沙雷菌(Shewanella oneidensis)菌株MR-1，完整細(xì)胞蛋白胰蛋白酶消化物是通 過(guò)由珠打擊(bead beating)進(jìn)行裂解制備的，其使用0. Imm氧化鋯/氧化硅珠在微型珠打 擊儀中在4500rpm進(jìn)行180s。收集裂解物并立即放置冰上以抑制蛋白水解，然后利用8M 尿素、25mM碳酸氫銨、IOmM DTT (pH 8)變性，在37°C溫育lh。添加碘乙酰胺達(dá)到最終濃度 50mM,并將得到的混合物在室溫下在黑暗中溫育45分鐘。稀釋混合物4倍，并在添加胰蛋 白酶后(蛋白酶與蛋白質(zhì)的比例為1 50)在37°C溫育過(guò)夜或者利用PCT在35kpsi溫育 1分鐘。制備在12.5mM碳酸氫銨中最終濃度為ΙμΜ蛋白質(zhì)的溶液，進(jìn)行肌球蛋白實(shí)驗(yàn)。 添加胰蛋白酶，并在Barocycler 中壓力循環(huán)過(guò)程中消化樣品(蛋白酶與蛋白質(zhì)的比例 為1 50)。處理后，通過(guò)LC-MS/MS分析500fmol蛋白質(zhì)消化物。使用40_nL富集柱和 43mmX75 μ m分析柱(填充5 μ m ZORBAX 300SB C18顆粒)進(jìn)行分離。采用流速1 μ L/min 進(jìn)行富集，之后為600nL/min。使用5分鐘梯度洗脫肽，從5%至90%溶劑B (0. 5%甲酸， 90%乙腈；溶劑A:在水中的0.5%甲酸乙腈97 3)，其中分離窗口為大約2分鐘?？偡?析時(shí)間為12分鐘。每份樣品分析三遍。為了防止不同樣品之間的交叉污染，在每組重復(fù)之 間運(yùn)行空白。在調(diào)查中獲取的數(shù)據(jù)掃描500至1600amu(3次微掃描)，隨后是5次數(shù)據(jù)依賴性 MS/MS掃描，使用3amu的分離寬度，35%的標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量，和2分鐘的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間。使 用Spectrum Mill軟件針對(duì)內(nèi)部FASTA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中所述FASTA數(shù)據(jù)庫(kù)是從沙雷菌MR-I和BSA蛋白質(zhì)獲得的。手動(dòng)確認(rèn)與BSA匹配的光譜。對(duì)于復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分析，利用定制的在線偶聯(lián)至線性離子截留質(zhì)譜儀(具 有內(nèi)部開(kāi)發(fā)的ESI源)的毛細(xì)管LC系統(tǒng)分析2yg沙雷菌消化物。以數(shù)據(jù)依賴性MS/MS模 式(m/z 400-2, 000)運(yùn)轉(zhuǎn)LTQ質(zhì)譜儀，其中完全的MS掃描之后是十次MS/MS掃描，利用35% 標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量，動(dòng)力學(xué)排除為1分鐘。利用SEQUEST進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定以從沙雷菌MR-I基 因組序列推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列。數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)查參數(shù)包括對(duì)于Met氧化進(jìn)行動(dòng)態(tài)修飾調(diào)查(即調(diào)查 存在和缺少修飾)，以及對(duì)于Cys上的脲基甲基化進(jìn)行靜態(tài)調(diào)查(即僅調(diào)查修飾的存在)。 如同以前報(bào)告的，計(jì)算肽鑒定的誤差率。為了研究肌球蛋白折疊，通過(guò)注射器泵以1 μ L/min直接將蛋白質(zhì)(有或沒(méi)有之 前的壓力處理)注入Agilent TOF MS內(nèi)通過(guò)ESI界面。以1次掃描/秒的掃描速度記錄 500-2500m/z范圍上的MS數(shù)據(jù)。 現(xiàn)在參考圖Ia和Ib，顯示了在每種壓力下，在5，10，20和35kpsi持續(xù)60s的就蛋 白質(zhì)蛋白水解產(chǎn)物而言的酶活性。圖Ia中的色譜表示在所有壓力下，胰蛋白酶活性都沒(méi)有 受到破壞。然而，正如圖Ib中所示，在5kpsi下，所鑒定肽的消化不如更高壓力下完全，盡 管在5，10，和20kpsi的色譜相似。盡管，屬于35kpsi樣品的色譜與其他相比看上去顯著不 同。手動(dòng)MS色譜的研究顯示了色譜之間相同的肽。在將壓力施加于含有BSA但不存在胰 蛋白酶的溶液時(shí)，沒(méi)有觀察到蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物，這表明壓力處理本身并不能造成蛋白質(zhì)片 段化。為評(píng)價(jià)高低壓力之間的快速循環(huán)對(duì)胰蛋白酶活性的影響，在壓力下消化BSA，利用 4或者8個(gè)差動(dòng)壓力循環(huán)持續(xù)總共60s。為了進(jìn)一步分析在存在有機(jī)溶劑時(shí)壓力對(duì)胰蛋白 酶消化的綜合影響，在存在下列時(shí)對(duì)相同的BSA蛋白質(zhì)等分試樣進(jìn)行壓力消化1)碳酸氫 銨，2)碳酸氫銨甲醇的80 20 (ν/ν)混合物，和3)碳酸氫銨甲醇的20 80 (ν/ν)混 合物。混合有機(jī)-含水溶劑系統(tǒng)中的酶的性能受諸如下列的因素的影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、相界 面的存在、介電常數(shù)等等，所有這些都有助于酶在它的生物催化系統(tǒng)中的性能。圖2a中的直方圖顯示了對(duì)于在相當(dāng)?shù)南彌_液中消化的樣品獲得了就獨(dú)特肽 鑒定的數(shù)目而言幾乎相同的結(jié)果，而與循環(huán)的數(shù)目無(wú)關(guān)。圖2b中的色譜特征對(duì)于相當(dāng)?shù)木?沖液也非常相似。對(duì)于在循環(huán)壓力下獲得的這些結(jié)果與在恒壓下獲得的那些結(jié)果的比較顯 示沒(méi)有重大差別，這暗示至少對(duì)于胰蛋白酶，在消化期間沒(méi)有由于利用PCT的差動(dòng)壓力循 環(huán)數(shù)目的活性的顯著影響。此外，鑒定肽的數(shù)目在含水的(即碳酸氫銨)和20%甲醇消化 4或8周期方案之間沒(méi)有顯著地不同(圖2a)。還通過(guò)應(yīng)用PCT至蛋白組樣品然后利用鳥(niǎo)槍(shotgun)蛋白組方法對(duì)其分析來(lái)評(píng) 價(jià)本發(fā)明的該實(shí)施方式。將來(lái)自沙雷菌細(xì)胞制品的總蛋白組提取物分成兩個(gè)相同的等分試 樣，在60s期間內(nèi)將其一進(jìn)行35kpsi下的PCT輔助消化持續(xù)8個(gè)循環(huán)，將另一個(gè)根據(jù)傳統(tǒng) 的過(guò)夜方法進(jìn)行胰蛋白酶消化，以達(dá)到比較的目的。PCT條件反映了 Barocycler 能夠運(yùn)行 的最高的周期數(shù)和最高的壓力，，其之前顯示能夠?qū)崿F(xiàn)良好的胰蛋白酶活性。通過(guò)反相HPLC 利用100分鐘梯度分析消化的肽混合物。為了比較，在圖3中(a和b)提供了來(lái)自利用在典型常壓的傳統(tǒng)方法和PCT輔助 消化的胰蛋白酶消化的LC-MS/MS分析的總離子流色譜。注意，這些色譜展示了非常相似的 強(qiáng)度特征，盡管消化條件不同；然而，使用壓力規(guī)程獲得的鑒定肽的數(shù)目比通過(guò)傳統(tǒng)方法獲得的那些要稍高(大約10% )(圖3c)。來(lái)自更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)蔫b定肽的結(jié)果(即，假結(jié)果率(FDR) <1%)顯示具有超過(guò)1個(gè)錯(cuò)失切割的肽的數(shù)目比傳統(tǒng)規(guī)程低得多(圖3d)，而大約超過(guò) 95%的PCT輔助消化肽的錯(cuò)失切割小于2個(gè)。然而，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)就鑒定肽而言具有寬重疊，其中PCT輔助消化規(guī)程產(chǎn)生更多的肽 鑒定(圖3e)。在兩種樣品中，非胰蛋白酶水解形成的肽(non-tryptic peptide)的數(shù)目都 不顯著(圖3f)，并且在我們?cè)O(shè)定的用于鑒定肽的誤差范圍內(nèi)(即< 1%FDR)。對(duì)于兩種消 化，半胰蛋白酶水解形成的肽(semi-tryptic peptide)的群集(定義為一個(gè)末端不是胰蛋 白酶水解形成的)非常相似。
最后，為檢驗(yàn)更好的消化收率是由于起因于壓力的去折疊作用的假設(shè)，在直接注 射入質(zhì)譜儀之前，將肌球蛋白溶于12mM碳酸氫銨并經(jīng)受IOkpsi持續(xù)60s。為了進(jìn)行比較， 還通過(guò)TOF-MS分析未經(jīng)受壓力處理的天然肌球蛋白蛋白質(zhì)樣品。如圖4所示，在中性的pH 獲得的壓力處理和非壓力處理蛋白質(zhì)的光譜是完全不同的。顯著地，對(duì)應(yīng)于天然蛋白質(zhì)的 電荷狀態(tài)比對(duì)應(yīng)于壓力處理蛋白質(zhì)的那些低得多。天然蛋白質(zhì)在MW 17，568Da產(chǎn)生最大信 號(hào)，而壓力處理蛋白質(zhì)的電荷狀態(tài)則轉(zhuǎn)變到更高的電荷狀態(tài)，MW相當(dāng)于16，952Da。該發(fā)現(xiàn) 表明血紅素基團(tuán)(616Da)的損失和蛋白質(zhì)的完全的變性作用僅由于壓力處理；天然蛋白質(zhì) 的去折疊允許電荷_電荷斥力的減少，接著這允許較大的質(zhì)子化度。這些結(jié)果證明壓力增加如何顯著地提高蛋白組樣品中蛋白質(zhì)的酶消化速度。本發(fā) 明提供的優(yōu)點(diǎn)包括自動(dòng)化樣品制備，高試樣處理量(在我們的設(shè)置中最高達(dá)到三個(gè)樣品每 分鐘)而沒(méi)有破壞消化收率，高再現(xiàn)性，沒(méi)有氣溶膠化(當(dāng)應(yīng)用HIFU時(shí)發(fā)生的常見(jiàn)的作用) 和在短得多的時(shí)間段內(nèi)(即1分鐘)獲得與使用常規(guī)消化規(guī)程獲得的那些相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。因 為消化可以在20°C完成，因此能夠避免不希望的蛋白質(zhì)修飾。本發(fā)明的方法可以通過(guò)諸如示于圖5a_5c中的系統(tǒng)的系統(tǒng)來(lái)執(zhí)行。圖5a顯示離線 系統(tǒng)，而圖5b和5c顯示在線的消化系統(tǒng)，其降低樣品操作步驟的數(shù)目用于高通量蛋白組。 在該實(shí)施方式中，加壓樣品回路被引入到基于液相色譜的分離系統(tǒng)中，其中樣品和酶(例 如胰蛋白酶)兩者都能夠被同時(shí)引入以產(chǎn)生完全的、超速消化。在該實(shí)施方式中，系統(tǒng)的 流體組分由下列組成具有5μ L樣品回路的六端注射閥，額定為15，OOOpsi的四端閥。將 10，OOOpsi注射器泵用于將移動(dòng)相供給至該系統(tǒng)。在7，OOOpsi恒壓下操作快速在線消化 系統(tǒng)(FOLDS)并使用水作為流動(dòng)相。執(zhí)行若干修改以將FOLDS在線結(jié)合至質(zhì)譜儀。在示于 圖5b的實(shí)施方式中，僅僅在ESI之前，將填充90%乙腈和甲酸的第二注射器泵用來(lái)再 酸化樣品。在第三構(gòu)造中，將FOLDS結(jié)合至裝備納米流動(dòng)泵的Agilent LC 1100系統(tǒng)。利 用10到60%溶劑B的梯度洗脫肽(溶劑A :0. 5%甲酸。溶劑B0. 5%甲酸，80%乙腈)。FOLDS的運(yùn)轉(zhuǎn)和顯示閥、端口和樣品回路放置的細(xì)節(jié)示于圖5。在三部分中描述系 統(tǒng)功能，這對(duì)應(yīng)樣品處理的幾個(gè)階段上樣、消化和分析或者收集。圖5舉例說(shuō)明了最初在 樣品上樣階段，將回路填充5μ1樣品以及溶解的胰蛋白酶。為了開(kāi)始加速的蛋白質(zhì)消化， 將第一個(gè)閥換到注射位置使得系統(tǒng)加壓至7，OOOpsi，但是流到系統(tǒng)其余部分的流體被阻 斷，因?yàn)榈诙y處于上樣位置并且端口被關(guān)閉。在消化階段，樣品回路變成反應(yīng)室并且允許 消化繼續(xù)1至3分鐘。當(dāng)完成壓力輔助消化時(shí)，將第二閥換到注射位置開(kāi)始樣品分析階段。 將消化的樣品直接地注入質(zhì)譜儀，收集用于離線分析，或者導(dǎo)入反相柱進(jìn)行色譜分離。開(kāi)始，以離線方式采用0DS(圖5a)以表征消化效率。一旦收集樣品，就將其干燥，將它們?cè)賾腋≡?ο μ L 40% MeOH 水、0. 甲酸緩沖液中，并利用TriVersa Nanomate電 噴射入修改的Bruker 12Τ APEX-QFTICR質(zhì)譜儀，如同之前所描述的“。每2s記錄每個(gè)質(zhì) 譜，并且將3個(gè)質(zhì)譜的平均值用于數(shù)據(jù)分析。對(duì)于在線應(yīng)用，使用兩個(gè)不同的設(shè)置。如圖5b 所示，ODS連接至引入家用IMS儀器(具有Agilent 6210 oTOF MS)的平臺(tái)。在另一組實(shí) 驗(yàn)中，ODS連接至毛細(xì)管RPLC分離，之后是運(yùn)行離子阱，如前所描述的(圖5c)。將蛋白質(zhì)溶解于12. 5mM碳酸氫銨緩沖液(pH 8. 2)中，并且與測(cè)序等級(jí)的改性胰 蛋白酶混合，酶底物比例為1 50。然后將混合物輸入加壓系統(tǒng)。收集消化物用于離線實(shí) 驗(yàn)或者直接利用MS分析。首先用IOmM DTT在37攝氏度還原牛血清清蛋白1小時(shí)，并且用 50mM IAA在室溫下烷基化45分鐘。根據(jù)在其他地方所述準(zhǔn)備沙雷菌并且用作對(duì)照。如果 沒(méi)有明確說(shuō)明，以與上面所述相同的方式制備可溶性蛋白組。對(duì)于那些只采用高精確度MS的分析而言，使用MASCOT搜索引擎進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。 由于樣品的低復(fù)雜性，如果評(píng)分在不確定的區(qū)域之外，則考慮該蛋白質(zhì)被鑒定。為了進(jìn)行 MS/MS分析，使用SEQUEST 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索引擎。為了計(jì)算與肽鑒定相關(guān)的誤差率，使用與之 前公開(kāi)相同的方法。
第一個(gè)實(shí)驗(yàn)使用在12mM碳酸氫銨中的Ipmol肌球蛋白，其中胰蛋白酶被注射入 FOLDS (圖5a)。施加壓力持續(xù)1分鐘，并且在0到7000psi之間變化。一分鐘后，收集樣品 在反應(yīng)管中，并使用ESI芯片輔助直接注入12T FTICR MS中進(jìn)行分析(圖6)。FOLDS的使 用允許我們能夠同時(shí)地檢測(cè)任何非消化完整的蛋白質(zhì)以及蛋白水解的肽。當(dāng)不施加壓力 時(shí)，從FOLDS洗脫的蛋白質(zhì)被檢測(cè)為具有對(duì)應(yīng)11到15的電荷狀態(tài)。當(dāng)FOLDS中的壓力提高 至500psi時(shí)，觀察到蛋白質(zhì)更高的電荷狀態(tài)，但沒(méi)有肽片段。這很可能由于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié) 構(gòu)的顯著的改變，導(dǎo)致之前未曝露的位置被質(zhì)子化。在第三實(shí)驗(yàn)中，將壓力增加到lOOOpsi。 MS分析顯示消化和變性處理開(kāi)始發(fā)生，其顯示肽和完整的蛋白質(zhì)兩者的混合物。在該壓力 下產(chǎn)生和鑒定的肽提供100%蛋白質(zhì)覆蓋，其具有小于三個(gè)的錯(cuò)失切割。最后，為了確認(rèn)高 壓和消化速度之間的關(guān)聯(lián)，我們提高FOLDS中的壓力最高達(dá)到7000psi。結(jié)果，在一分鐘內(nèi) 實(shí)現(xiàn)了完全的蛋白質(zhì)消化，如圖6b-6f所示。因?yàn)?000psi壓力促進(jìn)完全的和迅速的消化，我們進(jìn)一步研究消化動(dòng)力學(xué)。圖 7a-7c顯示即使在30秒反應(yīng)時(shí)間，也能夠?qū)崿F(xiàn)滿意的消化。通過(guò)利用高通量精確(high mass accuracy) 12T FTICR MS分析在30秒消化中產(chǎn)生的肽，我們能夠獲得良好的蛋白質(zhì)覆 蓋，但有相當(dāng)多水平的錯(cuò)失切割。為了提高裝置的靈敏度，將通過(guò)獨(dú)立的注射器泵遞送的有機(jī)緩沖液(90%甲醇， 甲酸)與FOLDS洗脫液混合，其中ESI放射器產(chǎn)生改善的電離效率。酸化溶劑的回流是
由FOLDS泵的更高的壓力防止的。研究肌球蛋白的示意視圖，利用施加一分鐘壓力，有和 沒(méi)有胰蛋白酶。圖9顯示由IMS-TOF-MS得到的肌球蛋白消化結(jié)果與FTMS報(bào)道的那些一 致。從開(kāi)始注射直到獲得光譜的總分析時(shí)間小于90秒。該速度增大關(guān)鍵來(lái)源是在氣相階 段IMS-TOF MS迅速地分離離子的能力，其主要依賴于他們的電荷和氣體動(dòng)力橫截面。圖10顯示肌球蛋白和β乳球蛋白等摩爾混合物(各lpmol)的分析結(jié)果，其利用 連接至IMS-TOF MS的FOLDS。在加壓下消化該混合物1分鐘，并將產(chǎn)物遞送至IMS-TOF MS, 如上所述。肽質(zhì)量指紋分析產(chǎn)生了具有高M(jìn)ASCOT得分的蛋白質(zhì)以及高蛋白覆蓋二者的鑒 定，正如在圖IOb的表中所概括的。在線直接輸入配置中ODS的缺點(diǎn)之一是蛋白組樣品處理常常要求使用鹽和離液劑，這可能產(chǎn)生提高的化學(xué)制劑噪音和降低的電離效率削弱精確 的蛋白質(zhì)鑒定。為了解決該限制并達(dá)到更高的靈敏度，我們將FOLDS連接至RPLC分離以對(duì)消化后 樣品進(jìn)行脫鹽。在該研究中，將IOpmol BSA在8M尿素中還原和烷基化，用12. 5mM碳酸氫 銨稀釋10倍并且與胰蛋白酶混合。將Ipmol得到的溶液注入FOLDS中。在7，OOOpsi消化 1分鐘之后，將肽產(chǎn)品上樣到反相柱，流速為大約10μ L/min，然后使用20min梯度在實(shí)驗(yàn)部 分描述的條件下分離。利用LCQ質(zhì)譜儀以MS/MS模式分析LC洗脫液。圖Ila顯示實(shí)現(xiàn)了 高蛋白質(zhì)覆蓋，大約70%的氨基酸序列，并且所有48種鑒定的肽被均勻地在蛋白質(zhì)序列上 分布。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，研 究沙雷菌的細(xì)菌蛋白組?？扇苄缘鞍捉M再懸浮在25mM碳酸 氫銨中，添加胰蛋白酶，酶蛋白質(zhì)為1 50，并且將5yg總蛋白量注入系統(tǒng)中，并且在 7，OOOpsi下消化1分鐘。將使用傳統(tǒng)的規(guī)程和FOLDS獲得的蛋白水解消化物進(jìn)行分析以用 于有和沒(méi)有還原/烷基化程序的比較。在傳統(tǒng)的利用胰蛋白酶的蛋白組消化中，將5yg等 分試樣沙雷菌進(jìn)行環(huán)境壓力下常規(guī)消化5小時(shí)，不添加離液劑并且沒(méi)有還原或者烷基化蛋 白質(zhì)。消化用FOLDS消化相同的樣品，沒(méi)有離液劑和還原/烷基化。結(jié)果，利用常規(guī)程序鑒 定肽的數(shù)目發(fā)現(xiàn)低于從FOLDS處理樣品所鑒定的。因?yàn)橄惹暗募∏虻鞍籽芯恳呀?jīng)顯示壓力會(huì)使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)加速反應(yīng)動(dòng)力學(xué)， 因此第二組實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谠u(píng)價(jià)變性的作用。將5微克沙雷菌蛋白組在存在8M尿素時(shí)還原 和烷基化，然后經(jīng)受胰蛋白酶消化利用傳統(tǒng)的和FOLDS規(guī)程兩者。圖lib顯示利用常規(guī)程 序鑒定肽的數(shù)目接近利用FOLDS獲得的那些。該研究表明不僅提高壓力加速消化速度，還 因?yàn)樽鳛樽冃詣┒恍枰砑与x液劑，促進(jìn)酶分子和底物之間復(fù)合物的形成。此外，在高壓 下處理肌球蛋白所觀察的這些數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)變化暗示不僅提高壓力加速蛋白水解消化，而且 它還能夠使蛋白質(zhì)變性如離液劑。需要進(jìn)一步研究證實(shí)該假設(shè)。然而，因?yàn)閴毫κ沟鞍踪|(zhì) 變性，但是胰蛋白酶仍然工作，因此我們相信以其催化三聯(lián)體(catalytic triad)對(duì)高溫非 常穩(wěn)定的方式以及以相同方式對(duì)待壓力，設(shè)計(jì)胰蛋白酶測(cè)序。在另一組實(shí)驗(yàn)中，我們證明同位素標(biāo)記肽(使用雙重在線消化系統(tǒng))的可能性，通 過(guò)將消化緩沖液中常規(guī)的水替換為富含18O的水，圖12。這是酶催化的反應(yīng)，其中所有產(chǎn)生 的肽都可以被至少一個(gè)18O原子標(biāo)記，最高達(dá)到羧基末端的兩個(gè)。反應(yīng)是在上面的方案中所 描述的，其中蛋白酶引入兩個(gè)0-18原子，通過(guò)由絲氨酸蛋白酶家族的酶分子對(duì)肽進(jìn)行反向 連接。引入穩(wěn)定的同位素能夠在不同樣品之間進(jìn)行全面的定量比較，由于在各個(gè)樣品中 引入同位素所造成的質(zhì)量差別。作為該觀點(diǎn)的證據(jù)，圖12顯示BSA肽的等摩爾混合物。兩 份相同的BSA蛋白的等分試樣已經(jīng)被在線消化，同位素標(biāo)記和利用LC-MS進(jìn)行分析。利用 優(yōu)化的工作流程(引入FOLDS強(qiáng)化消化和標(biāo)記)獲得的結(jié)果與利用傳統(tǒng)的，更耗時(shí)的蛋白 組工作流程獲得的結(jié)果相當(dāng)，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量并沒(méi)有因?yàn)檫\(yùn)轉(zhuǎn)更快而被破壞。該雙重FOLDS 系統(tǒng)可以在全面蛋白質(zhì)分析通量中提供顯著的改進(jìn)，用于包括大量樣品的生物學(xué)應(yīng)用，例 如用于生物標(biāo)記發(fā)現(xiàn)的臨床研究。使用FOLDS結(jié)合MS用于鑒定消化產(chǎn)物已經(jīng)完成了許多目標(biāo)。首先，不再需要延長(zhǎng) 的溫育時(shí)間以達(dá)到有效的蛋白質(zhì)消化，因?yàn)閼?yīng)用高壓加速了蛋白質(zhì)水解動(dòng)力學(xué)。第二，使用溶液中的胰蛋白酶消除了利用固定化酶觀察到的非特異性結(jié)合。第三，將FOLDS連接至IMS-TOF MS獲得了分析平臺(tái)，其具有快速檢測(cè)肽離子數(shù)目的能力，其以非常流行的方式可 以用于單蛋白質(zhì)鑒定或者監(jiān)控。這種峰值能力可以被進(jìn)一步提高，通過(guò)將毛細(xì)管RPLC分離 連接至IMS-TOF MS儀器。在所有報(bào)道的設(shè)置中，省去了許多樣品處理步驟，使得這些方法 的自動(dòng)化可以實(shí)行。 盡管顯示和描述了本發(fā)明的各種優(yōu)選實(shí)施方案，但需要特別理解的是本發(fā)明不限 于此，而且可以以各種方式實(shí)現(xiàn)，在后面權(quán)利要求的范圍內(nèi)。根據(jù)前面的描述，顯而易見(jiàn)，可 以進(jìn)行各種改變，而不離開(kāi)后面權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的主旨和范圍。
權(quán)利要求
用于選擇性地加速大分子片段化的方法，其特征在于同時(shí)施加壓力以及至少一種預(yù)選的試劑至預(yù)選的材料以在預(yù)選的時(shí)段內(nèi)獲得經(jīng)過(guò)處理的樣品。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述預(yù)選的試劑包括化學(xué)制劑、酶、微波、聲、超聲、熱、光 和其組合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中，所述試劑是酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中，所述預(yù)選的時(shí)段在5秒和1800秒之間。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中，所述壓力提供于壓力循環(huán)中，其在0.5psi至 IOOkpsi的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中，所述預(yù)選的材料選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)高分子、預(yù)選長(zhǎng)度的 肽、有機(jī)分子和無(wú)機(jī)分子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，所述預(yù)選的材料存在于固體載體中。
8.權(quán)利要求7的方法，其中，所述預(yù)選的材料存在于凝膠基質(zhì)中。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括下列步驟除了所述壓力和預(yù)選的試劑 之外，利用同位素處理所述預(yù)選的材料，以在所述處理樣品上形成預(yù)選的標(biāo)記。
10.用于蛋白組分析的系統(tǒng)，其特征在于樣品制備裝置利用壓力結(jié)合預(yù)選的試劑片段 化蛋白質(zhì)樣品，其中所述預(yù)選的試劑選自化學(xué)制劑、酶、微波、聲、超聲、熱、光和其組合。
11.權(quán)利要求10的系統(tǒng)，其進(jìn)一步含有分析儀器。
12.權(quán)利要求10-11任一項(xiàng)的系統(tǒng)，其中，所述樣品制備裝置可操作地與所述分析儀器連接。
13.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，除了所述壓力和所述預(yù)選的試劑之外，其進(jìn)一步含有同位素。
14.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中，所述分析儀器是具有加壓樣品回路的高壓液相色譜 (LC)系統(tǒng)。
15.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中，所述分析儀器進(jìn)一步含有質(zhì)譜儀器。
全文摘要
用于獲得用于蛋白組分析的樣品的方法和系統(tǒng)，其利用壓力和預(yù)選的試劑以獲得在比現(xiàn)有技術(shù)方法顯著短的一段時(shí)間內(nèi)處理樣品，并且維持通過(guò)準(zhǔn)備性處理處理樣品的完整性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，樣品和酶組合并進(jìn)行經(jīng)受壓力，優(yōu)選在0至35kpsi之間變化的壓力循環(huán)，持續(xù)一段時(shí)間優(yōu)選小于60秒。該處理導(dǎo)致產(chǎn)生適于分析的樣品，其優(yōu)選地被引入另外的分析儀器例如質(zhì)譜儀器或者其他的裝置。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101970455SQ200980104482
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月7日
發(fā)明者D·羅佩斯-費(fèi)雷爾 申請(qǐng)人:巴特爾紀(jì)念研究院