專利名稱：高通量篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及篩選抗結(jié)核藥物的方法，尤其是一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖 胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis) 的病原菌，據(jù)WHO報道，目前全球有近1/3的人已感染結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)結(jié)核病人約 9000 力。(multi drug resistant, MDR) Μ^&Γ&ΜΜ (extensive drug resistant, XDR)菌株的出現(xiàn)，現(xiàn)有一些一線及二線抗結(jié)核藥物都無法有效地治愈結(jié)核病， 導(dǎo)致每年約有200萬人死亡，結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。目前，新藥研制已由過去大多數(shù)隨機(jī)、偶然和被動的藥物發(fā)現(xiàn)過程變?yōu)橹鲃拥囊?明確靶標(biāo)為依據(jù)的新藥開發(fā)過程，以細(xì)菌代謝途徑中的酶或蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)來篩選先導(dǎo)化 合物，是目前研發(fā)新的抗生素的一種策略。研究表明，分枝桿菌與革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽 性菌相比，具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，其核心結(jié)構(gòu)由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖及肽聚糖三種 大分子所構(gòu)成。分枝菌酸由含70-90碳原子的脂類分子組成，形成致密的低通透性外層，肽 聚糖位于細(xì)胞壁的最內(nèi)層并與細(xì)胞質(zhì)膜相連。分枝菌酸與中層的聚阿拉伯糖(由呋喃型阿 拉伯糖殘基聚合而成)及聚半乳糖(由呋喃型半乳糖殘基聚合而成)連接后再通過銜接二 糖(L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺L-Rhamnose-N-GlcNAc)共價連接到肽聚糖大分子上。因此， 銜接二糖是維持分枝桿菌細(xì)胞壁完整性的重要結(jié)構(gòu)。N-乙酰葡糖胺既是二糖銜接分子的組成成分，又是肽聚糖的組成成分，其糖基供 體為UDP-N-乙酰葡糖胺。UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成途徑包括由三種酶所催化的四步 反應(yīng)，其中以glmU基因編碼的GlmU蛋白酶是雙功能酶，其基因C端具有葡糖胺磷酸乙 ?；D(zhuǎn)移酶活性，N端具有N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶活性，分別催化第三步的轉(zhuǎn)乙 酰反應(yīng)及第四步的轉(zhuǎn)尿苷反應(yīng)。乙酰化作用將乙酰CoA中的乙?；D(zhuǎn)移給葡糖胺-1-磷酸， 生成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸；轉(zhuǎn)尿苷反應(yīng)將UTP的α -磷酸轉(zhuǎn)移給N-乙酰葡糖胺-1-磷 酸，生成UDP-乙酰葡糖胺?，F(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建了 glmU基因敲除菌株，并通過測定其在允許溫度和非允許溫度條 件下的生長曲線，確定glmU是分枝桿菌生長必需基因[1]，與Sassetti等人的高密度突變實(shí) 驗的結(jié)果一致[2]。GlmU蛋白是N-乙酰葡糖胺賴以存在的必要條件，亦是維持分枝桿菌細(xì) 胞壁完整性的關(guān)鍵，尤其是葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶并不存在于人體細(xì)胞中，如以葡 糖胺-ι-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶為靶酶所研發(fā)的抗結(jié)核藥物既能殺滅結(jié)核分枝桿菌又不會對 人體產(chǎn)生毒副作用。但是，迄今為止還沒有以葡糖胺-ι-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶為抗結(jié)核藥物 的作用靶標(biāo)，從已有組合化合物庫及中藥中篩選出有效的葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑 制劑的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以參與結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中關(guān)鍵組分生物合成的葡糖胺-1-磷酸乙 酰基轉(zhuǎn)移酶為對象，提供一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶抑制 劑的方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙?；?轉(zhuǎn)移酶抑制劑的方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行a.用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中克隆glmU基因，從glmU基因 的5，端進(jìn)行DNA序列刪除，獲得保留3，端的glmU基因片段glmU_C ；b.將基因片段glmU-C克隆到pET載體，構(gòu)建出pET-glmU_C表達(dá)載體；c.將pET-glmU-C表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建出表達(dá)葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn) 移酶的工程菌株 MTGC08 (Escherichia coli MTGC08)，保藏編號 CGMCC3419 ；d.將工程菌株MTGC08接種到卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)4小時，用濃 度為0. 2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)GlmU-C蛋白；e.收獲細(xì)菌，超聲破碎細(xì)胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化 得到GlmU-C蛋白；f.將 2ug GlmU-C 蛋白與 pH 7. 5 的 50mM Tris-HCl、0. 4mM 乙酰 CoA 及 0. 4mM 葡糖 胺-1-磷酸構(gòu)成50 μ 1的酶促反應(yīng)體系，將被篩選物按0. 1 5ug/ml濃度加入酶促反應(yīng)體 系中，在30°C孵育5分鐘，加入50 μ 1 6Μ鹽酸胍終止反應(yīng)，再加入50 μ 1 DTNB顯色劑顯色 10分鐘，用酶標(biāo)儀檢測405nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應(yīng)條件同f步驟、酶促反應(yīng)體系中無被篩選物時測得的 GlmU-C蛋白在405nm處的標(biāo)準(zhǔn)吸光度值進(jìn)行對比，篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺磷酸乙酰 基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。本發(fā)明是以結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶為靶標(biāo)所建立的篩選新 型抗結(jié)核藥物的方法，可在小體積反應(yīng)體系中對葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的活性進(jìn)行 測定，因此，可在96孔板中同時完成96個酶促反應(yīng)，靈敏、快速準(zhǔn)確地在現(xiàn)有組合化合物 庫、中藥及天然物中篩選出葡糖胺-ι-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑，制備抗結(jié)核藥物。因葡 糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶是N-乙酰葡糖胺賴以存在的必要條件，亦是維持結(jié)核分枝桿 菌細(xì)胞壁完整性的關(guān)鍵，抑制葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶即抑制了銜接二糖的生物合成 途徑，從而破壞結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡，具有高藥效性；另外，在人 體細(xì)胞中，UDP-乙酰葡糖胺的合成途徑與結(jié)核分枝桿菌有所不同，不存在葡糖胺-1-磷酸 乙?；D(zhuǎn)移酶，因此將編碼GlmU雙功能酶的glmU基因的5’端刪除，只保留glmU基因的 3’端，以編碼只有葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的GlmU-C蛋白。結(jié)核分枝桿菌葡糖 胺-ι-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶所催化的反應(yīng)在人體細(xì)胞中不存在，以葡糖胺-ι-磷酸乙?；D(zhuǎn) 移酶為靶酶所研發(fā)的抗結(jié)核藥物將對人體無害，克服了現(xiàn)有抗菌藥物也殺害正常細(xì)胞的缺 點(diǎn)ο菌株MTGC08 保藏日期2009-11-06。保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 菌株保藏代號CGMCC 3419。分類命名大腸埃希氏菌Escherichia coli
具體實(shí)施例方式a.用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組DNA (購自AmericanType Culture Collection, ATCC# 為 25618D-5)中克隆 glmU 基因，從 glmU 基因的 5，端進(jìn)行 DNA 序列刪除，獲得保留3’端的glmU基因片段glmU-C，該基因片段編碼的C端GlmU蛋白是葡 糖胺-ι-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；b.將基因片段glmU-C克隆到pET_29b⑴載體(購自Novagen公司，產(chǎn)品號為 69872)，構(gòu)建出pET-glmU-C表達(dá)載體；c.將pET-glmU-C表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)(購自Novagen公司，產(chǎn)品 號為69450)中，構(gòu)建出表達(dá)葡糖胺-1-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的工程菌株MTGC08 (Escherichia coli MTGC08)，保藏編號CGMCC 3419 (利用HPLC方法確定純化的GlmU-C蛋白具有葡糖 胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶活性)；d.將工程菌株MTGC08接種到卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37°C培養(yǎng)4小時，用濃 度為0. 2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)GlmU-C蛋白；e.收獲細(xì)菌，超聲破碎細(xì)胞，離心后取上清，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術(shù)純化 得到GlmU-C蛋白；f.將 2ug GlmU-C 蛋白與 pH 7. 5 的 50mM Tris_HCl、0. 4mM 乙酰 CoA 及 0. 4mM 葡糖 胺-1-磷酸構(gòu)成50 μ 1的酶促反應(yīng)體系，將被篩選物按0. 1 5ug/ml濃度加入酶促反應(yīng)體 系中，在30°C孵育5分鐘，加入50 μ 1 6Μ鹽酸胍終止反應(yīng)，再加入50 μ 1 DTNB顯色劑(購 自Sigma公司，產(chǎn)品號為D8130)顯色10分鐘，用酶標(biāo)儀檢測405nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應(yīng)條件同f步驟、酶促反應(yīng)體系中無被篩選物時測得 的GlmU-C蛋白在405nm處的標(biāo)準(zhǔn)吸光度值(0.452)進(jìn)行對比，篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖 胺-ι-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶活性測定原理如下列反應(yīng)式⑴、(2):
權(quán)利要求
一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺 1 磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行a.用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆glmU基因，從glmU基因的5’端進(jìn)行DNA序列刪除，獲得保留3’端的glmU基因片段glmU C；b.將基因片段glmU C克隆到pET載體，構(gòu)建出pET glmU C表達(dá)載體；c.將pET glmU C表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，構(gòu)建出表達(dá)葡糖胺 1 磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏編號CGMCC3419；d.將工程菌株MTGC08接種到卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)4小時，用濃度為0.2mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；e.收獲細(xì)菌，破碎細(xì)胞，離心后取上清，采用組氨酸 Ni2+親和層析技術(shù)純化得到GlmU C蛋白；f.將2ug GlmU C蛋白與pH 7.5的50mM Tris HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺 1 磷酸構(gòu)成50μl的酶促反應(yīng)體系，將被篩選物按0.1～5ug/ml濃度加入酶促反應(yīng)體系中，在30℃孵育5分鐘，加入50μl 6M鹽酸胍終止反應(yīng)，再加入50μl DTNB顯色劑顯色10分鐘，用酶標(biāo)儀檢測405nm處的吸光度值；g.將所測吸光度值與反應(yīng)條件同f步驟、酶促反應(yīng)體系中無被篩選物時測得的GlmU C蛋白在405nm處的標(biāo)準(zhǔn)吸光度值進(jìn)行對比，篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺 1 磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高通量篩選結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的方法，是利用分子克隆技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株基因組中克隆了全長glmU基因，并對全glmU基因進(jìn)行改造，只保留編碼葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶的基因片段，同時建立了高表達(dá)葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌工程菌株。利用親和層析技術(shù)從工程菌株中純化得到葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶，建立了快速、準(zhǔn)確測定葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶活性的方法，該酶活性測定方法是篩選葡糖胺-1-磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的分子模型，用于高通量篩選組合化合物庫、中藥及天然產(chǎn)物的結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
文檔編號G01N21/31GK101942501SQ20091022016
公開日2011年1月12日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月26日
發(fā)明者周妍, 張文利, 辛毅, 馬郁芳 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)