專利名稱：：一種檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬藥物分析領域，涉及一種內(nèi)源性微量物質(zhì)的檢測，具體涉及一種快速檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的分析方法。
背景技術：
：隨著中藥現(xiàn)代化學和中藥制劑學技術的不斷提高及研究，中藥注射劑在我國已廣泛應用于臨床。中藥注射劑起效快、作用強，尤其在危重疾病急救及感染性疾病、心腦血管疾病、惡性腫瘤等疾病的治療上具有一定的優(yōu)勢。然而，隨著中藥注射劑在臨床的廣泛應用且中藥注射劑大多不是單一化學物質(zhì)，因此，必然會帶來一些傳統(tǒng)中藥制劑的安全性問題[1]。從臨床最常用的中藥注射劑清開靈、血栓通、葛根素到魚腥草、復方丹參、雙黃連、穿琥寧和參麥注射液等，其不良反應已較多見，發(fā)生的機率均較高[2'3]。中藥注射劑的不良反應主要為過敏反應，約占不良反應的80%，而類過敏反應(pseudoanaphylaxis，an即hylactoidaction)則占了過敏反應中的76%[4]。類過敏反應與過敏反應一樣，常伴有呼吸暫停、心臟驟停、低血壓、休克、血管擴張以及致死性反應。組胺是類過敏反應的主要釋放介質(zhì)，機體肥大細胞釋放的組胺進入體液或血液循環(huán)中能引起全身毛細血管擴張通透性升高、腺體分泌增加、平滑肌痙攣；作用于內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞引起末梢神經(jīng)剌激并能夠募集炎癥細胞，引起組織損傷和變態(tài)反應。當血中的組胺達到一定水平時將產(chǎn)生過敏性休克甚至死亡[5]。因此，組胺是過敏性疾病藥物治療的一個很好的靶分子，而且體內(nèi)組胺水平的升高可作為過敏性疾病確診的一項重要指標。目前對于組胺的檢測方法主要有(1)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)，該方法的優(yōu)點是快速、價廉、檢測設備簡單。ELISA測組胺的不足之處是特異性較低，且不易精確定量，不適合組胺含量低的生物樣品中組胺的測定。(2)熒光分光光度法，組胺的分子式為(:5119^，分子量為111，在化學上屬咪唑類，為含兩個雜原子的五元雜環(huán)。其分子結(jié)構中存在共軛體系，易于吸收光能。在紫外光照射下組胺分子吸收光子能量被激發(fā)后，可用熒光法測定其從激發(fā)態(tài)最低振動能級返回到基態(tài)時所發(fā)出的光?？梢允鼓承晒庠噭┡c組胺作用后增強組胺的熒光性來提高組胺檢測的靈敏度和選擇性。但熒光分光光度法的缺點是操作步驟繁瑣，而組胺半衰期極短[6]，過敏反應發(fā)生后幾分鐘就不能檢測到。因此，我們在將現(xiàn)代分析儀器用于檢測釋放的過敏介質(zhì)含量的時候，除了要考慮解決分析方法的快捷性及靈敏性，還要考慮如何使用化學衍生化的方法將組胺捕捉到。正是基于上述原因，本發(fā)明確定以"GC-MS用于中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的檢測方法"為內(nèi)容，建立痕量、精確的組胺檢測技術，為臨床、制藥企業(yè)解決中藥注射劑的安全性問題提供科學方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法。是一種用GC-MS檢測因中藥注射劑引起類過敏反應后，機體內(nèi)源性產(chǎn)生微量組胺的方法。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)1.反應液的配制由無水乙醇、三乙胺、9-methylanthracene、丙酮按一定比例組成，范圍在體積比為無水乙醇三乙胺9-methylanthracene溶液丙酮=30:6:1:8020:4:1:SO，其中9-methylanthracene的濃度為g/mL，優(yōu)選lllOiiL的無水乙醇240iiL三乙胺50iiL2iig/mL的9-methylanthracene:3.6mL的丙酮混合均勻而成；2.衍生化液的配制由衍生化試劑Ethylchloroformate(氯甲酸乙酯)按一定比例與氯仿混溶組成，具體而言為氯甲酸乙酯與氯仿按體積比為2:81:9組成；3.供試品溶液的衍生化制備在100iiL的血漿或細胞培養(yǎng)上清中加入1350iiL的反應液，于渦旋儀上渦旋3秒后加入550iiL衍生化液，連續(xù)渦旋10秒；加入3.5mL水再渦旋5秒，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取有機相，加入lOmg無水硫酸鈉脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用；4.過敏介質(zhì)釋放的檢測(1)色譜條件的確定選擇柱類型為極性色譜柱，進樣口進樣溫度14(TC，進樣2min后分流口吹掃流量40mL/min，壓力50.8Kpa，總流量lmL/min。其中起始溫度為120。C下停留2min，再以40°C/min的速度升至240°C，在該溫度下停留10min。(2)質(zhì)譜條件的確定采用SIM(選擇離子監(jiān)測)模式，以m/zl66的保留時間來定性過敏介質(zhì)，以m/zl92的保留時間來定性內(nèi)標9-methylanthracene(9-甲基蒽)，根據(jù)過敏介質(zhì)和內(nèi)標的峰面積按公式mi=fXAi/(As/ms)計算過敏介質(zhì)含量，其中f代表校正因子，Ai和As分別為供試品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，ms為加入內(nèi)標物質(zhì)的量；(3)過敏介質(zhì)定性過敏介質(zhì)為組胺衍生物，m/zl66的碎片峰為組胺衍生物的典型特征，在上述色譜條件下組胺衍生物的保留時間為13.5min。目前對于組胺的幾種檢測方法都有較明顯的局限性ELISA測組胺的不足之處是特異性較低，且不易精確定量，不適合組胺含量低的生物樣品中組胺的測定。柱前衍生反相高效液相色譜法(RP-HPLC):使用丹磺酰氯柱前衍生以反相高效液相色譜方法檢測，該方法的缺點在于樣品前處理的衍生化步驟太繁瑣，且噪音對結(jié)果的影響較大，檢測限亦較高，不易測到濃度低的樣品。熒光分光光度法的缺點是操作步驟繁瑣，而組胺半衰期極短，過敏反應發(fā)生后幾分鐘就不能檢測到。本發(fā)明提供的分析方法，優(yōu)勢在于對于血漿、細胞上清等生化樣品，只需采用一步衍生化的方法對少量的樣品(100i!L)就可快速完成樣品前處理，既克服了HPLC方法中繁瑣的多步衍生化步驟導致的系統(tǒng)誤差，且不需要消耗大量的樣品和前處理時間；本發(fā)明選用的衍生化試劑ECF是良好的胺衍生化試劑，較之熒光分光光度法的衍生化試劑OPA具有更高的穩(wěn)定性；本發(fā)明提供的分析方法，在0.0022iig/ml范圍線性良好，以更低廉的成本達到ELISA試劑盒所能測定的檢測限，比之ELISA的測定方法。本發(fā)明方法得到的色譜圖基線平穩(wěn)、峰形良好，方法簡便、快捷、靈敏、重現(xiàn)性好，本發(fā)明提供的分析方法還克服了ELISA測定常出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，為臨床、制藥企業(yè)解決中藥注射劑的安全性問題提供科學方法。說明書附圖圖1為組胺衍生物(13.5min)和內(nèi)標_9_甲基蒽(llmin)的GC圖譜。圖2為內(nèi)標質(zhì)譜圖。圖3為組胺衍生物質(zhì)譜圖。圖4為組胺線性關系考察。圖5為Beagle犬對注射液過敏反應情況。圖6為正常組、I組、II組P815細胞組胺分泌的測定。具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。實施例11.反應液的配制由lllOuL的無水乙醇、240uL三乙胺、50uL2ug/mL的9-methylanthracene、3.6mL的丙酮混合均勻而成；2.衍生化液的配制由衍生化試劑Ethylchloroformate(氯甲酸乙酯)按一定比例與氯仿混溶組成，具體而言為氯甲酸乙酯與氯仿按體積比為1:9組成；3.供試品溶液的衍生化制備在100iiL的血漿或細胞培養(yǎng)上清中加入1350yL的反應液，于渦旋儀上渦旋3s后加入550iiL衍生化液，連續(xù)渦旋10s;加入3.5mL水再渦旋5s;1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取有機相置一干凈瓶中，加入lOmg無水硫酸鈉脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用。4.確定色譜條件選擇柱類型為極性色譜柱Agilent(DB-WAX15X0.25mm內(nèi)徑，O.25iim膜厚)；不分流進樣方式以IPL自動進樣，取樣前進樣針先用溶劑氯仿清洗3次，并在進樣前在樣品瓶中取8iiL樣品潤洗三次，進樣后再用氯仿將進樣針清洗3次。進樣口進樣溫度140°C，進樣2min后分流口吹掃流量40mL/min，壓力50.8Kpa，總流量lmL/min。起始溫度為12(TC下停留2min，再以4(TC/min的速度升至240°C，在該溫度下停留10min。結(jié)果參見圖1:組胺衍生物(13.5min)和內(nèi)標-9-甲基蒽(llmin)。5.確定質(zhì)譜條件采用SIM選擇離子模式，以m/zl66的保留時間來定性組胺衍生物，以m/zl92的保留時間來定性內(nèi)標9-甲基蒽。根據(jù)組胺和內(nèi)標的峰面積按公式mi=fXAi/(As/ms)計算組胺含量，其中f代表校正因子，Ai和As分別為供試品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，ms為加入內(nèi)標物質(zhì)的量。參見圖2和圖3，圖2為內(nèi)標的質(zhì)譜圖，圖3為組胺衍生物質(zhì)譜圖。6.組胺衍生化碎片裂解過程解析由過敏反應所釋放的內(nèi)源性微量過敏介質(zhì)為組胺衍生物。5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>實施例21.反應液的配制由1000iiL的無水乙醇、200iiL三乙胺、50iiL2iig/mL的9-methylanthracene、2.5mL的丙酮混合均勻而成；即無水乙醇三乙胺9-methylanthracene溶液丙酮=30:6:i:8020:4:i:50，2.衍生化液的配制由衍生化試劑Ethylchloroformate(氯甲酸乙酯)按一定比例與氯仿混溶組成，具體而言為氯甲酸乙酯與氯仿按體積比為2:8組成；3.供試品溶液的衍生化制備在100iiL的血漿或細胞培養(yǎng)上清中加入1350yL的反應液，于渦旋儀上渦旋3s后加入550iiL衍生化液，連續(xù)渦旋10s;加入3.5mL水再渦旋5s;1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取有機相置一干凈瓶中，加入10mg無水硫酸鈉脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用。實施例31.線性關系考察線性關系是考察被測樣品濃度的變化與試樣結(jié)果成正比關系的程度，常用繪制標準曲線方法來確定。分別精密吸取組胺對照品貯備液(2iig/mL)0.01，0.1，0.25，0.5，1，2.5ml置10ml量瓶中，定容后各取100yL按一項下方法進行衍生化實驗，按二、三項下方法進行測定，以對照品濃度為橫坐標，對照品與內(nèi)標物峰面積比值為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，得回歸方程Y=1.0726X+0.031，r=0.9993，表明組胺在0.0022yg/ml范圍內(nèi)具有良好線性關系。參見圖4。2.重復性實驗取相同的供試品溶液，按二、三項下方法，重復進樣5次，依次測得對照品和內(nèi)標峰面積之比，計算RSD%=0.19%，參見表1。表1組胺重復性實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3.重現(xiàn)性實驗取同一批供試品溶液5份，按二、三項下方法測定，計算組胺含量，結(jié)果RSD:0.44%，參見表2，表明重現(xiàn)性良好。表2組胺重現(xiàn)性實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.穩(wěn)定性實驗取上述供試品溶液，分別于0，2，4，8，12小時進樣，依法測定，結(jié)果RSD=0.46%，表明供試品溶液在12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。參見表3。表3組胺穩(wěn)定性實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>5.加樣回收率實驗分別精密稱取已測定含量的同一批血漿樣品5份，各約lOOi!L，加入組胺對照品適量，精密加入內(nèi)標物溶液50L，按一項下方法衍生化處理，記錄色譜，結(jié)果組胺平均加樣回收率為100.6%，RSD:1.86%。結(jié)果見表4。表4組胺加樣回收率實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過上述方法學考察，確定本發(fā)明采用的組胺含量測定方法滿足于分析要求。實施例4本發(fā)明所述的組胺含量測定分析方法用于含不同濃度吐溫-80的中藥魚腥草注射液引起的Beagle犬血漿組胺釋放的測定1、實驗動物健康、雄性Beagle犬3只，體重12Kg，由浙江大學實驗動物中心提供。2、實驗材料魚腥草注射液(浙江某企業(yè)生產(chǎn))，吐溫_80(上海凌峰化學試劑有限公司)，9—methylanthracene、Ethylchloroformate(Sigma)，低溫中速離心機(曰立公司)，氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(GC-MS):Agilent，毛細管分析柱(DB-WAX15X0.25mm內(nèi)徑，0.25m膜厚)，所用試劑均為分析純。3、給藥方法3只Beagle犬，1只給予魚腥草注射液(浙江某企業(yè)生產(chǎn))2mL，1只給予含吐溫-800.5%的魚腥草注射液2mL;另一只作為陰性對照。4.觀察項目及方法1)動物一般行為學觀察觀察給藥后動物的行為，是否有顫抖、煩躁、昏厥等癥狀。2)血漿中組胺釋放量的測定給藥5分鐘后，于動物前肢靜脈取血2mL，全血置于含肝素鈉的采血管中。低溫離心機離心3000轉(zhuǎn)10分鐘，取上清100iiL加入1350yL的反應液，于渦旋儀上渦旋3后加入550iiL衍生化液，連續(xù)渦旋10s;加入3.5mL水再渦旋5s，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取有機相置一干凈瓶中，加入10mg無水硫酸鈉脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用。各組重復測定三次。5.結(jié)果陰性對照組血漿中未能檢測出組胺，給予浙江某企業(yè)生產(chǎn)的魚腥草注射液以及含吐溫-800.5%的魚腥草注射液的動物血漿中均能檢測出組胺。浙江某企業(yè)生產(chǎn)的魚腥草注射液與正常組比較，沒有顯著差異(P>0.05)，含吐溫-800.5%的魚腥草注射液與正常組相比，組胺釋放量顯著增加，差異顯著(P<0.01)，Beagle犬也呈現(xiàn)較明顯的過敏癥狀，四肢及面部出現(xiàn)大面積紅色如圖5及表5所示。參見圖5:a.陰性對照組；b.浙江某企業(yè)生產(chǎn)魚腥草注射液；c.含吐溫-800.5%的魚腥草注射液。表5血漿組胺含量測定結(jié)果(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例5本發(fā)明所述的組胺含量測定分析方法用于含不同濃度吐溫-80的中藥魚腥草注射液引起的P815細胞組胺分泌的測定1、材料和方法1、人肥大細胞(P815)購自上海中科院細胞庫，DMEM培養(yǎng)基為sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)為PAA公司產(chǎn)品。魚腥草注射液為浙江某企業(yè)生產(chǎn)，吐溫-80，9-methylanthracene、Ethylchloroformate(Sigma)，低溫中速離心機(日立公司)，氣質(zhì)聯(lián)用分析儀(GC-MS):Agilent，毛細管分析柱:(DB-WAX15X0.25mm內(nèi)徑，O.25ym膜厚)，所用試劑均為分析純。2、實驗分組(1)正常組空白對照組P815細胞10%FBSMEM培養(yǎng)液(2)I組P815細胞+浙江某企業(yè)生產(chǎn)魚腥草注射液(500mmol/L)(3)II組P815細胞+0.5%吐溫-80魚腥草注射液(500mmol/L)每組各三個復孔。3、細胞上清處理方法藥物作用30分鐘后，分別吸取上清100iiL加入1350yL的反應液，于渦旋儀上渦旋3s后加入550yL衍生化液，連續(xù)渦旋10s;加入3.5mL水再渦旋5s，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取有機相置一干凈瓶中，加入10mg無水硫酸鈉脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用。4、結(jié)果正常組、魚腥草注射液組以及含吐溫-80的魚腥草注射液組的細胞上清中均能檢測出組胺。I組、II組與正常組比較，均有顯著差異(P<0.01)。參見表6和圖6。表6P815細胞上清中組胺含量測定結(jié)果(X±S)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述實驗證明，所確定的含量測定方法能夠確定中藥注射劑引起類過敏反應后機體或細胞分泌微量組胺的含量。本發(fā)明涉及的參考文獻[1]梁進權，王寧生.國內(nèi)醫(yī)藥學期刊報道的中藥不良反應分析[J].中國中藥新藥，2000，25(1):56-58.[2]王輝，王育琴.62例中藥注射劑不良反應分析[J].藥物不良反應雜志，2004，6(6):417-418.[3]馬宏偉.46例中藥注射劑的不良反應分析[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2005，11(6):471.[4]DemolyP，LebelB，MessaadD，SahlaH，RongierM，DauresJP，GodardP，BousquetJ.Predictivecapacityofhistaminereleaseforthediagnosisofdrugallergy.Allergy,1999,54(5):500-506.[5]HeS，WallsAF.Theinductionofaprolongedincreaseinmicrovascularpermeabilitybyhumanmastcellchymase.EuropeanJournalofPharmacology,1998,352(1):91-98.[6]鄧婭，李桂明，蘭雁飛.蕁麻疹患者血中組胺的測定及其意義[J].中國皮膚性病學雜志，2003，17(1):16-17。權利要求一種檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法，其特征是通過以下步驟實現(xiàn)(1)反應液的配制由體積比為無水乙醇∶三乙胺∶9-甲基蒽溶液∶丙酮＝30∶6∶1∶80～20∶4∶1∶50混合均勻而成，其中9-甲基蒽的濃度為2μg/mL；(2)衍生化液的配制由氯甲酸乙酯∶氯仿按體積比為2∶8～1∶91組成；(3)供試品溶液的衍生化制備在100μL的血漿或細胞培養(yǎng)上清中加入1350μL的反應液，于渦旋儀上渦旋3秒后加入550μL衍生化液，連續(xù)渦旋10秒，加入3.5mL水再渦旋5秒，1500轉(zhuǎn)離心5分鐘，取有機相加入10mg無水硫酸鈉，脫水后，置于有內(nèi)襯管的GC自動采樣瓶中供分析用；(4)過敏介質(zhì)釋放的檢測A.色譜條件選擇極性色譜柱，進樣溫度140℃，進樣2min后分流口吹掃流量40mL/min，壓力50.8Kpa，總流量1mL/min；B.質(zhì)譜條件采用選擇離子監(jiān)測模式，以m/z166的保留時間來定性過敏介質(zhì)，以m/z192的保留時間來定性內(nèi)標9-甲基蒽，根據(jù)過敏介質(zhì)和內(nèi)標的峰面積按公式mi＝f×Ai/(As/ms)計算過敏介質(zhì)含量，其中f代表校正因子，Ai和As分別為供試品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，ms為加入內(nèi)標物質(zhì)的量；C.過敏介質(zhì)定性過敏介質(zhì)為組胺衍生物，m/z166的碎片峰為組胺衍生物的典型特征，在上述色譜條件下組胺衍生物的保留時間為13.5min。2.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法，其特征是步驟(1)反應液由lllOiiL無水乙醇240iiL三乙胺50iiL2yg/mL的9-甲基蒽3.6mL的丙酮混合均勻而成。3.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法，其特征是步驟A中起始溫度為12(TC下停留2min，再以40°C/min的速度升至240°C，在該溫度下停留lOmin。全文摘要本發(fā)明提供一種檢測中藥注射劑致過敏介質(zhì)釋放的方法，是一種對中藥注射劑能引起人體過敏反應的過敏介質(zhì)-組胺微量分泌的測定方法。該方法采用氯甲酸乙酯衍生化方法，用GC-MS檢測法對組胺進行定性定量分析，通過對測定時幾個重要參數(shù)的分析進行確定，測試結(jié)果表明，本發(fā)明方法得到的色譜圖基線平穩(wěn)、峰形良好，方法簡便、快捷、靈敏、重現(xiàn)性好，是一種有效檢測由中藥注射劑引起內(nèi)源性釋放組胺的方法。文檔編號G01N30/02GK101718754SQ200910155789公開日2010年6月2日申請日期2009年12月18日優(yōu)先權日2009年12月18日發(fā)明者周長新,張永勇,李連達,陳艷申請人:浙江大學