專利名稱：一種帶噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，是一種新型帶有噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方 法。
背景技術(shù)：
液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)是結(jié)合了色譜的分離性能及質(zhì)譜的定性性能 于一體的一種分析方法。LC-MS技術(shù)具有很高的選擇性、靈敏度、分離度和分析速度。近年 來，由于新技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，LC-MS成為現(xiàn)代分析手段中不可缺少的組成部分。已經(jīng) 成為小分子及復(fù)雜生物樣本中生物大分子定性、定量分析的有力工具。目前，應(yīng)用于LC-MS中的毛細(xì)管色譜柱的主要問題是盡管帶錐形噴頭的毛細(xì)管 色譜柱與先前直接使用空心毛細(xì)管噴頭比較，可使靈敏度顯著提高，但是這種色譜柱的噴 頭端一般沒有篩板，隨著噴頭部位的填料承受壓力的逐漸增大和使用時間的延長，靠近噴 頭的部位的空隙會被破碎的色譜填料堵塞，影響毛細(xì)管的使用性能，甚至使毛細(xì)管色譜柱 報廢。因此對噴頭處的改進(jìn)成為帶有噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱制備的主要問題。整體柱由單體、交聯(lián)劑和致孔劑等通過自由基引發(fā)聚合反應(yīng)，形成具有貫通孔及 微孔結(jié)構(gòu)的連續(xù)床固定相，具有制備過程簡便，聚合物結(jié)構(gòu)均勻，孔徑大小可通過反應(yīng)混合 物的比例進(jìn)行調(diào)整，色譜性能穩(wěn)定，通透性和重現(xiàn)性良好，無需制作篩板等優(yōu)點(diǎn)。另外，在采 用整體柱的分離過程中，由于流動相可直接流過貫通孔，反向柱壓低，故在常規(guī)的分析型高 效液相色譜以及毛細(xì)管色譜和毛細(xì)管電色譜分離氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)等生物大分子的過 程中廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種帶有噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱，其噴頭部分具有合成 聚合材料形成的篩板。作為篩板的聚合材料其理化性能和孔徑與所填填料色譜類型相近，可采用原位聚 合方法合成。如將毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行預(yù)處理，使其內(nèi)表面暴露硅羥基；再進(jìn)行雙官能團(tuán)試劑 的連接，根據(jù)需求選擇單體、交聯(lián)劑和致孔劑，在軟質(zhì)塑料套管中進(jìn)行聚合反應(yīng)。反應(yīng)后填 充球型填料顆粒即制得混合型毛細(xì)管色譜柱，根據(jù)需要也可在填充后于色譜柱尾端依照同 樣方法制備整體材料作為篩板。本發(fā)明的另一目的是提供混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，采用的技術(shù)方案包括 以下步驟(1)將毛細(xì)管進(jìn)行表面硅羥基的活化預(yù)處理，并將雙官能團(tuán)試劑連接在暴露的羥 基上；(2)將混合好的聚合物反應(yīng)液吸入毛細(xì)管中并控制適當(dāng)長度；(3)在一定溫度條件下引發(fā)聚合反應(yīng)，制備聚合材料篩板；(4)沖洗出未反應(yīng)的混合物，將剩余部分填充球型高效填料顆粒至所需要的長度；(5)在需要的情況下，用同樣方法根據(jù)需求制備毛細(xì)管色譜柱另一端的篩板；(6)將制備好的色譜柱壓實(shí)、老化，經(jīng)評價后在液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中用于生物大分子的 分離分析。一般來說，所用毛細(xì)管為內(nèi)徑為15 75μπκ噴頭的噴口內(nèi)徑彡15μπι，長度為 5 50cm的毛細(xì)管；預(yù)處理時可采用普通酸或堿進(jìn)行活化；制作篩板的聚合物反應(yīng)液長度 為0. 5 10cm，既可利用虹吸現(xiàn)象，也可以采用吸取的方式使反應(yīng)液上升到所要求的長度； 聚合反應(yīng)在室溫到70°C范圍加熱進(jìn)行；剩余的柱體中可填充粒徑< 10 μ m的球形或無定形 色譜填料。為便于操作，沖洗毛細(xì)管時均使用微量進(jìn)樣泵，并可以保證清洗溶液及洗脫溶液 流速的穩(wěn)定性。為提高操作的自動化水平，該混合型毛細(xì)管柱可以接在液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)自 動在線對生物大分子的分離分析。傳統(tǒng)的帶噴頭的毛細(xì)管填充色譜柱沒有篩板，噴頭部位僅靠填料的單純堆積形成 篩板，隨著球型填料顆粒在噴頭部分承受壓力的逐漸增大，噴頭的部位的空隙會容易被破 碎的色譜填料堵塞，影響毛細(xì)管的使用性能和壽命。發(fā)明使用的混合型毛細(xì)管色譜柱，其 內(nèi)合成的聚合材料具有良好的通透性，將噴端合成聚合材料形成篩板后再進(jìn)行球形顆粒填 料的填充，可以有效解決傳統(tǒng)毛細(xì)管填充柱沒有篩板的缺陷，又能使球型顆粒與填料接觸 的部位均勻分布壓力，解決了毛細(xì)管柱由于無篩板以及壓力過大填料破碎而導(dǎo)致堵塞的問 題。新制備的混合型色譜柱具有整體柱和填充柱的優(yōu)點(diǎn)，可在液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中達(dá)到對生 物大分子樣本的高效分離分析之目的。本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)1、操作簡便，適用范圍廣。本發(fā)明制備的混合型帶噴頭毛細(xì)管色譜柱適用于點(diǎn)噴 霧源的質(zhì)_聯(lián)用儀中，因而具有很廣泛的應(yīng)用前景；解決了在常規(guī)填充型毛細(xì)管色譜柱使 用中經(jīng)常遇到的堵塞或填料脫出等使得色譜柱壽命縮短的問題。2、成本較低，重現(xiàn)性好。本發(fā)明所使用的聚合試劑價廉易得，混合柱的整個合成過 程簡單、方便，經(jīng)色譜評價后顯示其重現(xiàn)性好。


圖1是本發(fā)明技術(shù)方案的聚合物反應(yīng)流程圖。(a)為經(jīng)過酸堿處理的毛細(xì)管內(nèi)壁 活性官能團(tuán)示意圖；(b)為雙官能團(tuán)試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(c)毛細(xì)管柱內(nèi)壁上連接了雙官能團(tuán) 試劑后的化學(xué)結(jié)構(gòu)；(d)聚合反應(yīng)單體化學(xué)結(jié)構(gòu)；(e)聚合后的在毛細(xì)管內(nèi)部形成的聚合物 化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。圖2制備的帶有噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱結(jié)構(gòu)示意圖。Monolithic part為聚合物整體柱噴頭部分(約Icm) ；packed part為高效球形 顆粒填料的填充部分(約IOcm) ；MS表示質(zhì)譜。圖3兩種色譜柱分別分離BSA樣本的質(zhì)譜圖。其中A圖為單純的帶噴頭的毛細(xì)管 填充柱分離BSA胰酶酶切混合物的色譜圖，而B圖為制備帶噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱分 離BSA胰酶酶切混合物的色譜圖，洗脫梯度0-60min，0-45% B ；60-65min,45% -100% B ；
465-75min 100% B ；75-80min, 100% -0% B ；80-95min,0% B0 每次進(jìn)行色譜分離前，首先用 100% A相平衡整個色譜系統(tǒng)30min，再進(jìn)行樣品的洗脫與分離。圖4帶噴頭混合型毛細(xì)管色譜柱分離酵母全蛋白胰酶酶切液的色譜圖。對復(fù)雜 樣本體系，所采用的洗脫梯度為 0-80min，0-45% B ；80-85min, 45 % -100% B ；85_95min 100% B ；95-100min, 100% -0% B ；100-115min,0% B。每次進(jìn)行色譜分離前，首先用 100% A相平衡整個色譜系統(tǒng)30min，再進(jìn)行樣品的洗脫與分離。圖5混合型毛細(xì)管色譜柱與傳統(tǒng)填充柱的柱壓變化趨勢圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1將0. IM HCl溶液用微量進(jìn)樣泵推入帶噴頭的毛細(xì)管柱，以1 μ L/min的流速沖洗 lh，然后用注射器注入超純水沖洗至流出液pH 7.0，再將0. IM NaOH溶液注入毛細(xì)管柱，以 1 μ L/min左右流速沖洗Ih，再用超純水洗至流出液pH 7. 0左右。將50%的γ -甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(Y -MAPS) /甲醇溶液(ν/ν)推入 毛細(xì)管中，末端用硅橡膠封口，噴端插入帶有Y-MAPS/甲醇溶液的套管中，密封，并將毛細(xì) 管浸入45°C水浴中加熱12h。然后將Y-MAPS溶液推出，用甲醇溶液沖洗毛細(xì)管柱，氮?dú)獯蹈?。用注射器快速將聚合物反?yīng)混合溶液推入毛細(xì)管柱中，封住末端，噴頭同樣插入 帶有聚合反應(yīng)液的套管中并密封，在70°C下孵育12h。反應(yīng)完成后用甲醇溶液沖洗毛細(xì)管， 氮?dú)獯蹈蓚溆?。稱取IOmg的高效ODS顆粒填料，加入2. 5ml甲醇中，并在底端放入磁力轉(zhuǎn)子，在磁 力攪拌器的攪拌下，利用氮?dú)馓畛浞椒▽DS混懸溶液壓入毛細(xì)管中，直至ODS顆粒充滿剩 余的柱體。實(shí)施例2在完全相同的試驗(yàn)條件下，用自動進(jìn)樣系統(tǒng)設(shè)置上樣量，比較填充柱和混合柱分 離標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶切液的效果，見附圖3。傳統(tǒng)的毛細(xì)管填充色譜柱分離分析BSA胰酶酶切溶 液，三次的覆蓋率均值為64. 36%,RSD%=2. 62 ；信號強(qiáng)度為9. 39E9，而混合毛細(xì)管色譜柱 的覆蓋率均值為58. 90%, RSD%= 0.81 ；信號強(qiáng)度為8. 81E9。實(shí)施例3分3批依照同樣的方法制備混合型色譜柱，分別依照相同的分離條件分析BSA胰 酶酶切溶液樣本，并記錄各個批次的峰容量，選取其中質(zhì)量數(shù)為1163.5的肽段，記錄其保 留時間及信號強(qiáng)度，作為考察色譜柱重現(xiàn)性的指標(biāo)。結(jié)果顯示3個批次的峰容量分別為27、 29,30 ；選取肽段的保留時間分別為44. 22,43. 59,44. Ilmin0而信號強(qiáng)度的范圍均在E8數(shù)量級。實(shí)施例4在使用帶噴頭混合型毛細(xì)管色譜柱的過程中，記錄使用時柱壓，并對柱壓力升高 隨時間的變化趨勢作圖，與同樣條件下的填充柱的比較。如圖5所示，混合柱的平均柱壓低 于相同進(jìn)樣次數(shù)后填充柱的柱壓，壓力變化范圍的SD%< 3.0%，兩種色譜柱均能顯示出 比較穩(wěn)定的柱壓，從壓力變化趨勢上看，傳統(tǒng)填充柱的壓力上升趨勢要大于混合柱柱壓上升趨勢。實(shí)施例5將從酵母樣本中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行胰酶酶切，將酶切樣本稀釋至蛋白質(zhì)濃度 0. 05pmol/μ L，在LCQ離子阱質(zhì)譜儀上分析并考察分析結(jié)果中酵母樣本的覆蓋率。當(dāng)上樣 量為500fmol時，填充柱所檢測到的肽段數(shù)量(三次重復(fù))分別為246、233、230，而混合柱 檢測到的肽段數(shù)量分別做三次重復(fù)得到的結(jié)果為244、248、235，結(jié)果顯示的重現(xiàn)性良好。實(shí)施例6用強(qiáng)陽離子交換色譜法預(yù)分離的鼠肝提取全蛋白胰酶酶切液，所收集的28個餾 分分別應(yīng)用混合型毛細(xì)管色譜柱與LCQ離子阱質(zhì)譜儀在線分離分析，使用70次后，混合型 毛細(xì)管色譜柱的柱仍能保持較低的柱壓(遠(yuǎn)小于40. Obar的額定壓力)和較高的柱效，表 明該混合型毛細(xì)管色譜柱具有較長的使用壽命。
權(quán)利要求
一種帶噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱，其特征為噴頭部分具有合成聚合材料形成的篩板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的混合型毛細(xì)管色譜柱，其特征為聚合材料的理化性能和孔徑 與所填填料色譜類型相近。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的混合型毛細(xì)管色譜柱，其特征為聚合材料由單體、交聯(lián)劑或 致孔劑，以原位聚合方法合成。
4.一種權(quán)利要求1所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征包括以下步驟(1)將毛細(xì)管進(jìn)行表面硅羥基的活化預(yù)處理，并將雙官能團(tuán)試劑連接在暴露的羥基上；(2)將混合好的聚合物反應(yīng)液吸入毛細(xì)管中并控制適當(dāng)長度；(3)在一定溫度條件下引發(fā)聚合反應(yīng)，制備聚合材料篩板；(4)沖洗出未反應(yīng)的混合物，將剩余部分填充球型高效填料顆粒至所需要的長度；(5)在需要的情況下，用同樣方法根據(jù)需求制備毛細(xì)管色譜柱另一端的篩板；(6)將制備好的色譜柱壓實(shí)、老化，經(jīng)評價后在液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中用于生物大分子的分離 分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征為所用毛細(xì)管內(nèi)徑 15 75 μ m、長度5 50cm、帶有噴頭且噴口內(nèi)徑彡15 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征為預(yù)處理時采用普通 酸或堿進(jìn)行活化。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征為聚合物反應(yīng)液長度 為0. 5 10cm，利用虹吸或吸取的方式吸入。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征為聚合反應(yīng)溫度在室 溫到70°C范圍。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征為沖洗毛細(xì)管時使用微量進(jìn)樣泵。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述混合型毛細(xì)管色譜柱的制備方法，其特征為剩余柱體中填充 粒徑< 10 μ m的球形或無定形色譜填料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種帶有噴頭的混合型毛細(xì)管色譜柱及其制備方法，將不同內(nèi)徑和長度的毛細(xì)管通過預(yù)處理后，根據(jù)需要在噴頭端合成不同長度的聚合物整體材料，合成后在毛細(xì)管剩余部分，采用勻漿裝柱法填充制備好的高效顆粒填料，并根據(jù)需求改變填充填料的種類、顆粒的大小、填充長度以及選擇在尾端合成同樣的材料，并在制備完成后用甲醇等試劑在高壓恒流泵體系中壓實(shí)、老化。制備好色譜柱在進(jìn)行柱效評價后，應(yīng)用于液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)中，可以有效解決傳統(tǒng)的帶噴頭填充柱由于柱噴頭隨著毛細(xì)管色譜柱使用過程中因壓力過大而導(dǎo)致部分填充顆粒填料破碎，在使用過程中脫出或堵塞毛細(xì)管色譜柱噴頭的問題。
文檔編號G01N30/56GK101923079SQ20091014757
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日
發(fā)明者張養(yǎng)軍, 謝晶鑫, 錢小紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所