專利名稱：一種體外熱原的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外熱原的測定方法。
背景技術(shù)：
所有能引起人體免疫反應(yīng)的物質(zhì)都被認(rèn)為是具有"致熱性"的，這些致熱性熱原包括外 原性致熱原和內(nèi)原性致熱原。外原性致熱原，如病原微生物，包括細(xì)菌、病毒、衣原體、真 菌等微生物及其產(chǎn)物，炎性滲出物，無菌性壞死組織，抗原抗體復(fù)合物等，其不能直接作用 于人體體溫調(diào)節(jié)中樞，需通過內(nèi)原性致熱原發(fā)揮作用，激活中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和單核 巨噬細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-1 (IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)和白細(xì)胞介素-6 (IL-6)等細(xì)胞因子，再通過血腦屏障直接作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，使體溫調(diào)定點(diǎn)上升，導(dǎo)致 產(chǎn)熱增加，散熱減少，體溫上升。
近年來，隨著醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)療器械、植入器械和新生物材料的應(yīng)用越 來越廣泛，這些材料要與人體組織或血液成分保持直接接觸，因此它們必須要有生物相容性 并且能滿足其特定的功能。因此對于這些材料組成、表面的結(jié)構(gòu)、材料的穩(wěn)定性以及材料表 面的污染情況的鑒定，尤其是對引起人體免疫應(yīng)激反應(yīng)的外原性致熱原鑒定具有重要的臨床 意義。
由醫(yī)療器械本身刺激引起免疫反應(yīng)是先天免疫防御的一部分，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒 細(xì)胞以及補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)動。免疫反應(yīng)的嚴(yán)重程度與免疫細(xì)胞釋放的生物介質(zhì)主要是細(xì)胞因子有關(guān)，有 可能引起發(fā)紅、腫脹和發(fā)熱等輕微的免疫反應(yīng)癥狀，也有可能導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。同時器械中某 些顆粒和釋放的金屬離子也會引起免疫反應(yīng)，導(dǎo)致植入器械的生物相容性降低，引起骨質(zhì)溶解、骨 質(zhì)吸收，器械松動、手術(shù)或植入手術(shù)失敗或反復(fù)進(jìn)行等。
同樣，免疫反應(yīng)也可能由醫(yī)療器械表面某些微生物成分引起，比如G—的細(xì)胞壁成分內(nèi) 毒素LPS、 G+的細(xì)胞壁成分磷壁質(zhì)酸LTA、真菌、原生動物和病毒的組成成分等，這些物 質(zhì)都被認(rèn)為是熱原物質(zhì)，均可被人體白細(xì)胞上的特定受體所識別引起諸如發(fā)熱反應(yīng)。并且很 多研究亦指出，醫(yī)療器械經(jīng)過滅菌以后仍有可能是具有"致熱性"的。比如在手術(shù)中，人體 組織器官直接與醫(yī)療器械接觸，如外科手術(shù)工具、皮下穿刺針以及某些情況下使用的長期 植入工具支架、動脈瘤夾和矯形裝置等，盡管這些醫(yī)療器械會經(jīng)過常規(guī)的滅菌消毒法消毒， 包括紅外輻射、高壓滅菌和氣體滅菌，但熱穩(wěn)定的熱原性物質(zhì)仍有可能留在器械的表面引起 免疫反應(yīng)導(dǎo)致組織器官損傷甚至引起器械植入的失敗。
因此，隨著醫(yī)療器械、植入器械和新生物材料等在人體的廣泛應(yīng)用，人體機(jī)體組織、血 液接觸到的熱原也越來越多，危害越來越大，但目前用于熱原測定的方法僅有以下幾種1、 將測定材料植入到兔的體內(nèi)，利用兔體溫的變化來顯示致熱反應(yīng)。缺點(diǎn)①兔對于 某些致熱性物質(zhì)的反應(yīng)與人體反應(yīng)的靈敏性并不一樣；②只能植入小型器械；③在植入的過 程中引起的組織器官損傷本身也可能引起免疫反應(yīng)；④動物價格昂貴、費(fèi)力、品種差異影響 顯著，詞養(yǎng)環(huán)境對于動物的體溫變化也有影響，通常會因?yàn)閯游矬w溫的一點(diǎn)點(diǎn)小小異常變化 而需要反復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證，同時該實(shí)驗(yàn)也沒有設(shè)陽性和陰性對照。因此不能準(zhǔn)確反映植入材料的 致熱性污染。
2、 通過給兔注射植入器械的漂洗液來分析，這種方法主要使用純凈水或油來漂洗植入 器械。缺點(diǎn)①提取物的效果可能與溫度、振蕩的劇烈程度和儲存條件有關(guān)；②熱原物質(zhì)的 溶解性難以確定；③不能確定溶液中黏附的熱原與原熱原是否具有不同的致敏特性。
3、 鱟試驗(yàn)法，原理為鱟的血淋巴一旦與內(nèi)毒素接觸就會凝固。缺點(diǎn)①僅適用于液體 樣本，因此只能分析材料的漂洗液；②通過測定LPS，僅能檢測常見的熱原物質(zhì)，無法檢測 來自G+或G—的其它熱原，如脂蛋白、肽聚糖和磷壁質(zhì)酸，或其它目前尚未知的化學(xué)熱原成 分。但可以肯定的是，大量可以引起細(xì)胞因子釋放進(jìn)而引發(fā)免疫反應(yīng)的微生物成分卻是存在 的。
綜上所述，被污染的植入器械表面的熱原在一定程度上是可以提取的，但對于留在其表 面的殘?jiān)蚱餍档谋旧?，已知的方法還不能將其檢測到。對于植入兔體內(nèi)的器械由于種屬的 差異等也存在很多弊端。因此，需要建立一種更加合適的方法來進(jìn)行醫(yī)療器械的熱原評價， 盡量避免人與兔的種屬差異、熱原提取的不完整性、遺漏器械表面的殘留物或其本身具有的 致熱性，以確?；颊叩陌踩?。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種操作簡便、靈敏高、重復(fù)性 好、全方位檢査熱原的體外熱原的檢測方法。 本發(fā)明解決技術(shù)問題釆用如下技術(shù)方案
本發(fā)明體外熱原的測定方法的特點(diǎn)是利用人靜脈血液和待檢樣品充分接觸反應(yīng)，反應(yīng)后 混合液體經(jīng)離心得無細(xì)胞上清液，再用Elisa法檢測無細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-1 e的含量； 在相同反應(yīng)條件下，通過人靜脈血和已知不同濃度的LPS充分混合反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來
定量待檢樣品所攜帶的熱原物質(zhì)。
本發(fā)明體外熱原的測定方法的特點(diǎn)是按如下步驟操作
a、采血采集健康者靜脈血液，將所采集的靜脈血液用肝素、乙二胺四乙酸鹽或枸櫞 酸鹽進(jìn)行抗凝獲得抗凝血液作為備用血樣；所述靜脈血液是來自于單個健康體，或來自于多個健康體的混合血液，所述混合血液之間血型相同、交叉配血試驗(yàn)紅細(xì)胞無凝集反應(yīng)；
b、 將待檢樣品放置到反應(yīng)容器中，向反應(yīng)容器中分別加入RPMI 1640溶液和備用血樣； 按體積比的備用血樣RPMI 1640溶液的比值A(chǔ)為1:1 100;
c、 設(shè)置多個與反應(yīng)容器相同類型的并聯(lián)容器，在所述并聯(lián)容器中分別加入用RPMI 1640 溶液稀釋成不同濃度的脂多糖LPS溶液，所述不同濃度的脂多糖LPS溶液，其最低濃度為 Opg/ml，最高濃度為100pg/ml，最低濃度和最高濃度之間設(shè)立3~8個脂多糖LPS濃度組， 在所述并聯(lián)容器中分別加入備用血樣；所述加入在各并聯(lián)容器中的備用血樣與脂多糖LPS溶 液的體積比為比值B;所述比值B與步驟b中的比值A(chǔ)相等；所述反應(yīng)容器和并聯(lián)容器均為 PVC膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂狀；
d、 封閉所述反應(yīng)容器和各并聯(lián)容器，于37'C、體積濃度為5。/。的C02的環(huán)境中溫育24 小時后，離心2分鐘，隨即取出所述反應(yīng)容器和各并聯(lián)容器中的無細(xì)胞上清液，對所述無細(xì) 胞上清液直接通過Elisa試劑盒測定人IL-l e的含量或保存于-80'C環(huán)境中待測；
e、 以各并聯(lián)容器中所測得的人il-i e的含量為縱坐標(biāo)，各人il-ie含量對應(yīng)的不同濃 度脂多糖LPS溶液為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再在所述標(biāo)準(zhǔn)曲線上標(biāo)定出以所述反應(yīng)容器中的 人il-i e的含量測定值為縱坐標(biāo)的測定點(diǎn)，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定點(diǎn)的橫坐標(biāo)值即為待檢樣品 的熱原含量。
本發(fā)明體外熱原測定方法的特點(diǎn)也在于所述步驟a中備用血樣的制備為
a、 按如下過程凍存血液
將所述抗凝血液在冰水中預(yù)冷15分鐘后，在不斷輕搖中向抗凝血液中添加二甲基亞砜 得混合液，所述混合液中的二甲基亞砜的終濃度按體積比為10%~15%;移取所述混合液至
經(jīng)冰水預(yù)冷的冷凍管中，將所述冷凍管置于冷凍室內(nèi)，以rc/分鐘降溫至-5'c得冷凍液，繼
續(xù)降溫使冷凍液達(dá)到結(jié)晶溫度-12'C，再將冷凍液以2'C/分鐘降溫至-4(TC,在-40'C的狀態(tài) 下放置120秒，再將冷凍液以10'C/分鐘的速度降至-120 'C完成冷凍，盛有冷凍液的冷凍管 儲存于液氮中；
b、 將儲存于液氮中的冷凍管內(nèi)冷凍液以37。C 4(TC解凍為液態(tài)得備用血樣。。 在人體中，熱原物質(zhì)在體內(nèi)被血液中的單核細(xì)胞和組織中的固有巨噬細(xì)胞所識別，這些
細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子控制免疫反應(yīng)，il-i e作為第一種對免疫刺激發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞因子的
釋放將導(dǎo)致體溫升高。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在
1、本發(fā)明使得人的血液和待檢樣本發(fā)生直接接觸，既可以檢查待檢樣品本身進(jìn)入人體 后是否具有致熱性，也可以檢查待檢樣本是否攜帶致熱性污染，從而避免器械植入的過程中引起的組織器官免疫性損傷。
2、 本發(fā)明可檢測的熱原物質(zhì)類型多，范圍廣，能夠檢測鱟試驗(yàn)法無法檢測的來自G+或 G—的其它熱原，如脂蛋白、肽聚糖和磷壁質(zhì)酸，或其它目前未知的化學(xué)熱原。
3、 本發(fā)明可以對測定熱原進(jìn)行定量，且靈敏性高、穩(wěn)定性好、干擾因素少和操作簡單。
4、 本發(fā)明不使用任何動物，只基于人體的發(fā)熱反應(yīng)，避免了人和動物的種屬差異。
5、 本發(fā)明的反應(yīng)容器可以制成任意形狀、任意大小，滿足不同形態(tài)類型的待檢樣品要求。
6、 本發(fā)明可在反應(yīng)容器中設(shè)立對陰性或陽性對照，并聯(lián)容器中放置已知不同濃度的LPS 溶液，通過繪制曲線避免實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差對數(shù)據(jù)結(jié)果的影響，同樣也可消除捐獻(xiàn)個體單核細(xì)胞 數(shù)目對釋放細(xì)胞因子絕對數(shù)量的影響。
7、 本發(fā)明使用冷凍靜脈血或不同健康個體的混合冷凍靜脈血，這對于那些不能總是獲 得新鮮靜脈血液供應(yīng)進(jìn)行分析的使用者來說非常適用，且凍存血液可進(jìn)行大批量生產(chǎn)。
8、 本發(fā)明可應(yīng)用于生產(chǎn)制造過程中或植入手術(shù)實(shí)施前，通過簡單的測試建立免疫質(zhì)量 控制來排除熱原物質(zhì)污染，并且對于生物材料本身引起的免疫反應(yīng)的防止亦具有一定的臨床 意義，比如可以防止因巨噬細(xì)胞被激活或細(xì)胞因子的釋放引起的骨質(zhì)重吸收而導(dǎo)致的髖關(guān)節(jié) 替代物松動等。
以下通過具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
具體實(shí)施方式
本實(shí)施例按如下步驟操作
1、 采血采集健康者靜脈血液，將所采集的靜脈血液用肝素、乙二胺四乙酸鹽或枸櫞 酸鹽進(jìn)行抗凝獲得抗凝血液；靜脈血液是來自于單個健康體，或來自于多個健康體的混合血 液，所述混合血液之間血型相同、交叉配血試驗(yàn)紅細(xì)胞無凝集反應(yīng)；
2、 將抗凝血液在冰水中預(yù)冷15分鐘后，在不斷輕搖中向抗凝血液中添加二甲基亞砜得 混合液，所述混合液中的二甲基亞砜的終濃度按體積比為10%~15%;移取所述混合液至經(jīng)
冰水預(yù)冷的冷凍管中，將所述冷凍管置于冷凍室內(nèi)，以rc/分鐘降溫至-5'c得冷凍液，繼續(xù)
降溫使冷凍液達(dá)到結(jié)晶溫度-12。C，再將冷凍液以2。C/分鐘降溫至-40。C，在-40'C的狀態(tài)下 放置120秒，再將冷凍液以10'C/分鐘的速度降至-120 'C完成冷凍，盛有冷凍液的冷凍管儲 存于液氮中；
3、 將儲存于液氮中的冷凍管內(nèi)冷凍液以37。C 40'C解凍為液態(tài)得備用血樣；
4、 將待檢樣品放置到反應(yīng)容器中，向反應(yīng)容器中分別加入RPMI 1640溶液和備用血樣；按體積比的備用血樣RPMI 1640溶液為1:1 100;
5、 設(shè)置多個與反應(yīng)容器相同類型的并聯(lián)容器，在所述并聯(lián)容器中分別加入用RPMI 1640 溶液稀釋成不同濃度的脂多糖LPS溶液，不同濃度的脂多糖LPS溶液，其最低濃度為Opg/ml， 最高濃度為100pg/ml，最低濃度和最高濃度之間設(shè)立3~8個脂多糖LPS濃度組，在并聯(lián)容 器中分別加入備用血樣；
具體實(shí)施中，步驟4中的備用血樣與RPMI 1640溶液的體積比必須與步驟5中備用血樣 與脂多糖LPS溶液的體積比相等；
反應(yīng)容器和并聯(lián)容器均用pvc膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂狀；
6、 封閉反應(yīng)容器和各并聯(lián)容器，于37'C、體積濃度為5%的<:02的環(huán)境中溫育24小時 后，離心2分鐘，隨即取出反應(yīng)容器和各并聯(lián)容器中的無細(xì)胞上清液，對無細(xì)胞上清液直接 通過Elisa試劑盒測定人IL-1 e的含量或保存于-80'C環(huán)境中待測；
7、 以各并聯(lián)容器中所測得的人il-i e的含量為縱坐標(biāo)，各人il-ie含量對應(yīng)的不同濃
度脂多糖LPS溶液為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再在標(biāo)準(zhǔn)曲線上標(biāo)定出以反應(yīng)容器中的人IL-1
e的含量測定值為縱坐標(biāo)的測定點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定點(diǎn)的橫坐標(biāo)值即為待檢樣品的熱原含 量。
1、 生產(chǎn)過程中的污染程度評價
致熱刺激物L(fēng)PS來自E.coli055:B5(Sigma)。溫育裝置選用PVC制成的并聯(lián)袋裝容器。 取鈦合金動脈瘤夾(濟(jì)南科惠康商貿(mào)有限公司)直接進(jìn)行體外熱原測定。Elisa法測定
IL-ie發(fā)現(xiàn)，這些動脈瘤夾的致熱性很低，大約只相當(dāng)于10pg 20pgLPS，約0.1 0,2EEU (內(nèi)毒素等價單位)，這比規(guī)定的植入性器械標(biāo)準(zhǔn)20 EEU要低得多，此結(jié)果同時也說明本
發(fā)明具有很高的靈敏度。
2、 檢測熱干燥處理后的鈦合金動脈瘤夾
將鈦合金動脈瘤夾(濟(jì)南科惠康商貿(mào)有限公司)首先在25(TC條件下熱干燥4小時，再向干 燥處理的動脈瘤夾上滴加1100 u L分別含有0 pg、 5 pg和40 pg從E.coli 055:B5中獲得 的LPS RPMI 1640溶液，靜置在反應(yīng)容器中；同時設(shè)立不同LPS濃度分別為O、 3、 5、 10、 20、 40、 80pg/ml的并聯(lián)容器組；2小時后在各反應(yīng)容器中再加入100 uL人冷凍血液，使 最終的反應(yīng)體系體積為1200 PL，忽略動脈瘤夾體積。37。C孵育24小時后，檢測溶液上清 IL-ie含量。結(jié)果顯示，在添加0pg/ml LPS的動脈瘤夾上沒有檢出IL-ie的釋放，添加有 5 pg和40 pg LPS/ml的動脈瘤夾所引起的IL-1 e的釋放與5 pg和40 pg LPS所引起的IL-1 e的釋放無差別。因此，制作動脈瘤夾(鈦合金)本身無熱原性，同時亦未攜帶熱原物質(zhì)。
權(quán)利要求
1、一種體外熱原的測定方法，其特征是利用人靜脈血液和待檢樣品充分接觸反應(yīng)，反應(yīng)后混合液體經(jīng)離心得無細(xì)胞上清液，再用Elisa法檢測無細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-1β的含量；在相同反應(yīng)條件下，通過人靜脈血和已知不同濃度的LPS充分混合反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量待檢樣品所攜帶的熱原物質(zhì)。
2、 根據(jù)權(quán)利要1所述的體外熱原的測定方法，其特征是按如下步驟操作a、 采血采集健康者靜脈血液，將所采集的靜脈血液用肝素、乙二胺四乙酸鹽或枸櫞 酸鹽進(jìn)行抗凝獲得抗凝血液作為備用血樣；所述靜脈血液是來自于單個健康體，或來自于多 個健康體的混合血液，所述混合血液之間血型相同、交叉配血試驗(yàn)紅細(xì)胞無凝集反應(yīng)；b、 將待檢樣品放置到反應(yīng)容器中，向反應(yīng)容器中分別加入RPMI 1640溶液和備用血樣； 按體積比的備用血樣RPMI 1640溶液的比值A(chǔ)為1:1 100;c、 設(shè)置多個與反應(yīng)容器相同類型的并聯(lián)容器，在所述并聯(lián)容器中分別加入用RPMI 1640 溶液稀釋成不同濃度的脂多糖LPS溶液，所述不同濃度的脂多糖LPS溶液，其最低濃度為 Opg/ml，最高濃度為100pg/ml，最低濃度和最高濃度之間設(shè)立3~8個脂多糖LPS濃度組， 在所述并聯(lián)容器中分別加入備用血樣；所述加入在各并聯(lián)容器中的備用血樣與脂多糖LPS溶 液的體積比為比值B;所述比值B與步驟b中的比值A(chǔ)相等；所述反應(yīng)容器和并聯(lián)容器均為 PVC膜制品，其膜表面呈微凸凹的刨砂狀；d、 封閉所述反應(yīng)容器和各并聯(lián)容器，于37t、體積濃度為5%的(202的環(huán)境中溫育24 小時后，離心2分鐘，隨即取出所述反應(yīng)容器和各并聯(lián)容器中的無細(xì)胞上清液，對所述無細(xì) 胞上清液直接通過Elisa試劑盒測定人IL-1 e的含量或保存于-8(TC環(huán)境中待測；e、以各并聯(lián)容器中所測得的人IL-1 e的含量為縱坐標(biāo)，各人IL-1 P含量對應(yīng)的不同濃度 脂多糖LPS溶液為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再在所述標(biāo)準(zhǔn)曲線上標(biāo)定出以所述反應(yīng)容器中的人 IL-1 P的含量測定值為縱坐標(biāo)的測定點(diǎn)，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線上測定點(diǎn)的橫坐標(biāo)值即為待檢樣品的 熱原含量。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的體外熱原的測定方法，其特征是所述步驟a中備用血樣的制備 為a、 按如下過程凍存血液將所述抗凝血液在冰水中預(yù)冷15分鐘后，在不斷輕搖中向抗凝血液中添加二甲基亞砜 得混合液，所述混合液中的二甲基亞砜的終濃度按體積比為10%~15%;移取所述混合液至經(jīng)冰水預(yù)冷的冷凍管中，將所述冷凍管置于冷凍室內(nèi)，以rc/分鐘降溫至-5'C得冷凍液，繼續(xù)降溫使冷凍液達(dá)到結(jié)晶溫度-12。C，再將冷凍液以2'C/分鐘降溫至-40'C，在-40'C的狀態(tài) 下放置120秒，再將冷凍液以10。C/分鐘的速度降至-120 。C完成冷凍，盛有冷凍液的冷凍管 儲存于液氮中；b、 將儲存于液氮中的冷凍管內(nèi)冷凍液以37。C 40。C解凍為液態(tài)得備用血樣。
全文摘要
本發(fā)明體外熱原的測定方法，其特征是利用人靜脈血和待檢樣品充分接觸反應(yīng)，反應(yīng)后混合液體經(jīng)離心得無細(xì)胞上清液，再用Elisa法檢測無細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-1β的含量；在相同反應(yīng)條件下，通過人靜脈血和已知不同濃度的LPS充分混合反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量待檢樣品所攜帶的熱原物質(zhì)。本發(fā)明方法操作簡便、靈敏高、重復(fù)性好、可全方位檢查熱原。
文檔編號G01N33/53GK101614734SQ200910144159
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月20日
發(fā)明者楊士友, 燕 梁, 闞紅衛(wèi) 申請人:安徽省藥物研究所